Name: Kırmızı kan hücreleri üzerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyon sayısal tespiti için Yöntemler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Öğrenin, akış sitometrisi ve spektrometri kullanarak kırmızı kan hücrelerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyonunu nicel olarak nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem geleneksel tanı testlerine güvenilir bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SZ ve DW VIROPHARMA sınırsız bir hibe alırsınız.

1.. Bromelain ile tedavi edilen kırmızı kan hücrelerinin hazırlanması <ol><li> Yıkayın 0-yazdığınız kırmızı kan hücreleri 1x PBS (2-5 dakika boyunca 664 x g santrifüj) ile 3x. </li><li> 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca% 0.5 bromelain çözeltisi iki hacim ile dolu eritrositlerde 1 hacim inkübe </li><li> Hücreler 1x PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Hücreler en az bir hafta için 1x PBS içinde 4 ° C&#39;de% 3 çözelti halinde saklanabilir. </li></ol> 2. FACS RBCs C3 ve C4 Birikme Analizi <ol><li> 56 ° C&#39;de 30 dakika boyunca ısıtılarak örnek hasta serumu gerekli miktarda (ya da diğer anti-RBC antikoru kaynağı) Isı-inaktif </li><li> (5 mM Veronal, 150 mM NaCl,% 0.05 jelatin pH 7.4) ve VBG + + bunları tekrar süspansiyon - VBG in bromelain ile tedavi edilen eritrosit üç kez yıkayın (VBG - + 2 mM MgCI2, 10 mM CaCl2) vermek üzere bir % 0.5 çözelti. </li><li> (F cam inci ile bir yuvarlak tabanlı bir plaka içine, aşağıdaki bileşenleri Pipetveya uygun karıştırma): 25 ul% 0.5 eritrosit, 37.5 ul taze AB serumu (kompleman kaynak) ve 37.5 ul 200 ug / ml anti-C5. Anti-C5 pahalı ve elde etmek zor olabilir. Bir C5-/C6-/C7- veya C8-eksik serum yerine AB serumu ve anti-C5 kullanarak düşünebiliriz. </li><li> 0,1-33% bir nihai konsantrasyona kadar oyuk başına hasta serum ekleyin. Doğru ısı ile inaktive edilmiş AB serum kullanılarak dolayı, oyuk başına serum konsantrasyon farkları için. De 150 ul / lik bir son hacim elde etmek için VBG + + ekleyin. ELISA folyo ile yakın plaka. </li><li> Çalkalarken 37 ° C &#39;de 1.5-2 saat inkübe edin. </li><li> PBS +% 0.5 BSA (2 dakika boyunca 664 x g&#39;de santrifüj) ile RBC üç kez yıkayın. </li><li> Ekle floresan etiketli anti-C3 ve anti-C4 monoklonal antikorlar ya da bunların fragmanları, Fab 1 ug / ml &#39;lik bir son konsantrasyona PBS +% 0.5 BSA içinde (aglütinasyon azaltmak için). Burada, özel anti-C3-Alexa Fluor 488 geliştirilmiş ve anti-C4-Alexa Fluor 647 monoklonal antikorlar kullanılır; thes seçimie floresan etiketler FACS ile C3 ve C4 arasında aynı anda algılanmasını sağlar. </li><li> Hafif sallama ile oda sıcaklığında 30-45 dakika kuluçkalayın. </li><li> PBS +% 0.5 BSA ile yıkayın eritrosit 3x. </li><li> Süspanse alyuvarlar 150 PBS +0.5% BSA ul ve (FACS analiz öncesi cam inci kurtulmak için), yeni bir plaka içine pipetle. </li><li> FACS analizi yapın. Bir dağılım komplo FSC-A çifti ayrı tek hücreleri; tek eritrositler üzerindeki kapıyı ayarlayın; floresan sinyallerin (örn. FITC ve APC) için uygun algılama kanalı seçin. </li><li> Medyan floresan yoğunluğunu kullanarak sonuçlarını ölçmek. </li></ol> Not: Bu, bir izotip kontrolü (örn., flüoresan anti-IL-6 fare IgG1 etiketli) kullanmak mümkündür. Bununla birlikte, hasta serumu (sadece AB serum olmadan) ya da bir tamamlayıcı kaynağı (ısı ile inaktive AB serum ve ısı ile inaktive edilmiş hasta serum olmadan) eritrositlerde inkübe edilmesi ile, örneğin, gerçek bir negatif kontrol dahil edilmesi önerilmektedir bird sonra aynı anti-C3-Alexa Fluor 488 ve anti-C4-Alexa Fluor 647 antikorları, bu leke. Bu farklı kontroller genellikle aynı, negatif sonuç veren, ancak bu, kırmızı kan hücrelerinin 12 durumunda, bir izotip kontrolü daha geçerli bir kontrol sağlar. 3. Kantitatif Hemolitik Deneyi <ol><li> 56 ° C &#39;de, numune 30 dakika ısıtılarak hasta serasının gerekli miktarda (ya da diğer anti-RBC antikoru kaynağı) Isı-inaktif </li><li> VBG ile yıkayın RBC&#39;ler 3x - ve bir kez VBG + + ile. </li><li> (Uygun karıştırma için) bir cam inci ile bir yuvarlak tabanlı bir plaka içine aşağıdaki bileşenleri Pipet: 35 ul% 3 kırmızı kan hücreleri, 25 ul taze AB serumu (tamamlayıcı kaynak) ve% 1-50 hastanın serum. Isı ile inaktive edilmiş AB serum kullanılarak serum konsantrasyon farkları için doğru. De 150 ul / lik bir son hacim elde etmek için VBG + + ekleyin. ELISA folyo ile yakın plaka. </li><li> Çalkalanarak 1.5-2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Cindirgenmiş yavaşlama (2-3 dakika içinde tam durdurmak için örneğin yavaşlama) ile 5 dakika boyunca 664 x g entrifuge plakası. </li><li> Dikkatli bir şekilde yeni bir mikrotiter plakası içinde 90 ul üstte yüzen madde pipet. Bu hava kabarcıkları önlemek ve sağlam hücrelerin yanınızda önlemek için bu aşamada önemlidir. </li><li> Uygun bir spektrofotometre içinde A414/690 ölçün. </li><li> Saf su ile bir örnek eritrosit lizis yüzdesi olarak liziz ifade eder. </li></ol>

<ol><li>Zeerleder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+haemolytic+anaemia+-+a+practical+guide+to+cope+with+a+diagnostic+and+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Neth.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge.</a> Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).</li>
<li>Reardon, J. E., Marques, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+evaluation+and+transfusion+support+of+patients+with+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia.</a> Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).</li>
<li>Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hemolytic+anemia+with+gel-based+immunohematology+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests.</a> Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+antiglobulin+test%3A+A+critical+step+in+the+evaluation+of+hemolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis.</a> Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).</li>
<li>Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+alloimmunization+from+an+African+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Red blood cell alloimmunization from an African perspective.</a> Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).</li>
<li>Packman, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+anemia+due+to+warm+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Hemolytic anemia due to warm autoantibodies.</a> Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).</li>
<li>Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+cold+agglutinin+mediated+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).</li>
<li>Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+antibody+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Cold antibody autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).</li>
<li>Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warm+autoimmune+hemolytic+anemia%3A+recent+progress+in+understanding+the+immunobiology+and+the+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).</li>
<li>Endoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+prewarming+conditions+for+Rh+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing.</a> Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).</li>
<li>Wouters, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1-esterase+inhibitor+concentrate+rescues+erythrocytes+from+complement-mediated+destruction+in+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).</li>
<li>Arndt, P. A., Garratty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Published+Methods+for+Analysis+of+Red+Cell+Antigen-Antibody+Reactions+by+Flow+Cytometry%2C+and+Approaches+for+Resolving+Problems+with+Red+Cell+Agglutination%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yukarıda bahsedilen deneyler, tekrarlanabilir ve sağlamdır. Bunlar, uygulaması kolay olan ve (a-96 oyuklu bir plaka içerisinde) aynı anda birçok örnekleri ile gerçekleştirmek mümkündür. Dolayısıyla, bu yaklaşım aynı zamanda bir ELISA robot sistemi, örneğin, tam otomatik bir sistem için uygun olacaktır. Şu anda kullanılan tekniklerin aksine, bu deneyler, nicel ve bu tamamlayıcı önleyicileri etkisinin çalışmaya örneğin yardımcı olacaktır. Ayrıca, yorumlama anda kullanılan deneyleri üzerinde bir gelişme o...

Kırmızı kan hücrelerinin (RBC) karşı antikorlar, alıcı eritrositlerde üzerinde mevcut olmayan bir antijeni eksprese eritrositlerde transfüzyonu ile indüklenebilir. Bu allo-antikorlar aşağıdaki transfüzyon 5 üzerinde aktivasyonu tamamlamak nedeniyle ciddi akut hemolitik transfüzyon reaksiyonlara neden olabilir. Oto-immün hemolitik anemi (AIHA), hastalar kendi RBCs karşı oto-antikorlar var. Bu durum, dalak ve / veya karaciğer 6,7 tamamlayıcı reseptörleri yoluyla komplemanı aktive edebilmek oto-antikorların durumda fagositoz on-Fcy reseptörleri ile eritrosit bağlı IgG etkileşimi yolu ile hücrelerin hızlandırılmış açıklık yol açar. Intravasküler hemoliz sonuçlanan fulminan kompleman aktivasyonu nadir fakat sıklıkla ölümcüldür. Hızlandırılmış akut anemi allo-veya otoantikorlar sonuçlar ve bu nedenle potansiyel olarak ölümcül bir dokunun hipoksi ile uyarılan ya da aracılık ettiği RBC imha tamamlar. AIHA in oto-antikorlar dependin, sıcak ve soğuk antikorlar sınıflandırılırBu eritrositlerde (sırasıyla 37 ° C ya da daha düşük) bağlanan en uygun sıcaklık g. Sıcak antikorlar IgG izotipinde genellikle ve IgM soğuk antikorlar 8,9 izotip. AIHA örneğin lymphoprolyferative bozukluğu, bağ dokusu hastalıkları, solid tümörler, enfeksiyonlar veya ilaçlara ikincil olabilir, ancak vakaların% 50 AIHA idiyopatik 9&#39;dur. Gammaglobulini (örneğin,. IgG ya da IgM) tespiti ve hastanın eritrosit için bağlı tamamlayıcı bir yarı niceliksel direkt antiglobulin (Coombs) testi (DAT) vasıtasıyla gerçekleştirilir. DAT olarak hasta eritrosit anti-IgG veya anti-C3d ile inkübe edilir. RBC aglutinasyon oluşumu bağlı tamamlayıcı bileşenleri veya IgG bağlanma mevcudiyetini gösterir. Allo-ya da hastanın serum içinde antikorların tespiti dolaylı antiglobulin testi (IAT) vasıtasıyla gerçekleştirilir. TBD de, bromelain ile muamele edilen deney eritrosit, hasta serumu ile kuluçkalandı, yıkandı ve daha sonra anti-h ile kuluçkalanırIgG Uman. Durumda eritrositler anti-RBC IgG hasta serum yapışmasına mevcut oluşacak ile duyarlı olmuştur. RbcS IgM antikorlar doğrudan hasta serumu ile bromelain ile muamele edilen deney eritrositlerde inkübasyon üzerine aglütinasyon yol açacaktır. Doğrudan Coombs testinde veya TBD de RBC aglütinasyon görsel bir test tüpü içinde göz ya da boyutu 1 ile aglutinant ve tek eritrositlerde ayıran küçük bir Sephadex kolonu üzerinde örnek yükleme yoluyla değerlendirilir. Eritrosit kompleman aktivasyonu ölçmek için sıkça kullanılan bir başka teknik, bromelain ile tedavi edilen eritrosit 10 (tamamlayıcı-aracılı) hemoliz indükleme hasta serumunun kapasitesi değerlendirilmiştir edildiği hemolitik deney 1 &#39;dir. Santrifüjlemeden sonra süpernatan nedeniyle serbest hemoglobin kırmızı lekeli ve renksiz kalırsa, negatif olarak kabul edilir zaman test pozitif olarak not edilir. Antiglobulin test ve hemolitik tahlil, hem yarısayısaldır yana en yüksek serum seyreltme testin hala pozitif olduğu belirtilmiştir. Antiglobulin test ve hemolitik tahlil rutin teşhis kullanılan sağlam tahliller vardır. Bu analizler semikantitatif ve kompleman inhibitörlerinin etkinliğini değerlendirirken gerektiğinde onlar, eritrositler kompleman aktivasyon ince farklılıklarını incelemek için uygun değildir tahlil gerçekleştiren teknisyen deneyimine bağlı olduğundan. Bu nedenle, biz bu yazıda anlatacağım RBCs, (otomatik-) antikorlar kompleman aktivasyonunu belirlemek için iki nicel analizler geliştirdi. İlk olarak, eritrositlerde kompleman C3 ve C4 aktivasyonu fragmanlarının birikimi (Şekil 1A) ölçülmesi için bir tahlil geliştirilmiştir. Bu deneyde, insan bromelain ile tedavi edilen tip-0 eritrosit ısı ile inaktive edilmiş hasta serumu (anti-RBC antikoru kaynağı), taze AB serumu (tamamlayıcı kaynak) ve anti-C5 monoklonal antikor (Eculizumab) ile inkübe edilir. Bu inc sırasındaHastanın serum anti-RBC antikorları harekete tamamlayacak içeriyorsa ubation, C3 ve C4 birikimi oluşacaktır. Alt kompleman aktivasyonu ile RBC liziz önlenmesi için bir bloke edici anti-C5 monoklonal antikoru ilave edilir. Daha sonra, eritrositlerde C3 ve C4 çökelme sırasıyla, C3 ve C4 ile reaksiyona floresan etiketli monoklonal antikorlar ya da Fab-fragmanları kullanılarak FACS ile tespit edilir. Tek RBCs üzerinde yolluk sonuçların güvenilirliğini sağlamak için önemlidir. Bu tekniğin avantajları, hasta bir malzeme küçük hacimli, kaskadının erken bir aşamasında aktive edilmeyi tamamlayan değerlendirilir gereklidir ve yöntem, yeniden üretilebilir ve nicel olduğu bulunur. C3 ve C4 hem de ideal bir diğer avantajı, bir ayrım klasik ve lektin yolak aktivasyonu (C3 ve C4 biriktirme her ikisi de) ve alternatif bir yol, aktive (sadece biriktirme C3) arasında yapılabilir olmasıdır. Yerine işlenmemiş RBCs bromelain-tedavi RBCs kullanımı gibi hassasiyetini artırırsöylüyorlar. İkinci deney şu anda kullanılan hemolitik tahlilinde (Şekil 1 B) dayanır. İnsan bromelain ile tedavi edilen tip-0 eritrosit ısı ile inaktive edilmiş hasta serumu (anti-RBC antikoru kaynağı) ve taze AB serumu (tamamlayıcı kaynak) ile inkübe edilir. Kompleman hasta anti-RBC antikorlar tarafından aktive edilirse, doza bağımlı RBC parçalama hemoglobin serbest yol, meydana gelecektir. Serbest hemoglobin miktarı sağlam ve parçalanmış eritrositlerde aşağı eğirme işleminden sonra süpernatan içinde 414 nm&#39;de absorbans ölçümü ile belirlenir. Absorbans meydana hemoliz miktarı ile ilişkilidir. Mevcut deneyde tersine, bu protokol, bir hedef, çok tekrarlanabilir ve değerlendirilirken kişiye bağımlı değildir hemoliz kantitatif değeri sağlar. Bu yöntemlerin bir uygulama AIHA kompleman önleyici olarak C1-inhibitörünün potansiyel kullanımı olduğu, 11 s &#39;de tarif edilmiştirtudied.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B-4287</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Fagron</td><td>0261</td><td>Bu kimyasal ilaç yönetmeliğine tabidir.</td></tr><tr><td>Sodyum Barbital</td><td>Fagron</td><td>0263</td><td>Bu kimyasal ilaç yönetmeliğine tabidir.</td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Merck</td><td>1.0470.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Merck</td><td>1.0238.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 488 amin reaktif boya</td><td>Pierce</td><td>46402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 650 amin reaktif boya</td><td>Pierce</td><td>62265</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&alfa; C5 (Eculizumab)</td><td>Alexion İlaç</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FACS (Canto)</td><td>BD</td><td></td><td>Uygun lazerlere sahip herhangi bir FACS kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Spektrofotometre (örn. Multiskan spektrumu)&nbsp;</td><td>Thermo Labsystems</td><td>1500-193</td><td>Doğru dalga boyu aralığına sahip herhangi bir spektrofotometre</td></tr> kullanılabilir <tr><td>BD FACSDiva yazılımı v 6.1.2</td><td>BD</td><td>643629</td><td>Herhangi bir uyumlu FACS analiz yazılımı kullanılabilir</td></tr><tr><td>Bromelain&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>K1121</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

kırmızı kan hücreleri üzerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyon sayısal tespiti için yöntemler

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Kırmızı kan hücrelerinin (RBC) karşı antikorlar, karaciğer (ekstravasküler hemoliz) ya da damar içi eritrositlerde lizise neden olarak tamamlayıcı reseptörleri ile hızlandırılmış bir boşlukla sonuçlanan kompleman aktivasyonu yol açabilir. Damar içi lizise neden - özellikle - kompleman aktivasyonu neden alloantikorları (oto-bağışıklık hemolitik anemi, AIHA görüldüğü gibi) (örn. ABO) veya RBC antijenlere karşı antikorlar, potansiyel olarak zararlı olan ve ölümcül olabilir 1. Şu anda, eritrositlerde nedeniyle on (otomatik)-antikorları için kompleman aktivasyonu RBC üzerinde veya RBC parçalama 1-4 yansıtan bir nonquantitative hemolitik deneyi ile tamamlayıcı çökelmesini yansıtan Coombs testi kullanılarak in vitro tayin edilmiştir. Ancak, kompleman inhibitörleri etkinliğini değerlendirmek için, nicel teknikleri olması zorunludur. Burada iki gibi teknikler tarif eder. İlk olarak, hasta serumunda antikorlar indüklenir kırmızı kan hücreleri üzerinde C3 ve C4 birikmesini tespit etmek için bir deney öncesi olduğusunulmuş. Bunun için, FACS analizi, floresan etiketli anti-C3 ya da anti-C4 antikorları ile birlikte kullanılır. Bundan sonra, bir miktar hemolitik tahlili tarif edilmektedir. Hasta serumu ile indüklenen Bu deneyde, tamamlayıcı aracılı hemoliz serbest hemoglobin spektrofotometrik tespit yapma kullanımı ölçülür. Bu tahlillerin ikisi de antikorun neden olduğu kompleman aktivasyon çalışmalar sağlayarak yeniden üretilebilen ve kantitatif bulunmaktadır.

Şekil 2A RBCs için temsili bir dağılım grafiği göstermektedir. FSC-A arsa (P1) - Tek RBCs için uygun yolluk de FSC-W görülebilir. RBCs genellikle% 95 civarında bu P1 kapısı (tek hücre) içinde kalan, ancak hasta serumunda yüksek oranda kullanıldığında anti-RBC IgM hasta serumunda mevcut olduğunu, özellikle bu,% 70-80 düşüş olabilir. C4 birikimi ile ilgili AIHA hasta serumunun etkisi için Örnek sonuçlar Şekil 2B&#39;de ve Şekil 2C&#39;de C3 bi...

Burada, kırmızı kan hücrelerine karşı antikorlar tarafından neden olunan kompleman aktivasyon ölçmek için iki tahlil tarif eder. Mevcut deneylerde üzerinde en büyük avantajı, nicel ve kolay yorumlamak doğasıdır.

Kırmızı kan hücreleri üzerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyon sayısal tespiti için Yöntemler

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hasta serumundaki kırmızı kan hücrelerine veya RBC'lere karşı olan antikorlar tarafından gerçekleştirilen kompleman aktivasyonunu değerlendirmektir. Bu, RBC yüzeyinde C4 ve C3 birikimini indüklemek için bloke edici anti C5 antikoru varlığında kırmızı kan hücrelerinin hasta serumu ile inkübe edilmesiyle sağlanır. Ardından, RBC'ler floresan işaretli anti C4 ve anti C3 antikorları ile boyanır ve RBC'ler üzerindeki kompleman birikim miktarı, alternatif bir yöntemle akış sitometrisi kullanılarak analiz edilebilir.Kompleman aracılı lizisi indüklemek için RBC'ler, anti C beş yokluğunda hasta serumu ile inkübe edilir. Lizize olan RBC'lerin yüzdesi, hücreler tarafından salınan hemoglobin miktarının spektrometri ile ölçülmesiyle belirlenebilir. Bu yeni tekniğin, rutin tanıda kullanılan hemoliz veya antiglobülin testi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, doğası gereği kantitatif olması ve kompleman aktivasyonundaki suboptimal farkları tespit edebilmemizdir.Laboratuvarımızdaki doktora sonrası araştırmacı Elizabeth Brook prosedürleri gösterecektir. İşleme, 0 tipindeki eritrositleri üç kez PBS ile yıkayarak başlayın, ardından pellet'i 0,5% Roma lane çözeltisi içinde bir ila iki oranında 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin; hücreleri üç kez daha yıkadıktan sonra, akış sitometrisi ile RBC'ler üzerindeki kompleman birikimini analiz etmek için taze PBS içinde %3'lük çözelti olarak 4 °C'de saklayın. İlk olarak, istenen miktardaki hasta serumunu 56 °C'de 30 dakika boyunca ısı ile inaktive edin; serum ısı işleminden geçerken brola ile işlenmiş eritrositleri Roal tamponu ile üç kez yıkayın ve son yıkamanın ardından işlemleri tamamlayın.Pelleti %0,5 dilüsyonda vbg plus plus içerisinde resüspanse edin. Ardından, bir cam boncuk üzerinde 25 µL %0,5 RBC, 37,5 µL taze AB serumu ve 37,5 µL 200 µg/mL anti C beş'i 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin. Daha sonra, gerekirse ısı devre dışı bırakılmış AB serumu ile tamamlayarak ve bir negatif kontrol de dahil ederek, ısı devre dışı bırakılmış hasta serumunu uygun konsantrasyonda her bir kuyucuğa ekleyin.Her kuyucuğun final hacmini 150 µL'ye tamamlamak için VBG plus plus kullanın ve ardından plakayı EIA folyosu ile kapatarak, çalkalama eşliğinde 37 °C'de bir buçuk ila iki saat inkübe edin. Hücreleri %0,5 BSA eklenmiş PBS ile üç kez yıkayın ve ardından hücreleri 1 µg/mL konsantrasyonundaki floresan işaretli anti-C3 ve anti-C4 monoklonal antikorları ile işaretleyin. Hücreleri oda sıcaklığında, hafif çalkalama ile 30 ila 45 dakika inkübe edin ve plaka üç kez yıkandıktan sonra RBC'leri kuyucuk başına 150 µL PBS artı %0,5 BSA içinde yeniden süspande edin.Hücre süspansiyonlarını yeni bir 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı plakaya aktarın ve ardından plakayı akış sitometresine yerleştirin; ileri saçılım (forward scatter) grafiğini kullanarak tek hücreleri dubletlerden ayırın. Tekil eritrositler (RBC) için kapılamayı (gate) ayarlayın ve ardından floresan sinyaller için uygun tespit kanalını seçin. Kantitatif hemolitik analiz için sonuçları medyan floresan yoğunluğunu kullanarak nicelendirin; hasta serumunu ısıtıp aktive edin ve az önce gösterildiği gibi romen ile işlem görmüş eritrositleri yıkayın.Ardından, az önce gösterildiği gibi RBC'leri kompleman ve hasta serumu ile inkübe ettikten sonra, ancak anti C beş eklemeden, hücreleri düşük yavaşlama ile 664 GS'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, sağlam hücreleri aktarmamaya ve hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat ederek, süpernatantın 90 µL'sini yeni bir mikrotitrasyon plakasına dikkatlice aktarın ve ardından bir spektrofotometrede 414 ila 690 nm'de absorbsiyonu ölçün. Hemolizi, saf suda inkübe edilen bir RBC örneğinin lizis yüzdesi olarak ifade edin.Bu ilk şekilde, brola ile işlem görmüş RBC'ler için temsili saçılım grafikleri gösterilmiştir; tekil RBC'ler için uygun kapılama (gating) burada görülebilir. Tipik olarak, RBC'lerin yaklaşık %95'i bu tek hücre kapılaması içinde yer alır. Bu histogramlarda, otoimmün hemolitik anemi veya aha etkisine ilişkin temsili sonuçlar verilmiştir.C4 ve C3 birikimi üzerinde hasta serumu beklendiği gibi gösterilmiştir; daha fazla hasta serumu, daha fazla kompleman birikimine yol açar. İlginç bir şekilde, kompleman birikimi iki belirgin pozitif pik şeklinde gerçekleşmektedir. RBC'ler tek bir donörden alındığı için bu durum muhtemelen RBC popülasyonundaki heterojenlikten kaynaklanmamaktadır; ancak bu fenomenin nedeni hala araştırılmaktadır. C4 ve C3 birikim analizlerinin tekrarlanabilirliğini göstermek için örneklerin medyan floresan yoğunlukları bu çizgi grafiklerde çizilmiştir.Çeşitli AH H hasta örneklerinin çökelmesindeki geniş varyasyona dikkat edin. Son olarak, RBC'lere karşı otoantikorlar içeren bir ahha hasta serum örneğinin hemolitik analizinden elde edilen veriler bu grafiklerde görülebilir. Serum örneği ile yapılan titrasyon, anti C five gibi uygun bir kompleman inhibitörü ile net ve tekrarlanabilir bir eğri vermektedir.Bu grafikte gösterildiği gibi, hemolitik sinyal titrasyonla giderilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, kırmızı kan hücresine özgü antikorlar tarafından gerçekleştirilen kompleman aktivasyonunun, C3 veya C4 birikiminin akış sitometrik analiziyle veya kantitatif hemolitik analizle nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

methods-for-quantitative-detection-antibody-induced-complement

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Klasik yolu antikor tarafından aktif ve hedef hücre parçalama içinde sona eriyor.

Ölçüm% 50 Hemolitik Kompleman (CH 50</subSerum) Faaliyet

Kaynak: Nagre, N. ve diğerleri. Alveolar makrofaj fagositoz ve farelerde bakteri temizlemesi. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, IgM ve komplement ile opsonize edilmiş koyun kırmızı kan hücreleri kullanılarak komplement reseptörü aracılı fagositozun değerlendirilmesini ve ardından fare makrofajları tarafından alınmasını göstermektedir. Fagositoz kapsamı, diaminoflorenin hemoglobin-katalize edilmiş oksidasyonuyla oluşan mavi kromojenik ürünün ölçülmesiyle ölçülür.

Opsonize Kırmızı Kan Hücreleri Kullanarak In Vitro Komplement Aracılı Fagositoz Modellenmesi

Bu video, serumda bulunan antikorların kompleman aracılı bakterisidal aktivitesini değerlendirmek için bir teknik göstermektedir. Bu yaklaşım, izole edilmiş serumu patojenik bakteriler ve eksojen kompleman proteinleri ile birleştirir. İnkübasyondan sonra, bakteriler bir agar plakası üzerinde büyütülür ve üretilen koloniler, serum bakterisidal titresini ölçmek için ölçülür.

Antikorların Kompleman Aracılı Bakterisidal Aktivitesi için Bir Serum Bakterisidal Testi

Video, spesifik antijenlere karşı serum antikorlarını tespit etmek için bir hemaglutinasyon inhibisyon testini göstermektedir. Test kuyusunda hemaglutinasyon inhibisyonunun ve kontrol kuyusunda hemaglutinasyonun doğrulanması, farklı görsel desenlerle elde edilir. Bu test, viroloji ve immünolojide bağışıklık tepkisini, aşı etkinliğini değerlendirmede ve viral enfeksiyonları incelemede çok önemli bir rol oynar.

Bir Hedef Antijene Karşı Serum Antikorlarını Tespit Etmek için Hemaglutinasyon İnhibisyonu Testi

Bu video, T hücresi efektör fonksiyonlarının antikor aracılı aktivasyonunu ölçen bir testi göstermektedir. HA eksprese eden transfekte edilmiş memeli hücrelerine influenza virüsü hemaglutinin (HA) spesifik monoklonal antikorunun eklenmesi, HA ile immün komplekslerin oluşumuna neden olur. Fc reseptörlerini ve bir lusiferaz raportörünü eksprese eden tasarlanmış T hücreleri eklendikten sonra, T hücreleri antikor-HA kompleksleri tarafından aktive edilir ve bu aktivasyon, bir lusiferaz substratı...

FA aracılı efektör fonksiyonlarının aktivasyonunun HA antikorları tarafından ölçülmesi

Bu video, anne sütü fagositleri tarafından antikora bağımlı hücresel fagositozu (ADCP) ölçmek için yapılan bir testi göstermektedir. Bir antijen-antikor kompleksine konjuge edilmiş floresan işaretli mikroküreler, fagositik lökositler tarafından antikora bağımlı hücresel fagositozu indüklemek için anne sütünden izole edilen bir hücre süspansiyonu ile birleştirilir. Hücreler ortak lökosit antijenine (CD45) karşı antikorlarla etiketlendikten sonra, ADCP aktivitesinin seviyesini gösteren mikroküre...

Fagositler tarafından Antikora Bağımlı Hücresel Fagositozu Ölçmek için İn Vitro Test

Monosit tek tabakalı test (MMA), Fcγ reseptörü (FcγR) aracılı fagositozu değerlendirmek için memeli periferik tam kanından elde edilen izole primer monositleri kullanan bir in vitro testtir.

Bir Monosit Tek tabakalı Testi Kullanımı Fcy reseptör aracılı fagositoz değerlendirin

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Bu yöntemin amacı, eritrosit CR1 yoğunluğu bilinen üç denek ile karşılaştırarak herhangi bir deneğin eritrositlerinde CR1 yoğunluğunu belirlemektir. Yöntem, deneklerin eritrositlerinin phycoerythrin (PE) kullanılarak güçlendirilmiş bir sisteme bağlı bir anti-CR1 monoklonal antikor ile immünoboya dan sonra akış sitometrisini kullanır.

Akış Sitometrisinin Kullanılmasında Eritrosit Kompleman Reseptörü 1 Ölçümü

Enükleasyonlu kırmızı kan hücrelerinin protein aktivasyonundaki dinamik değişiklikleri yakalamak, daha sonra değerlendirilmek üzere akut uyaranlardaki dinamik değişikliklerin korunması gibi metodolojik zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Sunulan protokol, ilgili protein değişikliklerinin korunmasını ve analizini ve müteakip tespitini sağlayan numune hazırlama ve boyama tekniklerini açıklar.

Kırmızı Kan Hücresi Proteinlerinde Dinamik Değişikliklerin İmmün Boyama Tabanlı Tespiti

Transfüzyon tıbbı ve immünolojide kırmızı hücre alloantikorlarının klinik önemini daha iyi tahmin etmeye yardımcı olmak için makrofajların kullanıldığı mevcut monosit-monotabaka testi (MMA) için iyileştirmeler ve güncellenmiş yöntemler geliştirdik. Bu test, monosit-makrofaj testi (M-MA) olarak adlandırılır.

Monosit-Makrofaj Testi Kullanılarak Kırmızı Kan Hücresi Antikor Öneminin Tahmini

Öğrenin, akış sitometrisi ve spektrometri kullanarak kırmızı kan hücrelerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyonunu nicel olarak nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem geleneksel tanı testlerine güvenilir bir alternatif sunar.

Kırmızı kan hücreleri üzerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyon sayısal tespiti için Yöntemler

Daha fazla video keşfet