Name: 비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: 배우세요 비디오 생물정보학을 활용한 인간 배아 줄기 세포 콜로니 성장 측정 방법입니다. 타임랩스 영상 분석과 CL quant 소프트웨어를 통해 자동화된 세포 성장 분석 기술을 익힐 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 방법의 개발은 캘리포니아 담배 관련 질병 연구 프로그램, UCR에서 비디오 생물 정보학에서 재생 의학에 대해 캘리포니아 공과 대학, 그리고 NSF IGERT 부여 (# 0903667) (에서 기금에 의해 가능하게되었다 <a href="http://www.cris.ucr.edu/IGERT/index.php">http://www.cris.ucr .edu / IGERT / index.php</a> ). 사브리나 린이 연구 부문에서 논문의 원정대에 의해 지원됩니다, 숀 Forteno는 NIH MARC 원정대에 의해 지원되며, Shruthi Satish는 대학원 부문 원정대에 의해 지원됩니다. 우리는 수치를 준비 그녀의 도움 안나 Trtchounian에 감사하고 있습니다. 우리는 또한 CL - 퀀트 소프트웨어를 사용하는 방법 우리를 가르치는 샘 알워쓰와 네드 Jastromb 감사드립니다.

1 부 : 실험 절차 비디오 데이터는 정보의 풍부가 포함되어 있습니다. 그러나,이 정보는 자주 추출하기 어려운 인간에 의해 수동으로 수행하고 완료하기 위해 개인 시간의 많은 시간이 필요할 수 있습니다 때. 인간의 수동 분석도 해석 및 오류의 변화에​​ 따라 달라질 수 있습니다. 동영상 생물 정보학 비디오 이미지에서 특정 데이터를 나와 컴퓨터 소프트웨어의 사용을 포함한다. 분석의이 방법은 신속하고 분석 인간에 의해 수동으로 완료되면 발생하는 오류를 제거할 수 있습니다. 이 문서의 목적은 비디오 생물 정보학 방법을 사용하여 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장을 quantifying하는 방법을 설명하는 것입니다. 본 논문에서는, 시간 저속 영상은 세포의 여러 분야는 (그림 1) 시간이 지남에 따라 몇 군데있을 수있는 니콘 BioStation 중부 표준시의 배양 장치를 사용하여 수집되었습니다. 이 보고서에서 설명하는 방법은 설정 현미경 모든 동영상 의해 수집된 영상 데이터에 적용됩니다. 우리의 실험 계획법, 우리는 48 시간 동안 12 잘 조직 배양 플레이트에 H9 hESC를 도금. 이 간격 동안 식민지 완전히 첨부하여 Matrigel에 확산하기 위해 허용되었다. 그런 다음, 첨부 hESC 식민지와 접시는 BioStation 중부 표준시로 전송하여 추가로 48 시간 동안 incubated되었습니다. BioStation에있는 동안, 식민지의 이미지는 7 분 간격으로 수집된 나중에 시간 저속 비디오 시퀀스를 생성하는 데 사용되었습니다. 각 식민지에 대한 동영상은 다음 CL - 퀀트 소프트웨어와 함께 개발한 동영상 생물 정보학의 조리법을 사용하여 식민지의 성장을 수치 분석했다. 분석은 CL - 퀀트 소프트웨어가 어도비 포토샵을 사용하여 수동으로 신뢰에 대한 확인되었습니다 만든 요리법을 사용 할. 2 부 : 첨부 hESC 식민지의 작성 <ol><li> Matrigel에 코팅 6 자 번호판을 hESC를 성장하고, 한 70 % confluency에 도달, 다음과 같이 12 잘 Matrigel 코팅 강판의 5 우물에 6 자 판 잘 하나를 replate. </li><li> 잘 포함 hESC에서 매체를 대기음. </li><li> PBS의 1ml와 2X 잘 씻어. </li><li> 37 1 분 Accutase과 부화의 1ml을 추가 ° C와 5% CO 2. </li><li> 우물에 10-12 유리 구슬을 추가하고 식민지 완전히 우물의 바닥에서 분리까지 부드럽게 접시를 흔들. </li><li> mTeSR 중간 또는 mEF 에어컨 매체의 1ml를 사용하여 Accutase를 무력화. </li><li> 3 분 200g에서 15ml 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 신선한 mTeSR 매체의 500μl로 뜨는 및 휴식 펠렛을 가만히 따르다. </li><li> 12 잘 플레이트의 각 우물에 hESC 서스펜션의 플레이트 드롭 현명 100μl. </li><li> 록 플레이트 앞뒤로 부드럽게하고 가벼운 현미경 문화를 관찰합니다. 세포 대단히 짧은 시간이 균일하게 접시에 걸쳐 분산되어 있는지 확인합니다. </li><li> 인큐베이터에 12 잘 플레이트를 다시 넣으십시오. </li><li> hESC 48 시간 (짧은 시간 사용할 수있다)를 첨부하고 성장할 수 있습니다. </li><li> 48 시간 후, PBS의 500ul로 가만히 따르다 매체와 세척 우물은 무소속의 세포를 제거하려면 다음과 같이하십시오. </li><li> 각 잘하는 mTeSR 매체의 1ml을 추가합니다. </li><li> 코멘트 즉시 보육 / 비디오 이미징에 대한 현미경으로 접시를 놓습니다. </li><li> 시간이 경과 이미지를 수집하기 시작. 다른 식민지로 성장 가능성이없는 개별 단일 식민지와 필드를 선택하려고합니다. </li><li> culturing 및 hESC를 설정하는 다른 방법은 위의 프로토콜 대신에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3 부 : 비디오 생물 정보학 CL - 퀀트 소프트웨어는 순서대로 실행하면 시간이 지남에 따라 각 식민지에 대한 미크론의 픽셀 번호 또는 영역을 결정하는 세 마리 "조리법"를 만드는 데 사용되었다. 세 가지 조리법이 순서에서이 응용 프로그램 빌드가 세분화, 향상 및 측정을 포함합니다. CL - 퀀트 소프트웨어 / 제조법 개발을 사용하여 hESC 콜로니 성장을 분석 : <ol><li> 세분화 제조법을 먼저 만들어집니다. </li><li> 동영상 사용할 수 있는지 확인하기 위해 전체 비디오를 검사합니다. 전체 식민지 볼 분야에서 다른 식민지의 필드를 입력하지 않도록 유지 반드시 확인하십시오. </li><li> 분할 마법사를 열고 "다음"버튼을 클릭하십시오. </li><li> 올바른 이미지 채널을 (즉, 위상, 녹색, 붉은 색 등)을 선택하고 "다음"버튼을 클릭하십시오. </li><li> 3 선택에서 "부드러운 일치"를 선택하고 "다음"을 클릭하십시오. </li><li> 일반적으로 이미지 식민지의 중심지로 식민지의 바깥쪽 가장자리에 지역 순회하여 "싶다"영역을 선택합니다. <ul><li> 이 지역은 가능한 작게해야하지만 전체를 식민지의 대표해야합니다. </li><li> 위상 콘트라스트 현미경을 사용하는 경우, 소프트웨어에 의해 정확한 식민지 선택에 대한 식민지 주변의 후광을 포함해야합니다. </li><li> 다른 나타날 수 있습니다 관심을 1 또는 2 지역을 선택픽셀 식민지 내의 패턴 있지만 정확 마스크 응용 프로그램에서 발생할 수 있습니다 너무 많은 "원하는"를 선택하지 않습니다. </li></ul></li><li> "다음"버튼을 클릭하십시오. </li><li> 배경의 일부 식민지의 일부가 아닌 아니라 이미지에 영역을 둘러싼하여 영역을 "싫어"를 선택하십시오. 이들은 당신이 파편과 죽은 세포와 같은 유물을 픽셀을 억제하고 포함하고자하는 패턴을 가지고 지역입니다. "다음"을 클릭하십시오. </li><li> 당신이 억제하고자하는 지역을 순회하여 "배경"을 선택합니다. <ul><li> "싶지 않다"와 "배경"지역에 그 배경에 차이가 균일 모든 프레임에 표시 가능성이 있어야합니다. </li><li> 일반적으로 우리는 식민지 주변의 회색 배경을 선택합니다. </li></ul></li><li> "다음"버튼을 클릭하십시오. </li><li> 컬러 마스크는 관심의 영역 (그림 2A)을 통해 표시되어야합니다. </li><li> 마스크 정확하게 관심의 영역을 커버하지 않는 경우, 분할 임계값 범위 (소프트웨어 화면의 하단 오른쪽 구석에 위치) 증가 또는 감소 될 수 있습니다. </li><li> 세분화 마법사가 추가로 마스크 영역 미세 조정 필요한 경우 메시지가 나타납니다. </li><li> 당신이 마스크를 변경하고자하는 경우, "소프트와 일치하는 지역을 업데이트"를 선택합니다. 이것은 "싶지 않다", "원하는"또는 "배경"영역을 변경할 수 있습니다. </li><li> 마스크가 만족하는 경우, 선택 "임계값을 적용하고 내 마스크를 저장"과 "다음"버튼을 클릭하십시오. </li><li> 마스크 그런 다음 서로 다른 색상으로 표시됩니다. </li><li> "Finish"를 선택합니다. </li><li> 제조법은 소프트웨어의 오른쪽 상단 구석에 표시되어야하고, 그것은 "세분화 제조법"라고해야합니다. </li><li> 당신은 오른쪽 클릭하여 "이름 바꾸기"로하고자하는 경우 그 제조법의 이름을 바꿉니다. </li><li> 현장 검사의 경우, 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "제조법을 적용"위에 마우스를 놓습니다. </li><li> 메뉴를 당신이 원하는 프레임의 수를 선택 지점이 제조법을 확인할 때 사용할 수 있습니다는 것을 보여줄 것입니다. 마스크 배치의 정확성을 확인하는 자리 매 10 프레임에 대한 제조법을 실행합니다. </li><li> 마스크 작은 원치 않는 지역이나 파편의 일부를 집어들고있다면, 당신은 관심의 영역에 마스크의 피팅 향상을 위해 '개선 제조법 "을 만들 수 있습니다. </li><li> 강화 제조법을 만들려면 마우스 오른쪽 "강화 제조법"폴더를 누른 다음 "새"를 클릭하십시오. 새로운 개선 제조법이 표시되어야합니다. </li><li> 뷰 (FOV)의 원래의 분야에서 이미지의 오른쪽에있는 '전환 향상 모듈 "버튼을 클릭하십시오. 올바른 하나를 식별 도구 모음에서 아이콘 위로 마우스. </li><li> '라벨'드롭 다운 메뉴를 선택합니다. </li><li> "상표 4 연결"을 선택하십시오. </li><li> 선택 "4 connected2을 라벨." </li><li> 새로운 작업 표시줄이 표시되어야합니다. </li><li> 분할의 제조법에서 초기 마스크 (mask0)를 잡고 "입력"상자로 끌어옵니다. </li><li> 바 이제 "# 입력 마스크"를 표시해야합니다. </li><li> 마스크 0 아이콘 "# 입력 마스크"로 아이콘을 드래그하십시오. </li><li> 작업 표시줄에서 "분 크기"를 찾아 관심을 단 영역이 표시될 때까지 숫자를 조정합니다. 당신은 각각의 피팅 재판을 통해 "실행"을 클릭 있는지 확인하십시오. </li><li> 일단 귀하의 최소 크기 조정 만족, 당신이 이전에 만든 '강화 제조법 "을 클릭하십시오. (그림 2B) </li><li> 화면 하단의 "조리법에 저장"을 선택합니다. </li><li> 이 소프트웨어는 이제 "선택된 제조법을 덮어 쓰시겠습니까?", "예"를 선택하라는 메시지가 나타납니다 </li><li> 현장 확인 세분화에 대해서는 위와 같은 절차를 사용하여 강화 제조법을 확인 스팟. </li><li> 세분화 및 향상 요리법에 만족하는 경우, 오른쪽 도구 모음에서 '측정 템플릿 만들기'를 선택합니다. </li><li> 원하는 경우에 템플릿 이름을 바꿉니다. </li><li> 측정 템플릿 창에서 클립 아트 전지 그림 위에 커서를 이동합니다. Ctrl 키를 누른 상태에서 셀을 선택합니다. </li><li> 선택을 취소 '기본 매개 변수'와 '형태'아래 체크 '영역 매개 변수. </li><li> 종료 '템플릿'창. </li><li> 측정 제조법에서 만든 아이콘을 선택합니다. </li><li> 제조법의 이름을 바꿉니다. </li><li> 로 이동하고 오른쪽 상단에있는 '템플릿'탭을 선택합니다. </li><li> 드래그 앤 측정 창에 이전에 만들어진 측정 템플릿을 놓습니다. </li><li> '예'를 클릭 계속합니다. </li><li> 측정 제조법 창에서, 선택한 다음 '전체 셀', '채널 매핑. </li><li> 선택 '마스크 매핑. </li><li> 강화된 마스크를 선택한 다음 '전체 세포'옵션. </li><li> 메인 윈도우의 레시피 '탭 아래에있는'측정 제조법 '을 선택하십시오. </li><li> 측정 제조법 창 내에있는 '저장'아이콘을 선택하십시오. </li><li> 다음 창을 닫습니다. </li><li> 이제 닫고 'FOV'를 다시 엽니다. </li><li> 오른쪽 '레시피'아이콘 선택 '잠금 요리법 목록'을 클릭하여 비디오 데이터를 순차적으로 조리법을 실행합니다. </li></ol> 파트 4 : 포토샵 소프트웨어를 사용하여 조리법의 정확성을 확인 (CL - 퀀트의 softw과 제조법의 유효성을 검사하기 위해서는)입니다, 같은 데이터는 어도비 포토샵과 함께 수동으로 분석할 수 있습니다. 이 분석을 위해, 모든 열번째 프레임 (매주 70 분 시점) 48 시간 동안 식민지 크기를 측정하는 분석했다. <ol><li> 어도비 포토샵의 식민지 이미지의 프레임을 엽니다. </li><li> 도구 모음의 마술 지팡이 도구를 클릭하십시오. </li><li> 전체 필드 식민지 지역 제외 덮여 있으므로 식민지 주변을 클릭합니다. </li><li> 도구 모음에서 '빠른 마스크 모드에서 수정'과 식민지가 선택되어 있으므로 식민지를 누릅니다. </li><li> 식민지 주변의 점선은 식민지의 주변 권리 맞는 아니라 안에 있는지 확인합니다. 점선은 주변 않을 경우, 적절하게 상단 도구 모음에서 허용 오차 값을 변경합니다. </li><li> '창'으로 이동 풀다운 메뉴를하고 '히스토그램'을 클릭하십시오. </li><li> 때 캐시 = 1 픽셀 값을 적어 둡니다. 캐시가 2면, 클릭 '을! " 캐시 1로 변경하고 다음 픽셀 값을 참고합니다. </li><li> 모든 열번째 프레임에 대해 위의 과정을 반복합니다. 원하는 경우 적은 총 프레임은 사용할 수 있습니다. </li><li> 데이터 포토샵과 CL - 퀀트 소프트웨어를 사용하여 수집하면 다음 함께 꾸몄다 수 있습니다. CL - 퀀트 조리법이 진실 경우, 포토샵 및 CL - 퀀트 분석을위한 곡선은 (Figs. 3-5) 매우 유사합니다. </li><li> CL - 퀀트 개발된 조리법은 진실 경우, 그들은 안정적으로 다른 비디오 데이터에 적용할 수 있습니다. </li><li> 이 분석에서 비디오 생물 정보학를 사용하여 값을 세분화, 향상 및 측정 요리법이 개발되고 유효성이 확인되면, 그들은 훨씬 더 빠르게 더 정확하게 포토샵을 사용하는 인간보다 분석을 수행할 것입니다. </li></ol> 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : BioStation 중부 표준시 성장 48 시간 동안 다양한 시간에 프레임을 보여주는 hESC 콜로니의 필름 스트립. 프레임는 7 분 간격으로 찍은. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 분할의 제조법에 의해 식민지에 위치 마스크 hESC의 (A) 이미지. 파편과 배경 영역도 향상 제조법은 평가의 정확성을 향상시키기 위해 필요한 것을 나타내는 마스크입니다. (B) 개선 후 "A"에 표시된 것과 같은 식민지의 이미지가 수행되었습니다. 마스크 지금은 식민지를 선택하고 소음이 선택에서 제거되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : 48 시간 동안 식민지 크기 증가 (픽셀)를 보여주는 그래프로 CL - 퀀트 소프트웨어와 포토샵을 사용하여 결정됩니다. 이 그래프는 플롯 원시 데이터와 식민지가 다른 크기에서 시작 프로그램을. 또한 측정의 두 가지 방법 좋은 계약에 있는지 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 : 48 시간 동안 식민지 크기 % 증가를 표시 정상화 후 그림 3과 같은 데이터를 보여주는 그래프. 이것은 성장 속도에 관계없이 시작 식민지 크기 및 분석의 두 조치 비슷한 결과를주는 유사한 것을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5 : 그림 4에있는 정규화된 데이터에 대한 의미를 보여주는 그래프. 이 그래프는 명확하게 동영상 생물 정보학 (CL - 퀀트 소프트웨어)와 포토샵을 사용하여 조리법이 진실입니다 구축 할 분석 사이 좋은 계약을 보여줍니다. 프레임 325에서 포토샵 데이터 영역에서 약간의 침체는 포토샵 분석에 포함되지 않는 여러 개의 동영상을 때문입니다.

비디오 생물 정보학 도구는 빠른 속도로 비디오 이미지로부터 데이터를 추출하기위한 강력한 있습니다. hESC 콜로니 성장을 quantifying위한 프로토콜은 생물 학적 문제에 대한 비디오 생물 정보학의 한 응용 프로그램을 보여줍니다. 이 방법은 양적이며 개별 hESC의 식민지에서 공개 데이터의 재미있는 기능이 있습니다. 비디오 생물 정보학의 조리법은 이러한 확산, 마이 그 레이션, apoptosis, 그리고 기판에 세포 부착과 인접 세포에 세포 부착 등 다른 세포 프로세스를 모니터하기 위해 개발된 수 있습니다. 조리법의 정확성은 포토샵을 사용하여 검증되었습니다 CL - 퀀트 소프트웨어를 사용하여 개발하고 솔직 발견되었습니다. 적절한 조리법이 개발되면, 어떤 소스로부터 비디오 데이터는 매우 신속하게 분석할 수 있습니다. 동영상 생물 정보학 도구를 사용하여 비디오 데이터를 분석하는 데 필요한 시간은 포토샵을 사용하여 수작업으로 수행 분석에 필요한 시간보다 훨씬 적습니다. 분석을 수행하는 인간은 이미지 분석 때마다 오류 또는 약간 ...

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 인간 배아줄기세포 유지 배지</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05850</td><td>또는 hESC 배양에 적합한 임의의 배지.</td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>또는 기타 적합한 기질.</td></tr><tr><td>DMEM/F12 기초 배지</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 및 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;가 없는 인산염 완충 식염수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase 효소 세포 분리 배지</td><td>eBioscience</td><td>00-4555-56</td><td>또는 기타 적합한 분리 효소.</td></tr><tr><td>3mm 유리 비즈</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>선택 사항.</td></tr><tr><td>12-well 조직 배양 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td>또는 기타 임의의 플레이트 형식.</td></tr><tr><td>Nikon BioStation CT/IM</td><td></td><td></td><td>또는 비디오 데이터 수집에 적합한 기타 인큐베이터/현미경.</td></tr><tr><td>CL-Quant 소프트웨어 (Nikon) 및/또는 Photoshop (Adobe).</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

비디오 데이터는 복잡하며 여러 이미지, 동영상 자료에서 광산 정보로 구성되어 있기 때문에 컴퓨터 소프트웨어의 도움없이 할 어렵습니다. 비디오 생물 정보학 데이트 마이닝 및 분석을 수행하기 위해 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 비디오 이미지 spatio - 시간적 데이터를 추출하기위한 강력한 양적 접근 방식이다. 이 문서에서는, 우리는 비디오 이미지를위한 카메라가 장착된 니콘 BioStation 중부 표준시 인큐베이터에서 수집한 시간 경과 비디오 분석을 통해 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 성장을 quantifying위한 비디오 생물 정보학 방법을 소개합니다. 우리의 실험에서, Matrigel에 첨부된되었습니다 hESC 식민지는 BioStation 중부 표준시에 48 시간 동안 촬영했다. 이러한 식민지의 성장 속도를 확인하려면, 조리법은 사용자가 비디오 이미지의 데이터의 다양한 유형을 추출할 수 있도록 CL - 퀀트 소프트웨어를 사용하여 개발되었습니다. 정확하게 식민지의 성장을 평가하는 세 요리법이 만들어졌습니다. 식민지와 배경, 정확하게 비디오 시퀀스에 걸쳐 식민지를 정의하는 두 번째 강화된 이미지, 세 번째로 첫 번째 세그먼트 이미지가 시간이 지남에 따라 식민지의 픽셀의 개수를 측정했습니다. 세 조리법은 48 시간 이상의 개별 hESC 식민지의 성장의 속도를 분석 BioStation 중부 표준시에서 수집한 영상 데이터를 차례로 실행되었습니다. CL - 퀀트 조리법의 신뢰를 확인하려면 동일한 데이터는 어도비 포토샵 소프트웨어를 사용하여 수동으로 분석했다. 데이터가 CL - 퀀트 조리법을 사용하고 포토샵을 비교했다 얻은 때, 결과는 CL - 퀀트 조리법은 진실했다 나타내는 거의 동일했다. 여기에서 설명한 방법은 hESC 또는 식민지에서 성장의 다른 세포의 성장 속도를 측정하는 모든 동영상 데이터에 적용 수 있습니다. 또한, 다른 비디오 생물 정보학의 조리법은 이러한 마이 그 레이션, apoptosis와 세포 유착과 같은 다른 세포 프로세스의 미래에 개발할 수 있습니다.

비디오 생물 정보학은 자동 처리, 분석, 이해하고, 미세한 동영상에서 추출한 생물 spatio - 시간적 데이터의 데이터 마이닝이다. 이 문서의 목적은 비디오 생물 정보학 방법을 사용하여 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장을 측정하는 방법을 설명하는 것입니다.

비디오 데이터는 복잡하고 많은 이미지로 구성되어 있기 때문에, 컴퓨터의 도움 없이는 비디오 자료에서 정보를 마이닝하는 것이 어렵습니다...

본 프로토콜은 비디오 이미징용 카메라가 장착된 icon bio station CT 인큐베이터에서 수집한 타임랩스 비디오를 분석하여 인간 배아줄기세포 콜로니 성장을 측정하는 비디오 생물정보학 방법을 시연합니다. 인간 배아줄기세포 또는 HESC 콜로니를 70% 합류도까지 배양한 후 재도말하고 48시간 동안 배양하며, 이후 Biot ct에서 HESC 콜로니를 추가로 48시간 동안 촬영합니다. 성장률은 CL quant 소프트웨어로 개발된 세그멘테이션 강화 및 측정 레시피를 사용하여 결정합니다.이 레시피들은 각 콜로니에 대해 정밀한 수동 마스크 피팅이 가능한 이미지 분석 도구인 Adobe Photoshop과의 비교를 통해 검증되었습니다. 비디오 바이오인포매틱스라는 신흥 분야는 현미경 비디오로부터 생물학적 데이터의 처리, 분석 및 마이닝을 자동화하는 데 사용될 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 리버사이드 캠퍼스 세포생물학 및 신경과학과의 Dr. Prou Talbot 연구실 소속 Serena Lin입니다.안녕하세요, Talbot Lab의 Sean Fino입니다. 안녕하세요, 세포 분자 및 발생 생물학 대학원 프로그램의 TI Satish입니다. 오늘은 비디오 생물정보학 도구를 사용하여 인간 배아 줄기 세포 콜로니의 성장을 측정하는 방법을 보여드리겠습니다.당사 연구실에서는 환경 독성 물질이 인간 배아 줄기세포의 거동에 미치는 영향을 측정하기 위해 이 절차를 사용합니다. 새로운 줄기세포 코어 시설에서 이 절차를 시연하겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.비디오 분석을 위해 HESC를 준비하려면, Matrigel이 코팅된 6-well 플레이트에서 HESC를 70% 밀도로 성장할 때까지 배양합니다. HESC가 포함된 well에서 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL의 PBS로 두 번 헹굽니다. 1 mL의 Accutane을 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 1분 동안 배양합니다. 다음으로, well에 10~12개의 유리 비드를 넣고 콜로니가 완전히 떨어져 나갈 때까지 플레이트를 부드럽게 흔들어 줍니다.1 mL의 인간 배아줄기세포 유지 배지 또는 마우스 배아 섬유아세포 조건화 배지를 사용하여 Accutane을 중화합니다. 비즈가 없는 분리된 세포를 15 mL 원심분리관에 수집하고 200 G에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 500 µL의 신선한 인간 배아줄기세포 유지 배지 또는 M-T-E-S-R로 펠렛을 풀어줍니다. HESC 현탁액 100 µL를 Matrigel이 코팅된 12-웰 플레이트의 여러 웰에 한 방울씩 떨어뜨려 분주합니다.플레이트를 앞뒤로 살살 흔든 후, 광학 현미경으로 배양물을 관찰하여 세포 덩어리가 웰 전체에 고르게 분포되었는지 확인합니다. 세포가 평평하게 부착되고 쉽게 시각화할 수 있을 만큼 충분히 커지도록 플레이트를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 인큐베이터에 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후, 배지를 흡입하여 제거하고 500 µL의 PBS로 웰을 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거한 다음, 각 웰에 500 µL의 M-T-E-S-R 배지를 첨가합니다.즉시 플레이트를 Biot CT에 넣고 타임랩스 이미지를 수집하기 시작합니다. 다른 콜로니와 겹쳐 자랄 가능성이 낮은, 독립된 단일 콜로니가 있는 시야를 선택하십시오. 이 프로토콜에서는 7분 간격으로 프레임을 설정하여 48시간 동안 세포를 비디오 녹화합니다.세그멘테이션 레시피를 먼저 만들려면, 전체 비디오를 수동으로 스캔하여 녹화 기간 내내 초점이 유지되는 단일 콜로니가 포함되어 있는지 확인하십시오. 그 후, CL quants 소프트웨어에서 세그멘테이션 마법사를 열고 다음 버튼을 클릭하십시오. 올바른 이미지 채널을 선택하고 다음 버튼을 클릭하십시오.Soft matching을 선택하고 Next를 클릭하십시오. 콜로니의 외곽 가장자리에서 중심 영역까지 원을 그려 하나 또는 두 개의 관심 영역을 선택하십시오. 이 영역은 가능한 한 작게 설정하되, 전체 콜로니를 대표할 수 있어야 합니다.너무 많은 영역을 선택하면 마스크 적용이 부정확해질 수 있으므로 주의하십시오. 다음 버튼을 클릭하십시오. 콜로니의 일부가 아니며 배경의 일부도 아닌 영역을 원으로 그려 '영역 제외(Don't want regions)'를 선택하십시오.이 영역들에는 잔해나 죽은 세포와 같이 억제해야 할 패턴이 포함되어 있습니다. '다음'을 클릭하십시오. 콜로니, 잔해 또는 죽은 세포가 아닌 영역을 원으로 그려 배경을 선택하십시오.배경은 균일해야 하며 모든 프레임에서 나타날 가능성이 높아야 합니다. 일반적으로는 콜로니 주변의 회색 배경을 선택합니다. 다음 버튼을 클릭하십시오.마스크가 관심 영역을 정확하게 덮지 않는 경우, 관심 영역 위에 유색 마스크가 표시되어야 합니다. 마스크 변경이 필요한 경우 화면 오른쪽 하단의 세그멘테이션 임계값 범위를 증가시키거나 감소시킬 수 있습니다. 소프트 매칭 영역 업데이트를 선택하십시오.이를 통해 선택 영역(want), 제외 영역(don't want) 또는 배경 영역을 변경할 수 있습니다. 마스크가 만족스럽다면 'apply threshold'를 선택하고 'save my mask'를 클릭하십시오. 그런 다음 'next' 버튼을 클릭하십시오.그러면 마스크가 다른 색상으로 표시됩니다. 완료(finish)를 선택하십시오. 소프트웨어의 우측 상단에 세그멘테이션 레시피(segmentation recipe)로 해당 레시피가 표시되어야 합니다.원하는 경우 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 새 이름을 입력하여 레시피 이름을 변경하십시오. 레시피를 적용하려면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 마우스를 올리십시오.레시피를 적용합니다. 사용할 프레임 수를 선택할 수 있는 메뉴가 나타납니다. 마스크의 정확도를 보장하기 위해 프레임 간격을 20프레임마다로 설정하십시오.마스크가 적용된 프레임의 10%를 무작위로 수동 점검하여 데브리(debris) 내의 불필요한 영역을 제거하는 강화 레시피(enhancement recipe)를 생성하십시오. 강화 레시피 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 '새로 만들기(new)'를 클릭하십시오. 그러면 원래의 시야(field of view)로부터 새로운 강화 레시피가 표시됩니다.툴바의 아이콘 위에 마우스를 올려 이미지 오른쪽에 위치한 토글 강화 모듈 버튼을 확인한 후 클릭하십시오. 라벨링 드롭다운 메뉴를 선택하십시오. 연결된 라벨링을 선택하고 연결된 두 가지 라벨링을 선택하십시오.새로운 작업 표시줄이 나타나야 합니다. 세그멘테이션 레시피에서 초기 마스크를 가져와 입력창으로 드래그하십시오. 이제 표시줄에 입력 마스크 번호가 표시되어야 합니다.입력 마스크 번호가 표시된 아이콘을 마스크 0 아이콘으로 드래그하십시오. 작업 표시줄에서 min size를 찾아 관심 영역(region of interest)만 표시될 때까지 숫자를 조정하십시오. 각 피팅 시도마다 반드시 execute를 클릭하십시오.최소 크기 조정이 만족스럽게 완료되면, 화면 하단의 이전 강화 레시피(enhancement recipe)를 클릭하고 '레시피에 저장(save to recipe)'을 선택하십시오. 그러면 소프트웨어에서 선택한 레시피를 덮어쓸 것인지 묻는 창이 나타나는데, 이때 '예(yes)'를 선택하십시오. 스팟 세그멘테이션(spot checking segmentation) 확인과 동일한 절차를 사용하여 강화 레시피를 확인하십시오.세그멘테이션 및 강화 레시피에 만족한다면, 이어서 측정 템플릿을 생성하십시오. 시작하려면 우측 툴바에서 측정 템플릿 생성(create measurement template)을 선택하십시오. 측정 창에서 커서를 클립 아트 세포 도형 위로 이동시키십시오.Control 키를 누른 상태에서 morphology 섹션 아래의 셀을 선택하고, default parameter 체크를 해제한 뒤 area parameter를 체크하십시오. 그런 다음 템플릿 창을 닫고 아이콘을 선택하십시오.측정 레시피를 생성합니다. 레시피의 이름을 변경합니다. 템플릿 탭으로 이동하여 선택합니다. 우측 상단에서 이전에 생성한 측정 템플릿을 측정 창으로 드래그 앤 드롭합니다.측정 레시피 창에서 '예'를 클릭하여 계속 진행한 후, 채널 매핑(channel mappings)을 선택하십시오. 그런 다음 전체 세포 선택 마스크 매핑(whole cell select mask mappings)을 선택하십시오. 이어서 전체 세포(whole cell) 옵션을 선택하십시오. 향상된 마스크의 경우, 레시피 탭에서 측정 레시피를 선택하십시오.메인 창에서 측정 레시피 창 내의 저장 아이콘을 선택하십시오. 그런 다음 창을 닫으십시오. 이어서 시야(field of view)를 닫았다가 다시 엽니다. 레시피 목록 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 '새로 만들기'를 클릭하고, 필요한 적용 순서대로 레시피를 레시피 목록으로 드래그하십시오. 레시피 목록 잠금을 선택한 후, Adobe Photoshop을 사용하여 비디오 데이터에 레시피를 순차적으로 실행하십시오.동일한 콜로니의 매 20번째 프레임을 분석하였습니다. Adobe Photoshop에서 콜로니 이미지의 프레임을 수동으로 엽니다. 툴바에서 자동 선택 도구(magic wand tool)를 클릭합니다.콜로니 주변 영역을 클릭하여 콜로니 영역을 제외한 전체 필드가 선택되도록 하십시오. 콜로니를 둘러싼 점선이 콜로니 내부가 아닌 가장자리에 정확히 맞는지 확인하십시오. 점선이 가장자리에 맞지 않는 경우, 상단 도구 모음에서 허용 오차(tolerance) 값을 적절하게 변경하십시오.툴바에서 퀵 마스크(quick mask) 모드의 편집(edit)을 클릭하고, 콜로니를 클릭하여 선택합니다. 윈도우 풀다운 메뉴로 이동하여 히스토그램(histogram)을 클릭합니다. 캐시(cache)는 1로 설정되어 있어야 합니다.캐시가 2인 경우, 느낌표 표시의 expression mark를 클릭하여 캐시를 1로 변경하십시오. 픽셀 값을 스프레드시트에 기록하십시오. 매 20번째 프레임마다 위 과정을 반복하십시오.Photoshop 및 CL quant 소프트웨어를 사용하여 수집한 데이터를 함께 도식화할 수 있습니다. HESC 콜로니 성장을 정량화하기 위한 본 프로토콜은 비디오 바이오인포매틱스를 생물학적 문제에 적용한 한 사례를 보여줍니다. 여기에서는 CL quant 소프트웨어와 Adobe Photoshop을 사용하여 측정한 48시간 동안의 콜로니 크기 증가량을 비교한 그래프를 제시합니다.그래프는 두 가지 소프트웨어 패키지로 각각 분석한 다섯 가지의 서로 다른 콜로니를 보여줍니다. 각 콜로니는 서로 다른 색상으로 표시됩니다. 실선은 sail quant 소프트웨어를 사용하여 도출되었으며, 점선은 Photoshop을 사용하여 수집되었습니다.원시 데이터 그래프를 통해 두 가지 측정 방법 모두 콜로니의 초기 크기가 서로 다르다는 점을 고려했을 때 잘 일치함을 알 수 있습니다. 이 그림은 데이터를 콜로니 크기의 증가율(%)로 다시 도식화하여 보여줍니다. 성장률은 초기 콜로니 크기와 관계없이 유사하며, 두 가지 분석 측정법 모두 비슷한 결과를 나타냅니다.다음 그래프는 HESC 콜로니 성장의 이전 퍼센트 변화 데이터의 평균값을 보여줍니다. 이 그래프는 비디오 바이오인포매틱스와 Adobe Photoshop을 사용하여 수행한 분석 결과가 서로 잘 일치함을 명확하게 보여줍니다. 지금까지 비디오 바이오인포매틱스 도구를 사용하여 인간 배아 줄기 세포 콜로니 성장을 측정하는 방법을 살펴보았습니다.위상차 현미경을 사용하여 이 절차를 수행할 때는 소프트웨어가 콜로니를 정확하게 선택할 수 있도록 콜로니 주변의 헤일로(halo)를 반드시 포함하십시오. 또한, 저희가 시연한 프로토콜 대신 배양, 인큐베이션 및 비디오 수집을 위한 다른 방법들을 사용할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 레시피가 개발되고 검증되면, 수동 분석보다 훨씬 빠르게 분석을 수행할 수 있으며 실험적 변동성도 줄어들 것입니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

video-bioinformatics-analysis-human-embryonic-stem-cell-colony

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오 프로토콜은 신경 식민지 - 형성 세포 분석을 사용하여 신경 전구체 세포의 혼합 인구의 타고난 신경 줄기 세포를 차별하고 열거하는 방법을 보여줍니다.

세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이

전환 문화에 피더 - 무료 조건에 지속적인 노력에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 유도와 문화 마우스 배아 피더 (MEFs)와 공동 문화에 달려 남아 있습니다. 여기, 우리는 신속하게 이전 실험에 hESC 문화에서 피더를 제거 소설 방법을 보여줍니다.

고밀도의 인간 배아 줄기 세포 문화의 급속한 섬유 아세포 제거

단일 세포 유전자 발현 분석은 줄기 세포 이질성을 이해하는데 필요하다.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

이 연구는 신경계 구조 및 복구를 위한 장기 생체 내 이식 연구에 적용하기 전에 조작된 줄기 세포와 그 행동을 신속하게 특성화하는 실험 플랫폼을 설명합니다.

신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

본 연구에 제시된 프로토콜은 유세포 분석을 이용하여 양 및 음의 다 능성 줄기 세포 마커의 운동 측정을 통해 프로그래밍 진행의 실시간 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 또한 IPSC 생성시 형태, 마커 또는 기자의 표현의 영상 기반의 평가를 포함한다.

체세포 재 프로그래밍의 운동 측정 및 실시간 시각화

대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

원시 생식 세포 (PGCs)는 정자와 모두의 일반적인 선구자. 인간의 배아 PGCs cytokines의 상호 작용을 통해 만능 epiblast 셀에서 지정 됩니다. 여기, 우리가 유도 액 pluripotency 유도 만능 줄기 세포에서 embryoid 몸 표면에 PGCs을 닮은 인간의 세포 transcriptomally의 13 일 프로토콜을 설명 합니다.

액 pluripotency에서 Embryoid 몸의 표면에 인간의 원시 생식 세포와 같은 세포의 생성 유도 만능 줄기 세포

세포외 매트릭스 리간드는 폴리아크릴아미드 하이드로겔에 패턴화되어 밀폐된 콜로니에서 인간 배아 줄기 세포의 배양을 준수기판에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 견인력 현미경 검사법 및 생화학 적 분석을 결합하여 조직 기하학, 세포 생성 힘 및 운명 사양 간의 상호 작용을 검사 할 수 있습니다.

조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝

효모 성장 표현형은 마이크로콜로 성장하는 고정 된 세포의 매우 병렬 시간 경과 이미징을 통해 정확하게 측정됩니다. 동시에, 스트레스 내성, 단백질 발현 및 단백질 국소화를 모니터링할 수 있고, 통합된 데이터 세트를 생성하여 환경 및 유전적 차이뿐만 아니라 동종 세포 간의 유전자 발현 이질성, 변조 성장을 연구할 수 있습니다.

성장과 유전자 발현의 이질성을 측정하는 마이크로콜로니의 높은 처리량 라이브 이미징

여기에서는 계대 0 각질세포의 계통을 수동으로 추적하는 데 사용할 수 있고 세포 분열 운명 및 세포 주기 기간을 포함한 증식 지표를 수집할 수 있는 살아있는 세포 이미징 분석 방법을 제공합니다.

표피 각질 세포 증식 역학을 연구하기 위한 타임랩스 사진을 사용한 라이브 셀 이미징

배우세요 비디오 생물정보학을 활용한 인간 배아 줄기 세포 콜로니 성장 측정 방법입니다. 타임랩스 영상 분석과 CL quant 소프트웨어를 통해 자동화된 세포 성장 분석 기술을 익힐 수 있습니다.

비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

더 많은 동영상 탐색