Name: 3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 배우세요 인간 신경 줄기 세포의 3차원 배양 및 분화 과정에서 microRNA 발현 변화를 PCR 어레이로 분석하고, 컴퓨터 분석과 이중 루시퍼라제 검정으로 표적 mRNA를 검증하는 방법을. 이 기술은 줄기세포 생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 헬라 배양 및 형질을 가진 그녀의 기술 지원을 hNSCs의 준비를 도와 줄리 Heward 및 Lavaniya Thanabalasundaram을 인정합니다.

3 차원 (3D) 문화 1. HNSC 차별화 참고 : 분리 및 이전 간행물 2에 설명 된 윤리적 승인 된 조직에서, hNSCs을 유도. 이 절차를 수행하는 동안 윤리 및 제도적 지침을 따르십시오. 1.1) 3D 문화는 12 웰 플레이트를 사용하여 <ol><li> 절차 전반에 걸쳐 무균 기술을 사용합니다. 생물 안전 캐비닛에서 / 웰 70 % 에탄올 2 ㎖를 추가하여 다시 수화물 골격은 관개 (WFIR) 물을 사용하여 제조. 물론 각각의 벽 아래로 70 % 에탄올을 분배하여 발판을 만지지 마십시오. </li><li> 조심스럽게 70 % 에탄올을 대기음 즉시 2 ㎖ / 잘 DMEM으로 발판을 씻어 : 1 분 동안 F12. 두 번 세척 절차를 반복합니다. 조심스럽게 DME​​M을 대기음 : F12을 최종 세척 후. </li><li> F12을 : DMEM에 라미닌 2 ㎖ / 웰 (10 ㎍ / ㎖)에 추가하여 코트 비계. 5 % CO 2 험에서 37 ° C에서 접시를 품어2 시간 이상 동안 인큐베이터 idified. 따뜻한 DMEM 씻을 플레이트 : F12. </li><li> RMM + GF의 150 μL의 볼륨에 약 50 만 hNSCs 각 발판을 시드. </li><li> 세포가 지지체에 정착 할 수 있도록 5 % CO 2에서 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 3 시간 동안 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 비계에서 세포를 꺼 내려하지 각각의 잘 돌보는에 RMM의 3.5 ML을 추가합니다. </li><li> 7 일간 판을 품어; 일일 (제 1 급) 후 (3.5 ㎖ / 잘)과 RMM 매체를 대체 다시 제 1 급전 2 ~ 3 차례 일 후. </li><li> 칠일 후 매체 제거하고 면역 세포 화학 (ICC)에 대한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 세포를 수정하거나 / 웰 총 RNA 추출을위한 용해 시약 500 μL 추가 (≤ -80 ° C에서 저장 판 또는 총 RNA 추출로 진행) . </li></ol> 축삭 프로세스 파생물 1.2) 측정 <ol><li> 4 % PFA는 표준 ICC 프로토콜 (20) 사용하여 β에 따라 차별화 된 hNSCs 고정 얼룩3 튜 불린 (TUBB3) 형광 색소 결합 된 이차 항체 검출 차 항체. 훽스트 (1 μM)와 Counterstain과 세포 핵. </li><li> 형광 현미경을 사용하여 β3-tubulin에 염색 된 세포의 대표 이미지를 캡처; TIFF 나 JPEG 등의 이미지를 저장합니다. 소프트웨어 측정 도구 (예를 들어, 이미지 - 프로 플러스)를 이용하여 프로세스 축삭 생장의 측정. </li><li> 이미지 도구 모음에서 선택 측정 옵션을 열고 추적 기능을 선택합니다. </li><li> 추적을 시작하려면, 마우스 버튼을 클릭하여 축삭 가지의 시작점을 선택합니다. 축삭 가지의 전체 길이를 따라 추적; 오른쪽 각각의 추적을 완료합니다. 보기의 필드의 모든 축삭 outgrowthswith을 측정하기 위해 반복합니다. </li><li> 픽셀 μm의 (대기 보정 설정)으로 측정을 표현한다. 샘플 비교 및​​ 통계 분석을 위해 스프레드 시트 프로그램에 내보내기 길이 측정. </li></ol> 2. miRNA의 발현 줄기 세포를 사용하고발달 진학 집중 miRNA의 PCR 배열 2.1) miRNA의 총 RNA 추출 <ol><li> 비계 및 2D 성장 샘플에 miRNA의 추출을 수행합니다 (분화 및 분화, hNSC 제어). </li><li> 필요한 경우 해동 발판은, 12 웰 플레이트에 삽입. 최종 용적 용균 시약 1 ㎖, 1.5 ㎖의 에펜 도르프 동일한 튜브에서 2 웰의 세포 용해 시약 내용 (500 μL)를 결합한다. 잘 발판을 남겨주의하십시오. </li><li> 이전에 수집 된 건조 세포 펠렛 2D 성장 샘플 (차별화 된 hNSC 차원의 문화와 미분화 제어)의 경우 용해 시약 1 ㎖를 추가하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 내용을 전송합니다. </li><li> 1ml의 주사기 짧은 20-25 게이지 바늘을 사용하여 각 시험 시료 균질화. 균일 한 해물을 얻을 때까지 1 ml를 최대 5 번까지 주사기 사용 바늘을 통해 해물을 전달합니다. </li><li> 각 에펜 도르프 튜브에 클로로포름 200 μl를 추가하고 안전하게 모자. 반전과 소용돌이 튜브에내용을 섞는다. </li><li> 원심 분리기 ≥12,000 x g에서 15 분 동안 각 1.5 ml의 microcentrifuge 관 포함 균질. </li><li> 100 % 에탄올 750 μL를 함유하는 신선한 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브 (있는 계면, 핑크 색 액체 묻지 않도록) 각 시료의 상부 수성 상을 전송. 반전에 의해 철저하게 섞는다. </li><li> 2 ml의 수집 튜브 내의 미니 컬럼에, 임의의 침전물을 각각 포함하는 시험 샘플을 700 μL, 최대 피펫. 실온에서 약 30 초 동안 ≥8,000 XG에서 뚜껑과 원심 분리기를 닫습니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. 샘플의 나머지 부분을 사용하여이 단계를 반복합니다. </li><li> 15 분 동안 DNA 다이제스트를 수행합니다. </li><li> ≥8,000 × g으로 약 30 초 동안 미니 열 및 원심 분리기 700 μL 버퍼 RWT를 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 500 μL 버퍼 RPE를 추가하고 ≥8,000 × g으로 약 30 초 동안 원심 분리하여 미니 열을 씻으십시오. 흐름을 통해 폐기하십시오. 반복 wash.Ce1 분 ≥12,000 XG에 ntrifuge 더 막을 건조. </li><li> 미니 컬럼의 RNase가없는 물 40 μl를 첨가하고 ≥8,000 × g으로 1 분간 원심 분리하여 1.5 ml의 에펜 도르프 튜브에서 총 RNA를 용출시켰다. 적절한 분광 광도계의 도움으로 전체 RNA의 농도를 측정한다. </li></ol> 2.2) miRNA의 cDNA를 준비 <ol><li> 역 전사 마스터 믹스를 준비합니다. 각 샘플은 5 배 miScript HiSpec 버퍼 4 μL, 10 배 nucleics 믹스 2 μl를 요구, 2 μl의 효소 믹스를 역 miScript. </li><li> PCR 튜브에서 마스터 믹스 우스 8 μl의 총 RNA (250 NG)의 필요한 양을 추가하고, 20 μL의 최종 부피의 RNase가없는 물을 첨가 하였다. </li><li> miScript 역전사 효소 믹스를 불 활성화하기 위해 95 ° C에서 5 분 동안 37 ° C.Incubate에서 60 분 동안 품어. </li><li> -20 ° C에서 각각 20 μL 역전사 반응에 매장을 200 μL의 RNA 분해 효소가없는 물을 추가, 또는 실제 TI 진행나 바로 PCR. </li></ol> 2.3) 줄기 세포 및 발달 진학 miRNA의 PCR 배열 집중 <ol><li> 배 SYBR 녹색 마스터 믹스 1375 μL, 100 μL miRNA의 cDNA를 준비, 10 배 miScript 유니버셜 프라이머의 275 μL와의 RNase없는 물 (총 부피 2,750 μL) 1000 μl를 추가하여 15 ML 튜브에 PCR 구성 요소 믹스를 준비합니다. </li><li> PCR 로딩 저수지에 PCR 구성 요소 믹스를 전송합니다. 조심스럽게 밀봉 백에서 96 웰 플레이트 PCR 배열을 제거합니다. </li><li> 8- 채널 피펫 또는 단지 8 팁을 사용하여 12- 채널 피펫을 사용하여 PCR 어레이의 각 웰에 25 ㎕의 PCR 혼합물 성분을 추가한다. 우물 사이의 교차 오염을 방지하기 위해 각 피펫 팅 단계 다음 피펫 팁을 변경합니다. </li><li> 거품을 제거하기 위해 실내 온도 (15-25 ° C에서) 1,000 XG에서 1 분 동안 광학 접착 필름과 접시, 원심 분리기를 밀봉합니다. 시각적으로 기포가 우물에 존재하지 않는 확인하기 위해 아래에서 접시를 검사합니다. </li><li> 실시간 자전거 타는 사람의 96 웰 플레이트 PCR 배열을 놓습니다. </li><li> 프로그램 따라서 실시간 클러 : 10 분, 95 ° C에서 15 초간 45 사이클, 그리고 60 ℃에서 1 분 동안 95 ° C에서 1 사이클은 단일 (형광 데이터 수집)를 설정한다. </li><li> PCR 어레이 데이터 분석 템플릿 Excel 및 웹 기반 소프트웨어와 함께 사용하기위한 빈 Excel 스프레드 시트에 대한 모든 우물의 코네티컷 값을 내 보냅니다. 참고 : 소프트웨어에서 확인할 수있다 <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> . </li></ol> 3. 전산 분석 miRNA의 대상 예측 및 목표의 mRNA의 검증 리포터 플라스미드 형질과 Ddual 루시 페라 제 분석으로. 3.1) miRNA의 대상 예측을위한 전산 분석 <ol><li> 검색 PicTar ( <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ) 21 미르의 식별을 위해 온라인으로 제공 알고리즘NA는 예측의 mRNA를 대상으로. </li><li> &quot;척추 동물에 PicTar 예측 보려면 여기를 클릭&quot;을 클릭합니다. 새 페이지가 열립니다. </li><li> 새 페이지, PicTar 웹 인터페이스에서, 드롭 다운 메뉴에서 종을 선택하고 miRNA의 ID 상자에 관심의 miRNA를 삽입합니다. miRNA의의 대상에 대해 검색을 클릭합니다. </li><li> aPicTar 점수에 의해 평가 대상의 mRNA의 목록을 관찰합니다. 주 : PicTar 주어진 UTR 선택된 miRNA의 표적, 및 시드 상보성, 열역학 및 공동 (22)의 miRNA 발현의 세트에서 모든 표적에 대한 조합을 기반으로 예측 될 가능성을 반영하는 스코어를 계산한다. </li><li> 마찬가지로 DIANA-LAB (사용 대상의 mRNA의 목록을 검색 <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ) (23), 및 TargetScan ( <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a> 사용 가능한 회선에) 24, 대안을 알고리즘. </li><li> m의 비교 테이블을 컴파일iRNAs 다양한 소프트웨어 툴을 사용하여 수득 된 순위에 기초하여. PicTar 집계 PCT에 의해, 그리고 TargetScan (잡음비 및 예측 된 결과의 중요성을 평가하기위한 정밀한 점수 신호에 기초하여) 정밀도에 점수 DianaLab 의해 순위 (시드 상보성 결합 자유 에너지 보존 위에에게에 기초 다른 종), 표 1을 참조하십시오. </li></ol> 리포터 플라스미드 형질 및 듀얼 루시 페라 제 분석하여 대상의 mRNA 3.2) 검증. 참고 : mRNA를하고있다 목표의 검증을위한 3 &#39;UTR 루시 페라 제 기자는 이전 25 설명했다. <ol><li> 형질 <ol><li> / 웰로 24- 웰 플레이트에 105 세포의 밀도로 시드 HeLa 세포. </li><li> 형질 전환 시약 및 NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39;UTR 플라스미드 100 NG 하나의 1.5 μL뿐만 아니라, 20 nM의 miRNA의 모방 (SOX5 3 HSA-은 miR-96-5p 24 시간, 공동 트랜 헬라 세포 후(217); 물론 당 UTR 및 HSA-은 miR-7-5p, 각각 NR4A3 3 &#39;UTR을위한 HSA-은 miR-17-5p). </li><li> NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39;UTRplasmid 및 형광 색소 표시 음성 대조군 siRNA를와 공동 트랜 제어 우물. 형광 색소 표시 음성 대조군 siRNA를 함께 제어 우물의 형질 전환은 형질 전환 효율의 평가를 허용하고 모방 miRNA의 3&#39;UTR 바인드 특이성를 차지한다. </li></ol></li><li> 듀얼 루시 페라 제 활동의 측정 <ol><li> 반딧불과 레 닐라 루시퍼 활동 24 시간 게시물 형질을 측정합니다. 세포 성장 매체를 제거합니다. </li><li> 용액 10 ml의 I로 기재 I의 50 μl를 첨가하여 용액을 준비 작업 I; 잘 혼합. 내가 잘 각각 24로 작업 액의 300 μl를 추가합니다. </li><li> 물론 96 흰색 접시의 3 우물, 각 μL (100)에 각 24의 내용을 전송합니다. 10 분을 기다린 발광 획득을위한 루미 세트에 반딧불 루시 페라을 측정한다. </li><li> 작업 오디오 솔루션을 준비이온 II 솔루션 II 10 ㎖로 기판 II의 50 μl를 추가하여; 잘 혼합. 이미 작업 솔루션 I의 100 μl를 포함하는 각 96 우물에 작업 솔루션 I의 100 μl를 추가 </li><li> 10 분을 기다린 발광 획득을위한 루미 세트에 레 닐라 루시퍼을 측정한다. 레 닐라 루시퍼에 반딧불 루시 페라에서 발광의 비율을 계산합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

모든 저자는 직원, 재고 및 / 또는 ReNeuron 회사 또는 모회사의 스톡 옵션 보유자이다.이 연구는 ReNeuron (RENE.L)에 의해 지원되었다.

평가 및 줄기 세포의 분화를 향상시키기 시험관 내 분석의 새로운 개발은 항상 기능 및 치료 기능 연구를 위해 도전을 제시하고있다. 장기 및 체외 분화 분석에서 강력한 3D의 발전에 필요한 hNSCs 안정 첨부, 재료 및 구조 용어 특성이 다른 여러 3D 기판을 테스트함으로써 해결 하였다. 분석 개발의 일환으로 우리는 또한 최적의 세포 시딩 농도를 평가하고 비계가 라미닌이 코팅하기위한 요구 사항을 확인했다. 우리 hNSCs 저절로 따라 차별화 할 수 있지만 표준 2D 분화 hNSCs 비교할 때 축삭 프로세스 생장 의해 측정 4-OHT 및 성장 인자 제거, 3 차원 배양 시스템의 구현은 분화 능력에 상당한 개선을 보였다. 3D 유도 differe의 효과를 알아보고자hNSC의 miRNA 발현에 ntiation 우리는 PCR 배열을 사용했다. 표준 마이크로 어레이 칩과 비교하여 PCR 어레이는 관심의 miRNA의 직접적인 정량 및 유효성의 이점을 제공한다. PCR 어레이 (96)보다 여기 이하에 예를 들면 어레이 당 miRNA의 전체 수의 용어로 한정되어 있지만, 이는 앞서 줄기 세포 발달에보고 우리의 경우, 특히 관심의 miRNAs를 포함하도록 맞추어 질 수있다. 경로에 초점을 맞추고있는 miRNA의 발현은 미분화 hNSCs에 비해 3D 및 2D 차별화 hNSCs에 등장했다. 가장 현저히 하향 조절의 miRNAs는 선택 가능한 온라인 알고리즘 (DIANA 랩 PicTar 및 TargetScans)를 사용하여 그들의 기능 및 생물학적 해석을 결정하는 그들의 의도로 추정 대상의 mRNA를 평가하기 위해 분석 하였다. 하나의 miRNA는 목표의 수백을 인식 할 수있는 이런 이유로 우리는에 적합한 후보가 될 수있다 3 &#39;UTR mRNAsthat와 miRNA의 상호 작용을 검증xonal 규제. NR4A3, HSA-은 miR-7, 미르-17 가족의 목표는 해마 축색 돌기의 분화, 생존, 세포 사멸 및 규제에 참여, 표현의 수준에 따라 NR4A 가족 핵 수용체의 구성원 인 안내 (26). 마찬가지로 SOX5, HSA-은 miR-96의 타겟은, 신경 전구 세포 (27)의 길이 엑손 28, 이주 후 이동성 분화, 및 신경 돌기 (29)의 세포주기 진행을 조절하는 것으로보고되어있다. SOX5 및 NR4A3 모두 HSA-은 miR-96의 직접적인 대상 mRNA의 식별 및 듀얼 루시페라아제 기자 분석하여 각각 HSA-은 miR-7, 17되었다. 듀얼 루시퍼 라제 (개똥 벌레 및 레 닐라)은 동일한 두 개의 서로 다른 플라스미드에 리포터 유전자에 의존하고 차선 형질 번의 루시페라아제 플라스미드 시스템과 비교하여 세포 독성 효과에 의한 영향에 대한 정규화를 허용하는 개선 된 시스템을 제공한다. 우리의 분석 개발의 일환으로 우리는 또한 우리의 형질 컨디셔닝을 최적화순서 기능은 높은 효율을 얻을 수있다. protocolsdescribed은 여기에 더 최적화 및 전임상 연구와 미래의 임상 응용 프로그램에 대한 intransplantation 프로토콜을 beimplemented 수 있습니다 체외 hNSC 분화의 특성을 악용 할 수 있습니다.

줄기 세포 연구는 조직 공학, 발달 세포 생물학, 세포 치료제, 유전자 치료 분야에 걸쳐 재생 의료에서​​ 중심적인 역할을하고, 바이오 물질 (지지체와 매트릭스). 줄기 세포는 모두 developmentand 장기의 조직 복구에 중요하다; 줄기 세포가 어떻게 작동하는지 이해하는 새로운 줄기 세포 기반 치료 (1) 개발을위한 중추적입니다. CTX0E03 먼저 임신 인간 태아의 대뇌 피질에서 분리 된 클론, 조건부 불후의 인간 신경 줄기 세포 (hNSC) 줄입니다. CTX0E03 좋은 제조 기준 (GMP) 3에서 임상 세포 은행에 필수적인 품질 특성을 정의했습니다. HNSCs 자발적 신경 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포로 분화 할 수 있으며 국소 허혈 2,4,5의 쥐 모델에 이식 할 때 신경 학적 결손을 개선하기 위해 입증되었습니다. CTX0E03 hNSCs 뇌졸중 장애인들에 대한 임상 시험에서 현재성만 (NCT01151124 6 NCT02117635, Clinicaltrials.gov). miRNAs의 길이는 평균 22 개 뉴클레오티드를 가지며 분자 규제 7 입증 이들은 단백질을 인코딩하지 않고, 단백질로 번역 안정성 및 조절, mRNA를 3 프라임 번역 영역 (3&#39;UTR)를 결합한다. 개발의 miRNAs는, 증식 및 분화를 포함하여 8 세포 프로세스의 개수의 조절에 참여하는 것으로보고되고있다. 몇몇의 miRNAs는 신경줄 기세포 (9)의 거동 및 명세서 조절에 연루되어왔다. 표준 배양 환경 이차원 (2D)에서 생체 내 환경의 복잡성이 일치하지 않고, 따라서 hNSC 분화 유도 및 조절은 최적이 아니다. 생체 내에서, 세포는 다른 작곡 삼차원 (3D) 미세 둘러싸여 많은을 포함하여 세포와 세포 외 리간드,콜라겐, 라미닌, 기타 기질 단백질 (세포 외 기질, ECM)의 유형. 이전의 연구보고 한 그 ECM의 자신의 형상에 영향을 미치는 세포 표현형과 운명 10 ~ 15을 흉내 낸 재료의 건축 지형. 시중에서 판매하는 3 차원 인공 지지체의 숫자는 사용할 수 있습니다; 우리는 세포가 침입 16-18을 차별화 할 수있는에 3D 공간을 제공하는 200 μm의 두께 막에 잘 정의 된 균일 한 구조로 설계 다공성 폴리스티렌 발판을 사용했다. 여기에서 2D 및 3D 분화 분석은 axonprocess 파생물을 평가하는 데 사용됩니다. 더욱이, 우리는 또한 그것의 분화 된 miRNA에 미치는 영향을 조사하는 임상 등급 hNSC 라인의 miRNA 발현 프로파일 링 방법을 서술. 여기에 도시 된 방법은 원래 19에 기재된 것들에 기초한다.

<table><tbody><tr><td>DMEM:F12</td><td>Invitrogen</td><td>21331-020</td><td>RMM 매체 준비용</td></tr><tr><td>인간 알부민 용액&nbsp;</td><td>박스터 헬스케어 리미티드&nbsp;</td><td>1501052</td> 최종 <td>농도에서 사용되는 RMM 매체의 경우&nbsp; 0.03%</td></tr><tr><td>트랜스페린, 인간 재조합</td><td>시그마</td><td>T8158</td><td>최종 농도에서 사용되는 RMM 매체의 경우&nbsp; 5 &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>Putrescine DiHCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>최종 농도에서 사용되는 RMM 매체의 경우&nbsp; 16.2 &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>인슐린, 인간 재조합&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td>최종 농도에서 사용되는 RMM 매체의 경우&nbsp; 5 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>프로게스테론&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td>최종 농도에서 사용되는 RMM 매체의 경우&nbsp; 60 ng/ml</td></tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030-24</td> 최종 <td>농도에서 사용되는 RMM 매체용&nbsp; 2 mM</td></tr><tr><td>나트륨 셀레나이트&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>최종 농도 40 ng/ml bFGF에서 사용되는 RMM 매체용</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td>는 <td>RMM 매체에 추가될 예정이며, 최종 농도 10 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF에서 사용됩니다. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-188</td><td>RMM 매체에 첨가, 최종 농도 20 ng/ml에서 사용</td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>RMM 매체에 첨가, 최종 농도 100</td></tr><tr><td>nM Laminin</td><td>AMS Biotech</td><td>3400-010-10</td><td></td></tr><tr><td>TrypZean/EDTA</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>BE02-034E</td><td></td></tr><tr><td>관개용 물</td><td>Baxter Healthcare</td><td>UKF7114</td><td></td></tr><tr><td>정의 트립신 억제제(DTI) (저장 -20°C; C)</td><td>Invitrogen</td><td>R007-100</td><td></td></tr><tr><td>Alvetex 12 웰 플레이트&nbsp;</td><td>Reinnervate Ltd</td><td>AVP002</td><td></td></tr><tr><td>에탄올&nbsp;</td><td>머크&nbsp;</td><td>1.00986.1000</td><td></td></tr><tr><td>&베타; III 튜불린 항체</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy 미니 키트</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td>217004</tr><tr><td>RNase free DNase&nbsp;</td><td>키아겐&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT 키트&nbsp;</td><td>키아겐&nbsp;</td><td>218160</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 녹색 PCR 키트</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td>218073</tr>세포 <tr><td>개발 & 차별화 miScript miRNA PCR 어레이</td><td>Qiagen/ SABiosciences</td><td>MIHS-103Z</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 화이트 96 플레이트</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729692001</tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp; 밀봉 호일</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729757001</tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Vector NR4A3 miRNA 3' UTR 타겟 클론&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT019538-MT0</td><td></td></tr><tr><td>벡터 SOX5 miRNA 3' UTR 타겟 클론&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT017632-MT01</td><td></td></tr><tr><td>Allstars 음성 대조군 siRNA AF 488(Qiagen).</td><td>키아겐&nbsp;</td><td>1027284</td><td>MiRNA 형질주입 제어</td></tr><tr><td>Luc-Pair miR Luciferase Assay</td><td>GeneCopeia</td><td>LPFR-M010</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GloMax 96 마이크로플레이트 발광계&nbsp;</td><td>프로메가</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3 차원 문화, 마이크로 rna의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

신경 줄기 세포 (NSCs의)는 특정 지역의 미세 환경에서 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포로자가 재생과 분화 할 수있다. 여기에서 우리는 현재 스트로크 장애 (NCT01151124과 NCT02117635, Clinicaltrials.gov)에 대한 임상 시험에서, 삼차원 (3D) 분화와 클론 인간 신경 줄기 세포 (hNSC) 라인의 miRNA의 분석에 사용되는 방법의 세트를 제시한다. HNSCs 윤리적 승인 임신 초기 인간 태아의 대뇌 피질에서 파생 된 조건부로 구성 C-mycER TAM의 단일 사본의 레트로 바이러스 통합을 사용하여 불후되었다. 우리는 3 차원 인공 지지체 방법 PCR 배열을 사용하여 miRNA의 발현에 관련된 변화를 정량화하는 방법에 차별화 된 hNSCs의 축삭 공정 부산물을 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 또한 우리의 miRNA를 추정 대상을 선택하는 목적으로 전산 분석을 예시. SOX5 및 NR4A3 크게 선택의 적합 miRNA의 추정 대상으로 확인되었다 하향 조절차별화 된 hNSC에서 D의 miRNA. miRNA의 대상 유효성 검사 듀얼 기자 플라스미드 형질 전환 및 듀얼 루시페라아제 분석에 의해 SOX5과 NR4A3 3&#39;UTRs 실시 하였다.

그림 1에서 전통적인 평면 문화 (2D)에 비해 3 차원 인공 지지체에 hNSC 차별화의 조사 및 정량을 시각화하고 축삭 프로세스 가지 측정을 expressedas된다. 도 2에서 representedthe 흐름 및 줄기 세포를 이용하여 miRNA의 정량화 결과이며 발달 경로 미분화 대조군과 비교 2D 및 3D 차별화 hNSCs에서의 miRNA 발현의 차이를 조사하기 위해 PCR miRNA의 배열을 집중. 차별화되고 미분화 hNSCs 및 목표 예측, SOX5 및 NR4A3 (NOR1)에 대한 전산 분석과 다음 miRNA의 비교 분석은 추정 대상의 mRNA로 확인되었다. miRNA가 우리가 SOX5 또는 NR4A3 3&#39;UTR 시퀀스를 포함하는 2 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 반딧불이 루시퍼 라제 리포터 유전자의 하류에 삽입 사용 3&#39;UTR의 mRNA에 자신의 추정 위치 사이의 직접적인 상호 작용을 연구하는<html> ND 정상화 동일한 플라스미드 레 닐라 루시퍼 라제 유전자에 함유. 3 &#39;UTR 루시 페라 제 활동 하향 조절의 대표적인 결과는 그림 3에 제시되어있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> 그림 1 :. 3 차원 인공 지지체에 hNSCs의 분화 및 축삭 과정 ES 가지의 측정 (A) β3-tubulin의 (녹색)과 훽스트 (파란색) 대표 현미경 사진으로 대조 핵에 대한 표준 ICC 염색에 따라 취득하고 축삭 프로세스의 측정했다 이미지 분석 소프트웨어의 도움으로 수행 하였다. (B) 1 (1W) 또는 3주 (3W)에 대해 차별화 된 2D 및 3D hNSCs 수행 축삭 프로세스 생장의 측정을보고하는 다이어그램.COM / 파일 / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> 그림 2 :. 차별화 된 hNSCs에서 miRNA의 프로파일 링의 도식 워크 플로우 총 RNA, miRNA에 포함하여, 3 차원 지지체 및 표준 2D 문화, 또는 분화 제어에 차별화 된 hNSCs 하나에서 추출 하였다. 총 RNA 250 NG 복고 전사 인간의 세포 분화 및 개발 miScript의 miRNA PCR 어레이와의 miRNA 정량에 적합한의 cDNA로 성숙의 miRNA의 선택적 전환을 용이하게하는 방법이었다. SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A 및 RNU6-2의 지리적 평균 -ΔΔct이 방법에 따른 데이터 분석에 이용 하였다. 중요한 변화는 역으로 접어 +/- 1.5 아래 규제로 정의 하였다tistically 상당한 정도. 데이터는 clustergram로 표현 가능한 결과를 웹 기반 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 그림 3 (19)에서 수정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> 그림 3 : miRNA의 대상 유효성 검사는 듀얼 루시 페라 보고서 분석을 이용하여 mRNA의 예측. (A)의 miRNA의 직접적인 대상으로 3&#39;UTR 서열을 확인하는 툴로서 사용 듀얼 루시퍼 라제 리포터 플라스미드의 대표적인 다이어그램. (B) 트랜 스펙 션 효율을 나타내는 대표 현미경 사진. (C) &#160; 신호들은 인간 및 # 3에서, 상대적인 루시페라아제 활성으로 표현39; UTR 기자 ofSOX5 및 NR4A3 유전자는 크게 HSA-은 miR-96의 존재에 무너 뜨렸다하고, HSA-은 miR-7과 17의 miRNA 모방은 각각. 그림 5 (19)에서 수정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> miRNA의 </td><td> 표적 유전자 </td><td> 표적 부위는 / 유전자 발견 </td><td> 정확 </td><td> 점수 </td><td> 집계 P CT </td></tr><tr><td> HSA-은 miR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 763분의 1,214 </td><td> (1) </td><td> 6.74 </td> &lt;TD&gt; 0.94 </td></tr><tr><td> HSA-은 miR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 190분의 302 </td><td> 0.72 </td><td> 4.75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> HSA-은 miR-302A </td><td> NR4A3 </td><td> 473분의 863 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-은 miR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 794분의 1,358 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> HSA-은 miR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> HSA-은 miR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 136분의 399 </td><td> 0.17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> HSA-은 miR-20A </td><td> NR4A3 </td><td> 841분의 1,650 </td><td> 0.85 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><strong&gt; HSA-은 miR-20B </td><td> NR4A3 </td><td> 973분의 1,955 </td><td> 0.9 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> HSA-은 miR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 961분의 1,928 </td><td> 0.9 </td><td> 5.38 </td><td> 0.63 + 0.37 </td></tr><tr><td> HSA-은 miR-20A </td><td> EIF4G3 </td><td> 841분의 1,650 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-은 miR-20B </td><td> EIF4G3 </td><td> 973분의 1,955 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-은 miR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 961분의 1,928 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> 표 1 : miRNA의 표적 예측의 mRNA의 목록. miRNAs의 대표 테이블이, 예측 유전자를 표적으로하고, 분석 알고리즘 (예측이온 / 점수 / 총 각각 다이애나 연구소, PicTar 및 TargetScan를 사용하는 경우). 표 3 (19)에서 수정.

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

다음 실험의 전체적인 목표는 인간 신경 줄기세포주의 분화 마이크로 RNA 프로파일링 및 표적 mRNA 검증을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 인간 신경 줄기세포를 3차원 배양 시스템에서 배양하여 세포 분화를 유도합니다. 두 번째 단계로는 축삭 돌기 성장을 측정하여 분화 정도를 정량화합니다.다음으로, micro RNA 발현의 변화를 micro R-N-A-P-C-R 어레이로 평가합니다. 이후 선택된 차등 발현 microRNA에 대한 컴퓨터 분석을 수행하여 추정 표적 mRNA 세트를 식별합니다. 최종적으로, 리포터 플라스미드, 형질전환 및 dual luciferase assay를 통해 표적 mRNA를 검증합니다.따라서 여기서 제시할 방법은 분화 과정에 있는 인간 신경 줄기세포에서 발현되는 microRNA의 특성 분석과 이들이 표적으로 삼는 messenger RNA 확인과 같이 신경 줄기세포 분야의 핵심 쟁점들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 신경 줄기세포 생물학에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 중간엽 줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 분화 유도 및 분자적 특성 분석이 필요한 다른 줄기세포 시스템에도 적용될 수 있습니다.이 방법의 시각적 시연에서는 인간 신경 줄기세포주의 분화, microRNA 프로파일링 조사 및 표적 mRNA 검증의 핵심 단계들을 상세히 설명하며, 실험실의 과학자인 lavania가 절차의 일부를 시연할 것입니다. 전체 과정은 무균 기술을 사용하여 생물학적 안전 작업대 내에서 수행해야 합니다. AL VX 12의 각 웰에 첨가하여 스캐폴드를 재수화하십시오.관수용 물로 조제한 70% ethanol 2 mL를 웰 플레이트에 분주합니다. 70% ethanol을 각 웰의 벽면을 따라 분주하여 스캐폴드에 직접 닿지 않도록 주의하십시오. 70% ethanol을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 즉시 웰당 2 mL의 D-M-E-M-F 12로 스캐폴드를 1분 동안 세척합니다.세척 과정을 두 번 반복하고, 마지막 세척 후 D-M-E-M-F 12를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 각 웰에 D-M-E-M-F 12에 희석된 라미닌 2 mL를 첨가하여 스캐폴드를 코팅합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 최소 2시간 동안 배양합니다.다음으로, 따뜻한 D-M-E-M-F 12로 플레이트를 세척하고, 성장 인자가 포함된 150 µL의 RMM 배지 부피로 각 스캐폴드에 약 500,000개의 인간 신경 줄기세포(H nscs)를 분주합니다. 세포가 스캐폴드 내에 안착할 수 있도록 플레이트를 3시간 동안 배양합니다. 3시간 후, 스캐폴드에서 세포가 떨어지지 않도록 주의하며 각 웰에 3.5 mL의 RMM을 첨가합니다.플레이트를 7일 또는 21일 동안 배양합니다. 하루 뒤에 RMM 배지를 교체하며, 이것이 1차 급이(feeding)가 됩니다. 1차 급이 후 2~3일 뒤에 배지를 다시 교체합니다. 이는 H nscs의 3D 배양 후 7일 및 21일이 경과한 시점입니다.RMM 배지를 제거하고 분화된 세포를 4%paraform aldehyde로 고정합니다. 고정된 세포는 형광색소가 결합된 beta three tubulin 1차 항체를 사용하여 염색하며, 세포핵은 hooks로 대조염색합니다.beta three tubulin으로 염색된 세포의 대표 이미지를 캡처합니다. 형광 현미경을 사용하여 이미지를 TIFF 또는 JPEG 형식으로 저장합니다. 축삭 돌기 성장 측정은 image PRO plus seven 소프트웨어 측정 도구를 사용하여 수행합니다.먼저 이미지를 열고, 툴바에서 측정 옵션을 선택한 후 trace 기능을 선택하십시오. 트레이싱을 시작하려면 마우스 버튼을 클릭하여 축삭 돌기(axon outgrowth)의 시작 지점을 지정하고, 축삭 돌기의 전체 길이를 따라 트레이싱한 후 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 각 트레이싱을 완료하십시오. 이러한 방식으로 시야 내의 모든 축삭 돌기를 측정하며, 측정값은 픽셀 또는 µm 단위로 표시하십시오.3차원 배양된 HSC의 micro RNA 발현 변화를 평가하기 위해, 샘플 비교 및 통계 분석을 위한 스프레드시트 프로그램으로 길이 측정값을 내보내십시오. 먼저 동봉된 프로토콜에 설명된 대로 micro RNA 추출 및 micro RNA cDNA 준비를 수행하십시오. micro RNA cDNA를 획득한 직후에 텍스트 작업을 수행하십시오.15 milliliter 튜브에 실시간 PCR을 위한 PCR 성분 혼합물을 준비합니다. 2 X-S-Y-B-R green master mix 1375 microliters, micro RNA CD NA 100 microliters, universal primer 275 microliters 및 RNAs free water 1000 microliters를 첨가하여 옮깁니다.PCR 구성 성분을 PCR 로딩 리저버에 혼합합니다. 밀봉된 봉투에서 96웰 플레이트 PCR 어레이를 조심스럽게 꺼냅니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 PCR 구성 성분 25 µL를 첨가합니다.PCR 어레이의 각 웰에 혼합합니다. 웰 간의 교차 오염을 방지하기 위해 각 피펫팅 단계 후에 피펫 팁을 교체하십시오. 광학 접착 필름으로 96-웰 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 1000 GS로 1분 동안 원심 분리하여 기포를 제거하십시오. 플레이트를 육안으로 검사하여 웰 내에 기포가 없는지 확인하십시오.리얼타임 사이클러 프로그램 내의 96 웰 플레이트 PCR 어레이입니다. 리얼타임 사이클러를 이에 따라 설정합니다. 이후, 모든 웰의 CT 값을 빈 Excel 스프레드시트로 내보내 PCR 어레이 데이터 분석을 수행하며, 예측된 micro RNA 타겟의 식별을 위해 온라인에서 이용 가능한 알고리즘인 PIC ktar를 사용합니다.척추동물의 pic ktar 예측을 위해 여기를 클릭하면 PIC KTAR 웹 인터페이스의 새 페이지가 열립니다. 드롭다운 메뉴에서 종을 선택하고 micro RNA ID 상자에 관심 있는 micro RNA를 입력하십시오. micro RNA의 타겟 검색을 위해 search를 클릭하십시오.PIC KTAR 점수에 따라 순위가 매겨진 표적 mRNA 목록이 제시됩니다. 이렇게 얻은 순위는 microRNA의 비교 표를 작성하는 데 사용됩니다. 표적 mRNA를 검증하기 위한 도구로 듀얼 루시퍼레이스 리포터 플라스미드가 사용되며, HeLa 세포 형질전환 24시간 후에 반딧불이 루시퍼레이스 및 레날 루시퍼레이스 활성을 측정합니다.기질 50 µL를 용액 1 10 mL에 첨가하여 잘 섞어 작업 용액 1을 준비합니다. 24웰 플레이트의 각 웰에서 세포 배양액을 제거하고, 각 웰에 작업 용액 1 300 µL를 첨가합니다. 24웰 플레이트 각 웰의 내용물 100 µL를 96웰 플레이트의 3개 웰로 옮깁니다. 10분 동안 대기한 후, 발광 측정으로 설정된 루미노미터(luminometer)를 사용하여 반딧불이 루시페라제(firefly luciferase) 활성을 측정합니다.기질 50 µL와 용액 2 10 mL를 추가하고 충분히 혼합하여 작동 용액 2를 준비합니다. 작동 용액 1 100 µL가 이미 들어 있는 96웰 플레이트의 각 웰에 작동 용액 2 100 µL를 추가합니다. 10분 동안 기다린 후 renal el luciferase 활성을 측정합니다.이어서, 반딧불이 루시페라아제와 신장 루시페라아제에서 발생하는 발광 비율을 계산합니다. 3D 스캐폴드 상의 H NSCS에 대해 녹색으로 표시된 beta three tubulin의 면역화학 염색과 파란색으로 표시된 nuclei counter stain with hooks를 실시하여 대표적인 현미경 사진을 촬영하였으며, 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 축삭 돌기(axon process)의 측정을 수행하였습니다. 3D 스캐폴드에서 배양된 H nscs와 기존의 평면 표면 또는 2D 배양 간의 축삭 돌기 성장 비교 결과, 1주 또는 3주 차에서 3D 분화 HSCs가 더 높은 축삭 돌기 성장을 보였습니다.표적 예측을 위한 전산 분석 결과, microRNA의 예측 표적 유전자 목록과 정밀도 점수 및 합계 값이 여기에 제시된 바와 같이 도출되었습니다. SOX5와 NR4A3가 추정 표적 유전자로 확인되었습니다. 여기에 나타난 것과 같이, 이중 루시퍼레이스 리포터 어세이를 사용하여 microRNA의 표적을 검증하였습니다.지정된 microRNA가 존재할 때, SOX5 및 NR4A3 유전자의 인간 3' UTR 리포터로부터 측정된 상대적 루시퍼레이즈 활성이 유의하게 감소되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 신경줄기세포에서 이를 분화시키고 microRNA 발현을 조사하며 표적 mRNA를 검증하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

differentiation-human-neural-stem-cell-line-on-three-dimensional

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 3차원 골격 내에서 인간 신경 줄기 세포의 발달과 분화를 보여줍니다. 골격의 라미닌 코팅은 세포 부착을 촉진하고, 성장 인자를 사용하지 않는 신경 매질은 세포가 신경 전구 세포로 분화되도록 유도하여 다공성 구조 내에서 여러 방향으로 프로세스를 확장하여 3차원 배양을...

다공성 스캐폴드를 사용하여 인간 신경 줄기 세포를 3D 배양으로 분화

이 비디오는 인간 배아 줄기 세포(hESCs)가 영양 세포나 중간 단계를 사용하지 않고 신경 전구 세포로 직접 분화되는 과정을 보여줍니다. 뼈 형태 유전 단백질(BMP)의 선택적 억제와 성장 인자-베타 또는 TGF-β 신호 전달 경로의 변형은 hESC를 신경 전구 세포(NPC)로 분화시킵니다.

인간 배아 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화

이 비디오는 비형질전환 및 형질전환 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 신경전구세포의 생성을 보여줍니다. hPSC는 신경세포 분화 배지를 사용하여 신경전구세포로 분화됩니다. 분화는 작은 분자를 사용하여 비형질전환 세포에서 유도되는 반면, 형질전환 hPSC는 뉴런 분화 특이적 전사 인자를 위해 프로모터를 유도하는 항생제를 첨가하여 분화됩니다.

Non-Transgenic 및 Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells (비유전자 변형 및 형질전환 인간 만능 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화)

이 비디오에서는 인간 배아 줄기 세포를 신경 오가노이드로 만드는 단계적 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법은 신경 로제트 형성을 유도한 다음 조절된 성숙 및 소수성 막에서 최종 배양하여 완전히 발달된 신경 오가노이드를 달성하는 것을 포함합니다.

인간 배아 줄기세포(human embryonic stem cells)를 신경 오가노이드(Neural Organoids)로 분화하고 성숙시키다

직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

우리는 두 개 또는 세 개의 차원 배양체를 발생시키기위한 뮤린 배아 줄기 세포를 사용하는 기술을 설명한다. 우리는 다음 전구 세포 마커 면역과 면역에 의해 분화의 상태를 분석하기 위해 레티노 산, 방법에 의한 배아 신체 세포의 신경 분화를 유도하는 방법을 설명합니다.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 약물 및 화학 스크리닝 및 신경 독성을 포함한 독성 시험을위한 새로운 시험 관내 모델 개발을위한 강력한 도구로 간주됩니다. 여기, hiPSCs의 뉴런과 glia 로의 차별화에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

우리는 매달려 드롭 방법을 사용하여 신경 세포로 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화에 대한 절차를 설명합니다. 또한 RT-qPCR, 면역형광, RNA-seq 및 유동 세포종을 통해 포괄적인 현상 분석을 수행합니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

이 연구는 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위, 활성 산소 종 수준, 미토콘드리아 호흡 사슬 조성 및 미토콘드리아 DNA의 변화를 감지하기 위해 두 개의 형광 리포터 또는 항체를 사용한 유세포 분석 및 이중 염색을 기반으로 여러 미토콘드리아 기능 매개 변수를 측정하는 새로운 접근 방식을보고합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석

배우세요 인간 신경 줄기 세포의 3차원 배양 및 분화 과정에서 microRNA 발현 변화를 PCR 어레이로 분석하고, 컴퓨터 분석과 이중 루시퍼라제 검정으로 표적 mRNA를 검증하는 방법을. 이 기술은 줄기세포 생물학 연구에 활용됩니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

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