Kırmızı kan hücreleri üzerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyon sayısal tespiti için Yöntemler
29 Ocak 2014
Burada, kırmızı kan hücrelerine karşı antikorlar tarafından neden olunan kompleman aktivasyon ölçmek için iki tahlil tarif eder. Mevcut deneylerde üzerinde en büyük avantajı, nicel ve kolay yorumlamak doğasıdır.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, hasta serumundaki kırmızı kan hücrelerine veya RBC'lere karşı olan antikorlar tarafından gerçekleştirilen kompleman aktivasyonunu değerlendirmektir. Bu, RBC yüzeyinde C4 ve C3 birikimini indüklemek için bloke edici anti C5 antikoru varlığında kırmızı kan hücrelerinin hasta serumu ile inkübe edilmesiyle sağlanır. Ardından, RBC'ler floresan işaretli anti C4 ve anti C3 antikorları ile boyanır ve RBC'ler üzerindeki kompleman birikim miktarı, alternatif bir yöntemle akış sitometrisi kullanılarak analiz edilebilir.
Kompleman aracılı lizisi indüklemek için RBC'ler, anti C beş yokluğunda hasta serumu ile inkübe edilir. Lizize olan RBC'lerin yüzdesi, hücreler tarafından salınan hemoglobin miktarının spektrometri ile ölçülmesiyle belirlenebilir. Bu yeni tekniğin, rutin tanıda kullanılan hemoliz veya antiglobülin testi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, doğası gereği kantitatif olması ve kompleman aktivasyonundaki suboptimal farkları tespit edebilmemizdir.
Laboratuvarımızdaki doktora sonrası araştırmacı Elizabeth Brook prosedürleri gösterecektir. İşleme, 0 tipindeki eritrositleri üç kez PBS ile yıkayarak başlayın, ardından pellet'i 0,5% Roma lane çözeltisi içinde bir ila iki oranında 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin; hücreleri üç kez daha yıkadıktan sonra, akış sitometrisi ile RBC'ler üzerindeki kompleman birikimini analiz etmek için taze PBS içinde %3'lük çözelti olarak 4 °C'de saklayın. İlk olarak, istenen miktardaki hasta serumunu 56 °C'de 30 dakika boyunca ısı ile inaktive edin; serum ısı işleminden geçerken brola ile işlenmiş eritrositleri Roal tamponu ile üç kez yıkayın ve son yıkamanın ardından işlemleri tamamlayın.
Pelleti %0,5 dilüsyonda vbg plus plus içerisinde resüspanse edin. Ardından, bir cam boncuk üzerinde 25 µL %0,5 RBC, 37,5 µL taze AB serumu ve 37,5 µL 200 µg/mL anti C beş'i 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin. Daha sonra, gerekirse ısı devre dışı bırakılmış AB serumu ile tamamlayarak ve bir negatif kontrol de dahil ederek, ısı devre dışı bırakılmış hasta serumunu uygun konsantrasyonda her bir kuyucuğa ekleyin.
Her kuyucuğun final hacmini 150 µL'ye tamamlamak için VBG plus plus kullanın ve ardından plakayı EIA folyosu ile kapatarak, çalkalama eşliğinde 37 °C'de bir buçuk ila iki saat inkübe edin. Hücreleri %0,5 BSA eklenmiş PBS ile üç kez yıkayın ve ardından hücreleri 1 µg/mL konsantrasyonundaki floresan işaretli anti-C3 ve anti-C4 monoklonal antikorları ile işaretleyin. Hücreleri oda sıcaklığında, hafif çalkalama ile 30 ila 45 dakika inkübe edin ve plaka üç kez yıkandıktan sonra RBC'leri kuyucuk başına 150 µL PBS artı %0,5 BSA içinde yeniden süspande edin.
Hücre süspansiyonlarını yeni bir 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı plakaya aktarın ve ardından plakayı akış sitometresine yerleştirin; ileri saçılım (forward scatter) grafiğini kullanarak tek hücreleri dubletlerden ayırın. Tekil eritrositler (RBC) için kapılamayı (gate) ayarlayın ve ardından floresan sinyaller için uygun tespit kanalını seçin. Kantitatif hemolitik analiz için sonuçları medyan floresan yoğunluğunu kullanarak nicelendirin; hasta serumunu ısıtıp aktive edin ve az önce gösterildiği gibi romen ile işlem görmüş eritrositleri yıkayın.
Ardından, az önce gösterildiği gibi RBC'leri kompleman ve hasta serumu ile inkübe ettikten sonra, ancak anti C beş eklemeden, hücreleri düşük yavaşlama ile 664 GS'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, sağlam hücreleri aktarmamaya ve hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat ederek, süpernatantın 90 µL'sini yeni bir mikrotitrasyon plakasına dikkatlice aktarın ve ardından bir spektrofotometrede 414 ila 690 nm'de absorbsiyonu ölçün. Hemolizi, saf suda inkübe edilen bir RBC örneğinin lizis yüzdesi olarak ifade edin.
Bu ilk şekilde, brola ile işlem görmüş RBC'ler için temsili saçılım grafikleri gösterilmiştir; tekil RBC'ler için uygun kapılama (gating) burada görülebilir. Tipik olarak, RBC'lerin yaklaşık %95'i bu tek hücre kapılaması içinde yer alır. Bu histogramlarda, otoimmün hemolitik anemi veya aha etkisine ilişkin temsili sonuçlar verilmiştir.
C4 ve C3 birikimi üzerinde hasta serumu beklendiği gibi gösterilmiştir; daha fazla hasta serumu, daha fazla kompleman birikimine yol açar. İlginç bir şekilde, kompleman birikimi iki belirgin pozitif pik şeklinde gerçekleşmektedir. RBC'ler tek bir donörden alındığı için bu durum muhtemelen RBC popülasyonundaki heterojenlikten kaynaklanmamaktadır; ancak bu fenomenin nedeni hala araştırılmaktadır. C4 ve C3 birikim analizlerinin tekrarlanabilirliğini göstermek için örneklerin medyan floresan yoğunlukları bu çizgi grafiklerde çizilmiştir.
Çeşitli AH H hasta örneklerinin çökelmesindeki geniş varyasyona dikkat edin. Son olarak, RBC'lere karşı otoantikorlar içeren bir ahha hasta serum örneğinin hemolitik analizinden elde edilen veriler bu grafiklerde görülebilir. Serum örneği ile yapılan titrasyon, anti C five gibi uygun bir kompleman inhibitörü ile net ve tekrarlanabilir bir eğri vermektedir.
Bu grafikte gösterildiği gibi, hemolitik sinyal titrasyonla giderilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, kırmızı kan hücresine özgü antikorlar tarafından gerçekleştirilen kompleman aktivasyonunun, C3 veya C4 birikiminin akış sitometrik analiziyle veya kantitatif hemolitik analizle nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kırmızı kan hücrelerine (RBC'ler) karşı antikorların indüklediği kompleman aktivasyonunu ölçmek için kullanılan iki deneyi tanımlamaktadır. Nicel olan ve yorumlanması kolay olan bu deneyler, mevcut yöntemlere göre avantajlar sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Hematoloji
- Akış Sitometrisi
Arka Plan
- Kompleman aktivasyonu, bağışıklık yanıtlarında kritik bir öneme sahiptir.
- Alyuvarlara karşı gelişen antikorlar çeşitli klinik durumlara yol açabilir.
- Mevcut analizlerde kantitatif hassasiyet eksikliği olabilir.
- Yeni yöntemler, kompleman aktivasyonunun tespitini iyileştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Eritrositlere karşı antikorlar tarafından gerçekleştirilen kompleman aktivasyonunu değerlendirmek.
- Sonuçların daha iyi yorumlanabilmesi için kantitatif bir analiz yöntemi geliştirmek.
- Yeni teknikleri mevcut tanı yöntemleriyle karşılaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- RBC'lerin hasta serumu ve bloklayıcı antikorlarla inkübasyonu.
- RBC'lerin floresan işaretli antikorlarla boyanması.
- Kompleman birikiminin akış sitometrisi ile analizi.
- RBC lizisini belirlemek için hemoglobin salınımının ölçümü.
Ana Sonuçlar
- Yeni analizler, kompleman aktivasyonu hakkında kantitatif veriler sağlar.
- Aktivasyondaki optimal olmayan farklılıklar tespit edilebilir.
- Sonuçlar, geleneksel yöntemlere kıyasla artırılmış hassasiyet göstermektedir.
- Akış sitometrisi analizi, detaylı yorumlama imkanı sunar.
Sonuçlar
- Yeni analizler, kompleman aktivasyonunun anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Mevcut tanı testlerine güvenilir bir alternatif sunmaktadırlar.
- Gelecekteki uygulamalar, hasta tanısını ve tedavisini iyileştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Kırmızı kan hücrelerinde antikorla indüklenen kompleman aktivasyonunun kantitatif değerlendirmesi, kompleman inhibitör etkinliğinin değerlendirilmesi ve otoimmün ile alloimmün bozukluklardaki hemolitik mekanizmaların anlaşılması açısından kritik öneme sahiptir. Açıklanan akış sitometrisi ve spektrofotometrik analizler, kompleman aktivasyonundaki suboptimal farkların tespitine olanak tanıyan tekrarlanabilir ve kantitatif sonuçlar sağlayarak, terapötik geliştirmedeki mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Bu yöntemler, kalitatif gözlemleri preklinik ve klinik karar verme süreçleri için ölçülebilir ve aktarılabilir biyobelirteçlere dönüştürerek, hedef doğrulamadaki öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: RBC'ler üzerinde otoantikorlar veya alloantikorlar tarafından indüklenen kompleman birikimini (C3/C4) nicelendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Antikor aracılı efektör aktivitenin doğrudan ölçümü yoluyla fonksiyonel hedef doğrulaması sağlayarak hedef seçimindeki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Öngörücü Değer: Kompleman aktivasyon potansiyeli hakkında nicel veriler üreterek portföy önceliklendirmesini destekler ve kompleman modüle eden terapötikler için karar verme süreçlerini (go/no-go) bilgilendirir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Kompleman inhibitörlerinin veya terapötik antikorların yüksek kapasiteli taraması için uygun, standartlaştırılmış, kantitatif çıktılar (medyan floresans yoğunluğu, hemoglobin salınımı) üretir.
- Tekrarlanabilirlik: Hasta serum örnekleri arasında düşük değişkenlik göstererek, güvenilir bileşik değerlendirmesine ve laboratuvarlar arası standardizasyona olanak tanır.
- Platform Kullanışlılığı: Keşif süreçlerinde kompleman bağımlı biyolojik aktiviteyi ölçmek için yeniden kullanılabilir analizler oluşturmak amacıyla erişilebilir cihazlar (akış sitometresi, spektrofotometre) kullanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalık İlişkisi: Hedef etkileşimini fonksiyonel kompleman aktivasyonuna bağlayarak, otoimmün hemolitik anemi (AIHA) ve alloimmün hemolizdeki patofizyolojik mekanizmaları modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Klinik hemolitik potansiyel ile korele olan kantitatif biyobelirteçler (C3/C4 depozisyonu, hemoliz) sağlayarak, keşif aşaması ile preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
- Riskten Arındırılmış İlerleme: Kompleman aracılı lizisi nicelleştirerek mekanistik risklerin azaltılmasını sağlar; preklinik çalışmalarda güvenlik değerlendirmelerine ve doz-yanıt modellemesine veri sağlar.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analizler, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik güvenlik değerlendirmesine kadar olan keşif sürecine entegre olarak, biyolojik risk azaltma ve terapötik indeks değerlendirmesine veri sağlayan kantitatif kompleman aktivasyon okumaları sunar.
- Keşif Biyolojisi: Antikorla tetiklenen kompleman aktivasyon yollarını nicelleştirerek hipotez testlerini destekler ve immünomodülatör adayların etki mekanizmasını aydınlatır.
- Tarama: Test bileşiklerinin veya serum örneklerinin güvenilir şekilde karşılaştırılmasına olanak tanıyan, analize hazır, kantitatif çıktılar (florasan yoğunluğu, spektrofotometrik hemoliz) sunar.
- Analitik: Doz-yanıt çalışmalarında istatistiksel analizi ve koşullar arası karşılaştırmayı kolaylaştıran ölçülebilir okumalar (medyan florasan yoğunluğu, hemoglobin salınımı) üretir.
- Translasyonel Araştırma: AIHA ve transfüzyon ortamlarında görülen kompleman aktivasyonunu yansıtan hastalıkla ilişkili çıktılar aracılığıyla preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Antikor terapötikleri, biyobenzerler ve kompleman inhibitörleri genelinde komplemana bağımlı aktiviteyi değerlendirmek için ölçeklenebilir ve standardize edilmiş bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kalitatif kompleman analizlerini kantitatif ve aktarılabilir ölçümlere dönüştürerek hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: RBC hazırlama, serum inkübasyonu ve akış sitometrisi veya spektrometri yoluyla tespit için tanımlanmış protokoller aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Kompleman aktivasyonuna yol açan risklerin erken tespitini sağlayarak sermaye verimliliğini artırır ve immünomodülatör programlarda geç aşama başarısızlık riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Kompleman aktivasyon potansiyelini nicelleştirerek risk odaklı önceliklendirmeye veri sağlar ve terapötik geliştirme süreçlerinde objektif ilerleme kararlarını destekler.
Uygulama Hususları
- Kompleman birikimi ve hemoliz ölçümlerinin doğru şekilde gerçekleştirilebilmesi için immünoloji, akış sitometrisi ve spektrofotometrik analiz uygulamalarında uzmanlık gereklidir.
- Uygun floresan kanallara sahip akış sitometrelerine ve 414/690 nm'de hemoglobin miktar tayini için spektrofotometrelere erişime bağlıdır.
- Kullanıcılar ve merkezler arasında analiz tutarlılığını sağlamak için RBC hazırlığının (örneğin; sıfır tipi, bromelin işlem görmüş) ve serum ısı inaktivasyonunun standardizasyonu gereklidir.
- İnsan AB serumu dışındaki farklı RBC türlerine, antijen yoğunluklarına veya kompleman kaynaklarına uygulandığında adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, hemoliz miktar tayini doğruluğunu etkileyebilecek hücre taşınmasını ve hava kabarcıklarını önlemek için süpernatantın dikkatli transfer edilmesi gerekliliği yer alır.
