비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

이 프로토콜은 비디오 이미징용 카메라가 장착된 아이콘 바이오 스테이션 CT 인큐베이터에서 수집된 타임랩스 비디오를 분석하여 인간 배아 줄기세포 군집 성장을 측정하는 비디오 생물정보학 방법을 보여줍니다. 인간 배아 줄기 세포 또는 HESC 콜로니를 70% 유창성으로 배양하고 재플레이팅하고 48시간 동안 배양한 후 HESC 콜로니를 Biot ct에서 추가로 48시간 동안 촬영합니다. 성장률은 CL quant 소프트웨어로 개발된 세분화 향상 및 측정 레시피를 사용하여 결정됩니다.

이 레시피는 각 군체에 정확한 수동 마스크 피팅을 가능하게 하는 이미지 분석 도구인 Adobe Photoshop과 비교하여 검증되었습니다. 비디오 생물 정보학의 새로운 분야는 현미경 비디오에서 생물학적 데이터의 처리, 분석 및 마이닝을 자동화하는 데 사용할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 리버사이드 캠퍼스 세포생물학 및 신경과학과 Prou Talbot 박사 연구실의 Serena Lin입니다.

안녕하세요, 저는 Talbot Lab의 Sean Fino입니다. 안녕하세요, 저는 Cell Molecular and Developmental Biology Graduate Program의 TI Satish입니다. 오늘 우리는 비디오 생물정보학 도구를 사용하여 인간 배아 줄기 세포 군집 성장을 측정하는 방법을 보여줄 것입니다.

우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 인간 배아 줄기 세포 행동에 대한 환경 독성 물질의 영향을 측정합니다. 우리는 새로운 줄기 세포 핵심 시설에서 이 절차를 시연할 것입니다. 시작하겠습니다.

비디오 분석을 위해 HESC를 준비하려면 HESC가 포함된 하나의 웰에서 70%가 유입 매질이 흡입될 때까지 마트리겔 코팅된 6개의 웰 플레이트에서 HESC를 성장시키고 1ml의 PBS로 두 번 헹굽니다. 아큐테인 1ml를 넣고 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 1분 동안 배양합니다. 다음으로, 10-12개의 유리구슬을 웰에 넣고 콜로니가 완전히 분리될 때까지 플레이트를 부드럽게 흔듭니다.

1 밀리리터의 인간 배아 줄기 세포 유지, 배지 또는 마우스 배아 섬유 아세포 조절 배지를 사용하여 Accutane을 중화합니다. 비드 없이 분리된 세포를 15ml 원뿔형 튜브에 넣고 200G에서 3분 동안 원심분리합니다. SUP natant를 디캔팅하고 500마이크로리터의 신선한 인간 배아 줄기 세포 유지 배지 또는 HESC 현탁액 100마이크로리터의 M-T-E-S-R 플레이트로 펠릿을 12웰 마트리겔 코팅 플레이트의 여러 웰에 적반합니다.

플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들고 광학 현미경으로 배양을 관찰하여 세포 덩어리가 웰 전체에 고르게 분포되도록 합니다. 플레이트를 37도, 5% 이산화탄소의 인큐베이터에 48시간 동안 놓고 세포가 쉽게 시각화할 수 있을 만큼 평평하고 크게 부착되었는지 확인합니다. 48시간 후 배지를 흡인하고 500마이크로리터의 PBS로 웰을 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거한 다음 각각에 500마이크로리터의 M-T-E-S-R 배지를 추가합니다.

음, 즉시 플레이트를 Biot CT에 넣고 타임랩스 이미지 수집을 시작합니다. 다른 군체로 성장할 가능성이 없는 신중한 단일 군체가 있는 밭을 선택하십시오. 이 프로토콜에서 셀은 7분 간격의 프레임으로 추가로 48시간 동안 비디오로 녹화됩니다.

먼저 세분화 레시피를 만들려면 전체 비디오를 수동으로 스캔하여 녹화 기간 동안 집중된 상태로 유지되는 단일 콜로니가 포함되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 CL quants 소프트웨어에서 분할 마법사를 열고 다음 버튼을 클릭합니다. 올바른 이미지 채널을 선택하고 다음 버튼을 클릭합니다.

소프트 일치를 선택하고 다음을 클릭합니다. 바깥쪽 가장자리를 군체의 중앙 영역으로 원을 그리며 하나 또는 두 개의 원하는 영역을 선택합니다. 이 지역은 가능한 한 작아야 하지만 전체 식민지를 대표해야 합니다.

너무 많은 영역을 선택하면 부정확한 마스크 적용이 발생할 수 있으므로 선택하지 마십시오. 다음 버튼을 클릭합니다. Don't want regions(지역을 원하지 않음)를 선택하여 식민지의 일부가 아니고 배경의 일부가 아닌 지역을 순환시킵니다.

이러한 영역에는 파편과 죽은 세포와 같이 억제해야 하는 패턴이 있습니다. 다음을 클릭합니다. 군체, 파편 또는 죽은 세포가 아닌 영역을 둘러싸서 배경을 선택합니다.

배경은 균일해야 하며 모든 프레임에 나타날 수 있어야 합니다. 일반적으로 식민지 주변의 회색 배경을 선택합니다. 다음 버튼을 클릭합니다.

마스크가 관심 영역을 정확하게 커버하지 않는 경우 관심 영역 위에 컬러 마스크가 표시되어야 합니다. 화면의 오른쪽 하단 모서리에 있는 분할 임계값 범위는 마스크 변경이 필요한 경우 증가하거나 감소할 수 있습니다. 소프트 일치 지역 업데이트를 선택합니다.

이렇게 하면 원하지 않는 영역 또는 배경 영역을 변경할 수 있습니다. 마스크가 만족스러우면 Apply Threshold(임계값 적용)를 선택하고 내 마스크를 저장합니다. 그런 다음 다음 버튼을 클릭합니다.

그러면 마스크가 다른 색상으로 표시됩니다. 마침을 선택합니다. 레시피는 소프트웨어의 오른쪽 상단 모서리에 세분화 레시피로 표시되어야 합니다.

원하는 경우 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 새 이름을 입력하여 레시피의 이름을 바꿉니다. 레시피를 적용합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 마우스를 그 위에 놓습니다.

레시피를 적용하십시오. 사용할 프레임 수를 선택할 수 있는 메뉴가 나타납니다. 프레임 간격을 20프레임마다로 설정하여 마스크의 충실도를 보장합니다.

마스크가 적용된 프레임의 10%를 무작위로 수동으로 스팟 체크하여 파편에서 원치 않는 영역을 제거하는 강화 레시피를 만듭니다. enhancement recipe 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 New를 클릭합니다. 새로운 개선 레시피가 원래 시야에서 표시되어야 합니다.

도구 모음의 아이콘 위로 마우스를 이동하여 이미지 오른쪽에 있는 토글 향상 모듈 버튼을 식별하고 클릭합니다. 레이블 지정 드롭다운 메뉴를 선택합니다. 연결된 레이블에 대한 레이블 선택, 연결된 두 개에 대한 레이블 지정을 선택합니다.

새 작업 표시줄이 표시되어야 합니다. 세그멘테이션 레시피에서 초기 마스크를 잡고 입력 상자로 드래그합니다. 이제 막대에 입력 마스크 번호가 표시되어야 합니다.

입력 마스크 번호가 있는 아이콘을 마스크 0 아이콘으로 드래그합니다. 작업 표시줄에서 최소 크기를 찾고 관심 영역만 표시될 때까지 숫자를 조정합니다. 각 피팅 시험에 대해 실행을 클릭해야 합니다.

최소 크기 조정이 만족스러우면 화면 하단의 이전 개선 레시피를 클릭하고 레시피에 저장을 선택합니다. 이제 소프트웨어가 선택한 레시피를 덮어쓰고 yes spot을 선택하라는 메시지를 표시합니다. 스팟 검사 세그멘테이션과 동일한 절차를 사용하여 개선 레시피를 확인합니다.

세분화 및 개선 방법에 만족하면 측정 템플릿을 계속 만듭니다. 선택을 시작하려면 오른쪽 도구 모음에서 측정 템플릿을 만듭니다. 측정 창에서 클립 아트 셀 그림 위로 커서 이동을 선택합니다.

Ctrl 키를 누른 상태에서 형태학 섹션 아래의 셀을 선택하고 기본 매개 변수를 선택 취소하고 영역 매개 변수를 선택합니다. 그런 다음 템플릿 창을 종료합니다. 아이콘을 선택합니다.

측정 레시피를 만듭니다. 레시피의 이름을 바꿉니다. 로 이동하여 템플릿 탭을 선택합니다 오른쪽 상단 모서리에서 이전에 만든 측정 템플릿을 측정 창으로 끌어다 놓습니다.

예를 클릭하여 계속 진행하고 measurement recipe 창에서 channel mappings를 선택합니다. 그런 다음 전체 셀이 마스크 매핑을 선택합니다. 그런 다음 전체 셀 옵션을 선택합니다.향상된 마스크의 경우 레시피 탭에서 측정 레시피를 선택합니다.

메인 창에서 measurement recipe 창 내의 저장 아이콘을 선택합니다. 그런 다음 창을 닫고 다음 닫기를 열고 시야를 다시 엽니다. 레시피 목록 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 새 응용 프로그램 순서대로 레시피를 레시피 목록으로 드래그하고 레시피 목록 잠금을 선택한 다음 Adobe Photoshop을 사용하여 비디오 데이터에서 레시피를 순차적으로 실행합니다.

동일한 군체의 매 20번째 프레임이 분석되었습니다. Adobe Photoshop에서 식민지 이미지의 프레임을 수동으로 엽니다. 도구 모음에서 마술 지팡이 도구를 클릭합니다.

식민지 주변 영역을 클릭하면 식민지 지역을 제외한 전체 필드가 덮입니다. 군체 주변의 점선이 군체 내부가 아닌 군체의 주변부에 맞는지 확인하십시오. 점선이 주변을 둘러싸고 있지 않으면 위쪽 도구 모음에서 허용 오차 값을 적절하게 변경합니다.

도구 모음에서 빠른 마스크 모드에서 편집을 클릭하고 콜로니를 클릭하여 콜로니를 선택합니다. 창으로 이동하여 메뉴를 풀고 히스토그램을 클릭합니다. 캐시는 1로 설정해야 합니다.

캐시가 2인 경우 표현식 마크 느낌표를 클릭하여 캐시를 1로 변경합니다. 픽셀 값을 스프레드시트에 기록합니다. 20번째 프레임마다 위의 과정을 반복합니다.

그런 다음 Photoshop 및 CL quant 소프트웨어를 사용하여 수집된 데이터를 함께 플롯할 수 있습니다. HESC 군집 성장을 정량화하기 위한 당사의 프로토콜은 생물학적 문제에 대한 비디오 생물정보학의 한 가지 응용을 보여줍니다. 여기에서는 CL quant 소프트웨어와 adobe Photoshop을 사용하여 측정된 48시간 동안의 군집 크기 증가를 비교하는 그래프를 보여줍니다.

그래프는 두 소프트웨어 패키지에서 각각 분석한 5개의 서로 다른 콜로니를 보여줍니다. 각 군체는 다른 색으로 표시됩니다. 실선은 sail quant 소프트웨어를 사용하여 파생되었으며 점선은 Photoshop을 사용하여 수집했습니다.

원시 데이터의 그래프는 두 측정 방법 모두 군체의 시작 크기가 다르다는 사실을 설명하기 위해 잘 일치한다는 것을 보여줍니다. 이 그림은 군체 크기의 백분율 증가로 다시 표시된 데이터를 보여줍니다. 성장률은 시작 군집 크기에 관계없이 비슷하며 두 분석 측정 방법 모두 유사한 결과를 제공합니다.

다음 그래프는 HESC 콜로니 성장에 대한 이전 백분율 변화 데이터의 평균을 표시합니다. 이 그래프는 비디오 생물정보학(video bioinformatics)과 어도비 포토샵(Adobe Photoshop)을 사용하여 수행된 분석 간의 양호한 일치도를 명확하게 보여줍니다. 방금 비디오 생물정보학 도구를 사용하여 인간 배아 줄기 세포 군집 성장을 측정하는 방법을 보여드렸습니다.

위상차 현미경을 사용하여 이 절차를 수행할 때는 소프트웨어에 의한 정확한 집락 선택을 위해 집락 주위에 후광을 포함해야 합니다. 또한 우리가 시연한 프로토콜 대신 배양, 배양 및 비디오 수집을 위한 다른 방법을 사용할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 레시피가 개발되고 검증되면 수동 분석보다 훨씬 더 빠르고 실험적 변동이 적은 분석을 수행합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.