살아있는 초파리 날개 상상 디스크에서 사이톤군에 의해 매개되는 세포-세포 접촉을 평가하기 위한 GFP 상보 기반 이중 발현 시스템

따라서 우리의 연구는 조직에서 멀리 떨어진 세포가 서로 어떻게 소통하는지 이해하는 데 중점을 둡니다. 우리는 초파리 날개 상상 디스크를 모델 시스템으로 사용하여 시티딘이 어떻게 형성되는지, 어떻게 기능하는지, 조직 성장을 국소적으로 제어하는 데 어떤 역할을 하는지 이해하려고 노력하고 있습니다. 연구에 따르면 성장 인자는 표적 세포에 전달되기 위해 세포탐이라고 하는 액틴 기반 신호 송상체증과 같은 특수한 세포 투사를 통해 이동하는 경우가 많습니다.

사이톤암은 고정 프로토콜에 의해 쉽게 파괴되는 매우 얇고 깨지기 쉬운 구조입니다. 이를 관찰하려면 발현된 형광 태그 단백질을 사용한 전용 라이브 이미징 접근법을 사용해야 합니다. 이로 인해 이를 조사하는 데 사용할 수 있는 도구와 접근 방식이 크게 제한됩니다.

우리는 세포 형성에 관여하는 Slik이라는 단백질 키나아제를 확인했습니다. 날개 상상 디스크의 한 경막외층에서 Slik의 발현은 디스크 내강을 가로지르는 세포톤의 형성을 유발하고 인접한 상피층에서 세포의 증식을 자극합니다. 앞으로 우리는 세포 톤 형성을 촉진하기 위해 Slik의 하류에 작용하는 단백질을 확인하고, 천공을 촉진하기 위해 이 세포 톤을 통해 전달되는 리간드를 확인하고, 조직 성장을 제어하는 데 있어 이 메커니즘의 생리학적 중요성을 더 잘 이해하고자 합니다.

시작하려면 가위를 사용하여 8웰 스트립에서 개별 웰을 자른 다음 각 웰을 반으로 자릅니다. 각 절반의 한쪽에서 보호 지지대를 제거하고 스페이서를 현미경 슬라이드에 붙이고 약간 간격을 두어 디스크 배치를 위한 보호된 중앙 공간을 만듭니다. 유전적 교배 및 섭씨 25도에서 배양 후 사육관에서 방황하는 3령 유충을 선택합니다.

해부 현미경으로 유충을 실리콘 코팅 페트리 접시의 살아있는 이미징 매체 한 방울로 옮깁니다. 두 개의 해부 겸자를 사용하여 한 쌍의 겸자로 전방에서 약 1/3 몸 길이의 유충을 꼬집어 해부를 시작합니다. 두 번째 쌍으로 몸을 첫 번째 지점 바로 뒤쪽으로 꼬집고 당겨 뒤쪽 절반을 분리하여 앞쪽 부분을 분리합니다.

핀셋으로 절단된 끝의 양쪽을 잡고 두 번째 쌍을 사용하여 머리를 밀어 넣어 앞쪽 절반을 뒤집습니다. 이것은 상상 디스크, 기관, 침샘, 지방체 및 장과 같은 내부 구조를 노출시킵니다. 겸자를 사용하여 침샘, 지방체, 내장을 제거하고 날개 디스크 위에 있는 측면 기관 줄기를 방해하지 않도록 주의하십시오.

집게를 사용하여 날개 디스크가 부착된 깨끗한 앞쪽 절반을 슬라이드 스페이서 사이에 후크가 있는 깨끗한 라이브 이미징 매체 방울로 옮깁니다. 날개 디스크를 분리하려면 해부 겸자의 한 날 또는 해부 바늘 홀더에 장착된 가는 텅스텐 와이어를 사용하여 미세한 기관 가지에서 부드럽게 해부합니다. 남은 시체는 버리십시오.

해부 겸자 블레이드 또는 텅스텐 바늘을 사용하여 날개 디스크의 방향을 지정하여 족주막 면이 위를 향하도록 합니다. 스페이서 수준보다 우물이 약간 과도하게 채워지도록 중간 볼륨을 조정하십시오. 이미징 스페이서에서 상단 보호 백킹을 제거하고 샘플 위로 덮개 슬립을 부드럽게 내립니다.

집게의 둥근 끝을 사용하여 스페이서 접점에서 커버 슬립을 눌러 적절한 접착을 보장합니다. ImageJ에서 이미지 스택을 투영하려면 이미지, 스택, Z 프로젝트, 메뉴에서 최대 강도를 선택합니다. 최대 강도 투영 이미지에서 후크 채널과 다각형 선택 도구를 사용하여 날개 디스크 접기 패턴을 기반으로 날개 파우치 영역을 식별합니다.

GFP 채널에 동일한 선택 영역을 적용하고 편집을 선택한 다음 외부 지우기를 선택하여 선택한 영역 외부의 노이즈를 제거합니다. 최대 강도 투영 이미지에서 후크 채널을 사용하여 GFP 이미지에서 인공 스팟을 식별합니다. 그런 다음 다각형 선택 도구를 사용하여 영역을 선택합니다.

편집을 클릭하고 지우기를 선택합니다. 정리된 최대 강도 투영 이미지에서 분석, 히스토그램을 차례로 선택한 다음 목록을 선택하여 모든 픽셀 값을 가져옵니다. 이 목록을 스프레드시트 테이블에 복사합니다.

임계값을 설정하려면 음성 대조군 샘플의 배경 신호를 분석하고 다른 샘플 이미지를 사용하여 이 값을 확인합니다. 임계값을 초과하는 픽셀 수를 총 유효한 픽셀 수로 나누고 결과에 100을 곱하여 GFP 양성 표면의 백분율을 계산합니다. 마지막으로 계산된 각 값을 1로 설정된 참조 조건의 평균으로 나눈 후 정규화합니다.

두 개의 분할된 GFP 구성 요소가 모두 없는 야생형 디스크에서 날개 주머니의 중심 근처에서 최소한의 입상 GFP 자가형광만 관찰되었으며 이 기준선 신호를 사용하여 형광 역치를 정의했습니다. 디스크 적극층에서 CD4 분할 GFP1-10만 발현하는 디스크는 야생형과 구별할 수 없는 형광 수준을 보여 GFP1-10 단독의 비형광 특성을 확인했습니다. 디스크 본질에서 CD4 분할 GFP1-10과 족주위 막에서 CD4spGFP11의 공동 발현은 디스크 내강에 국한된 이산적이고 밝은 GFP 반점의 눈에 띄는 증가를 초래했으며, 대조군보다 역치보다 훨씬 더 큰 형광 양성 영역이 있었습니다.

디스크 자체의 Slik 발현은 족주위 막 핵 밀도의 강한 증가와 날개 주머니 영역 전반에 걸쳐 GFP 신호 강도의 극적인 증가를 일으켰으며, 이는 Slik에 의해 유도된 세포톤이 족막 주위 세포와의 향상된 접촉을 확립한다는 것을 시사합니다.