Kırmızı kan hücreleri üzerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyon sayısal tespiti için Yöntemler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hasta serumundaki kırmızı kan hücrelerine veya RBC'lere karşı antikorların kompleman aktivasyonunu değerlendirmektir. Bu, RBC yüzeyinde C, dört ve C3 birikimini indüklemek için bloke edici anti C beş antikoru varlığında kırmızı kan hücrelerinin hasta serumu ile inkübe edilmesiyle elde edilir. Daha sonra, RBC'ler floresan olarak işaretlenmiş anti C dört ve anti C3 antikorları ile boyanır ve RBC'ler üzerindeki kompleman birikimi miktarı daha sonra alternatif bir yöntemde akış sitometrisi ile analiz edilebilir.

RBC'ler, kompleman aracılı lizizi indüklemek için anti C beş yokluğunda hasta serumu ile inkübe edilir. Parçalanmış eritrositlerin yüzdesi daha sonra hücreler tarafından salınan hemoglobin miktarının spektrometri ile ölçülmesiyle belirlenebilir. Bu yeni tekniğin, rutin teşhiste kullanılan hemoliz veya antiglobulin testi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, doğası gereği kantitatif olması ve kompleman aktivasyonundaki suboptimal farklılıkları tespit edebilmemizdir.

Laboratuvarımızdaki doktora sonrası Elizabeth Brook prosedürleri gösterecek: Sıfır tipli kırmızı kan hücrelerini PBS ile üç kez yıkayarak başlayın, daha sonra peleti% 0.5 Roma şeridi çözeltisinde% 0.5 Roma şerit çözeltisinde 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe edin, hücreleri üç kez daha yıkadıktan sonra, akış sitometrisi ile RBC'ler üzerindeki kompleman birikimini analiz etmek için dört santigrat derecede taze PBS'de% 3'lük bir çözelti olarak saklayın. İlk olarak, serum ısıl işlem görürken istenen miktarda hasta serumunu 56 santigrat derecede 30 dakika boyunca inaktive edin. Son yıkamadan sonra brola ile muamele edilmiş kırmızı kan hücrelerini Roal tamponunda üç kez yıkayın.

Resus, peleti vbg plus plus'ta %0,5'lik bir seyreltmeyle askıya alır. Daha sonra bir cam incide 25 mikrolitre% 0.5 RBC'ler, 37.5 mikrolitre taze AB serumu ve mililitre başına 37.5 mikrolitre 200 mikrogram, 96 kuyulu yuvarlak bir alt plakanın her bir oyuğuna beş anti C. Daha sonra, ısıyla inaktive edilmiş hasta serumunu her bir oyuğa uygun konsantrasyonda ekleyin, gerektiği gibi ısıyla inaktive edilmiş AB serumu ile destekleyin ve ayrıca negatif bir kontrol de dahil edin.

Her bir oyuğu 150 mikrolitrelik nihai hacme getirmek için VBG plus plus kullanın ve daha sonra inkübasyondan sonra çalkalanarak 37 santigrat derecede bir buçuk ila iki saat boyunca E IA folyo ile kaplanmış plakayı inkübe edin. Hücreleri% 0.5 BSA ile takviye edilmiş PBS ile üç kez yıkayın ve ardından hücreleri mililitre başına bir mikrogram ile etiketleyin. Floresan etiketli bir anti C3 ve anti C dört monoklonal antikor, hücreleri oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika boyunca hafifçe çalkalama ile inkübe eder ve daha sonra plakayı üç kez yıkadıktan sonra, RBC'leri 150 mikrolitre PBS ve% 0.5 BSA içinde yeniden süspanse eder.

Hücre süspansiyonlarını yeni bir 96 kuyucuklu yuvarlak alt plakaya iyi bir şekilde aktarın ve ardından plakayı akış sitometresine yükleyin, ileri bir saçılma grafiği kullanarak tek hücreleri çiftlerden ayırın. Kapıyı tek RBC'lere ayarlayın ve ardından floresan sinyalleri için uygun algılama kanalını seçin. Kantitatif hemolitik analiz için medyan floresan yoğunluğunu kullanarak sonuçları ölçün, hasta serumunu ısıtın ve aktive edin ve marul ile tedavi edilen RBC'leri az önce gösterildiği gibi yıkayın.

Daha sonra, RBC'leri az önce gösterildiği gibi kompleman ve hasta serumu ile inkübe ettikten sonra, ancak anti C beşi olmadan, hücreleri azaltılmış yavaşlama ile 664 GS'de beş dakika boyunca döndürün. Daha sonra, 90 mikrolitre süpernatanı dikkatlice yeni bir mikrotitre plakasına aktarın, sağlam hücreleri aktarmamaya ve hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçınmaya dikkat edin ve ardından bir spektrofotometre ekspresinde dört 14 ila altı 90'da emilimi ölçün. Saf suda inkübe edilmiş bir RBC numunesinin parçalanmasının bir yüzdesi olarak hemoliz.

Bu ilk şekilde, brola ile muamele edilmiş RBC'ler için temsili dağılım grafikleri, tek RBC'ler için uygun geçitin burada görülebileceği gösterilmiştir. Tipik olarak, RBC'lerin yaklaşık% 95'i bu tek hücre kapısı içinde yer alır. Bu histogramlarda otoimmün hemolitik anemi veya aha'nın etkisi için temsili sonuçlar.

C dört ve C3 birikiminde hasta serumu beklendiği gibi gösterilir, daha fazla hasta serumu daha fazla kompleman birikimine yol açar. İlginç bir şekilde, kompleman birikimi iki farklı pozitif zirvede meydana gelir. Bu muhtemelen RBC popülasyonundaki heterojenlikten kaynaklanmamaktadır, çünkü RBC'ler tek bir donörden alınmıştır, ancak bu fenomenin nedeni hala araştırılmaktadır, ancak numunelerin medyan floresan yoğunlukları bu çizgi grafiklerinde C dört ve C3 biriktirme testlerinin tekrarlanabilirliğini göstermek için çizilmiştir.

Çeşitli AH H hasta örneklerinin birikimindeki geniş varyasyona dikkat edin. Son olarak, RBC'lere karşı oto antikorlar içeren bir ahha hasta serum örneğinin hemolitik testinden elde edilen veriler bu grafiklerde gözlemlenebilir. Serum numunesi ile titrasyon, anti C beş gibi uygun bir kompleman inhibitörü ile net bir tekrarlanabilir eğri verir.

Hemolitik sinyal, bu grafikte gösterildiği gibi titre edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, C3 veya C dört birikiminin akış sitometrik analizi veya kantitatif hemolitik test ile kırmızı kan hücresine özgü antikorlar tarafından kompleman aktivasyonunun nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.