3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

다음 실험의 전반적인 목표는 인간 신경 줄기 세포주의 분화 마이크로 RNA, 프로파일링 및 표적 Mr.NA 검증을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 세포 분화를 유도하기 위해 3차원 배양 시스템에서 인간 신경 줄기세포를 배양함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 축삭돌기 성장(axon process outgrowth)을 측정하여 분화를 정량화하는 것입니다.

다음으로, 마이크로 RNA 발현의 변화는 마이크로 R-N-A-P-C-R 어레이에 의해 평가됩니다. 그런 다음 차등적으로 발현된 선택된 microRNA의 컴퓨터 분석을 수행하여 추정되는 표적 mRNA 세트를 식별합니다. 궁극적으로 타겟 mRNA는 리포터 플라스미드, transfection 및 이중 루시퍼라제 분석으로 검증됩니다.

따라서 여기에 제시된 방법은 발현된 microRNA의 특성화와 같은 신경 줄기 세포 분야의 주요 문제에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 분화를 진행할 때 인간 신경 줄기 세포의 메신저 RNA를 표적으로 합니다. 이 방법은 신경 줄기 세포 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 중간엽 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 또는 분화 유도 및 분자 특성화가 필요한 기타 시스템과 같은 다른 줄기 세포 시스템에도 적용할 수 있습니다.

이 방법의 시각적 시연은 인간 신경 줄기 세포주의 분화에 중요한 단계를 세분화하고 microRNA 프로파일링 및 표적 mRNA의 검증을 조사하는 절차의 일부를 제 실험실의 과학자인 lavania가 보여줄 것입니다. 이 전체 절차는 무균 기술을 사용하여 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. AL VX 12의 각 웰에 추가하여 스캐폴드를 재수화합니다.

관개를 위해 물을 사용하여 준비된 70% 에탄올 2밀리리터의 웰 플레이트. 각각의 벽 아래로 70% 에탄올을 분배하여 비계를 만지지 마십시오. 70 % 에탄올을 조심스럽게 흡인하고 즉시 D-M-E-M-F 12 1 분 동안 2 밀리리터로 골격을 씻으십시오.

세척 절차를 두 번 반복하고 최종 세척 후 D-M-E-M-F 12를 조심스럽게 흡인합니다. D-M-E-M-F 12에 2ml의 라미닌을 각각 첨가하여 골격을 코팅합니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 최소 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.

다음으로, 성장 인자가있는 150 마이크로 리터의 RMM 배지 부피에서 약 500, 000 개의 인간 신경 줄기 세포 또는 H nscs가있는 따뜻한 D-M-E-M-F 12 종자로 플레이트를 씻습니다. 플레이트를 3시간 동안 배양하여 3시간 후에 세포가 골격에 정착할 수 있도록 합니다. 각 웰에 3.5ml의 RMM을 추가합니다.골격에서 세포가 빠지지 않도록 주의하십시오.

플레이트를 7일 또는 21일 동안 배양합니다. 첫 번째 수유인 하루 후에 RMM 배지를 교체하고 첫 번째 수유 후 2-3일 후에 배지를 다시 교체하십시오. H nscs의 3D 배양 후 7 일과 21 일.

RMM 배지를 제거하고 분화된 세포를 4% 파라폼 알데히드로 고정합니다. 그런 다음 형광 색소가 접합된 것으로 검출된 베타 3 튜불린 1차 항체를 사용하여 고정된 세포를 염색합니다. 2차 항체 세포핵은 후크로 counterstain됩니다.

베타 3 튜불린 염색 세포의 대표 이미지를 캡처합니다. 형광 현미경을 사용하여 이미지를 TIFF 또는 JPEG 형식으로 저장합니다. 축삭돌기 성장의 측정은 image PRO plus seven 소프트웨어 측정 도구를 사용하여 수행됩니다.

이미지를 열려면 도구 모음에서 측정 옵션을 선택하고 추적 기능을 선택합니다. 추적을 시작하려면 축삭 돌출물의 전체 길이를 따라 마우스 버튼 추적을 클릭하여 축삭 돌출부의 시작점을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 각 추적을 완료합니다. 이러한 방식으로 시야 내의 모든 축삭 돌출물을 측정하고 측정값을 픽셀 또는 마이크로미터로 표현합니다.

3차원 배양 HSC의 마이크로 RNA 발현 변화를 평가하기 위한 샘플 비교 및 통계 분석을 위해 길이 측정을 스프레드시트 프로그램으로 내보냅니다. 먼저 함께 제공된 프로토콜에 설명된 대로 micro RNA 추출 및 micro RNA CD NA 준비를 수행합니다. 마이크로 RNA CD NA를 얻은 직후의 텍스트.

15ml 튜브에서 real-time PCR을 위한 PCR 성분 혼합물을 준비합니다. 1375마이크로리터의 X-S-Y-B-R 그린 마스터 믹스 2개를 추가합니다. 100 마이크로 RNA CD NA 275 마이크로 리터 범용 프라이머 및 1000 마이크로 리터의 RNA는 물 이동을 자유롭게 할 수 있습니다.

PCR 성분은 PCR 로딩 저장소로 혼합됩니다. 밀봉된 백에서 96웰 플레이트 PCR 어레이를 조심스럽게 제거합니다. 다중 채널 피펫터를 사용하여 25마이크로리터의 PCR 성분을 추가합니다.

PCR 어레이의 각 웰에 혼합합니다. 웰 밀봉 사이의 교차 오염을 방지하기 위해 각 피펫팅 단계에 따라 피펫 팁을 교체하십시오. 광학 접착 필름이 있는 96웰 플레이트와 실온에서 1000GS에서 1분 동안 원심분리기를 사용하여 기포를 제거하고 플레이트를 육안으로 검사하여 웰 위치에 기포가 없는지 확인합니다.

실시간 사이클러 프로그램의 96웰 플레이트 PCR 어레이. 그에 따라 실시간 사이클러. 그런 다음 PCR 어레이 데이터 분석을 위해 모든 웰의 CT 값을 빈 Excel 스프레드시트로 내보내고, 온라인에서 사용할 수 있는 알고리즘인 PIC ktar는 예측된 마이크로 RNA 표적을 식별하는 데 사용됩니다.

척추동물에 대한 그림 ktar 예측을 보려면 여기를 클릭하여 PIC KTAR 웹 인터페이스에서 새 페이지를 엽니다. 드롭다운 메뉴에서 species를 선택하고 micro RNA ID 상자에 관심 있는 micro RNA를 삽입합니다. 마이크로 RNA의 표적을 찾기 위한 클릭.

PIC KTAR 점수에 의해 순위가 매겨진 타겟 mRNA 목록이 제시됩니다. 얻어진 순위는 microRNAs의 비교표를 작성하기 위하여 그 때 이용된다. 이중 루시페라제 리포터 플라스미드는 타겟 mRNA를 검증하기 위한 도구로 사용되며, 헬라 세포의 transfection 후 24시간 후에 반딧불이 및 신장 루시페라아제 활성을 측정합니다.

50 마이크로 리터의 기질, 10 밀리리터의 용액 1을 첨가하고 철저히 혼합하여 24 웰 플레이트의 각 웰에서 세포 성장 매체를 제거하고 300 마이크로 리터의 작업 용액을 각각 하나씩 첨가하여 작업 용액 1을 준비합니다. 각 웰의 내용물 100 마이크로 리터를 잘 옮깁니다. 24웰 플레이트에서 96웰 플레이트의 3웰 중 10분 동안 기다린 다음 발광 획득을 위해 설정된 광도계에서 반딧불이 루시퍼라제 활성을 측정합니다.

50 마이크로 리터의 기판, 2-10 밀리리터의 용액 2를 첨가하고 철저히 혼합하여 작업 용액 2를 준비합니다. 이미 100마이크로리터의 작업 용액이 들어 있는 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 작업 용액 2를 추가합니다. 10분 동안 기다린 다음 신장 엘 루시페라아제 활성을 측정합니다.

그 후, 반딧불이 루시퍼라제(firefly luciferase)와 신장 루시퍼라아제(renal luciferase)의 발광 비율을 계산합니다. 3D 스캐폴드에서 H NSCS의 대표적인 마이크로 사진은 이미지 분석 소프트웨어의 도움으로 녹색으로 표시된 베타 3 튜불린과 파란색으로 표시된 후크가 있는 핵 카운터 염색에 대한 면역화학 염색 후 획득했습니다. 3D 골격으로 성장한 H nscs와 기존의 평평한 표면 또는 2D 배양 간의 축삭돌기 성장량을 비교한 결과, 1주 또는 3주에 3D 분화된 HSC가 더 큰 축삭돌기 성장량을 보였다.

표적 예측을 위한 컴퓨터 분석을 통해 여기에 제시된 정보, 즉 microRNA 목록, 예측 표적 유전자 및 정밀도, 점수 및 응집체 값을 얻을 수 있습니다. SOX 5 및 NR 4 A 3은 추정 표적 유전자로 확인되었습니다. 여기에 나타난 바와 같이 microRNA의 표적을 검증하기 위해 이중 루시퍼라제 리포터 분석법을 사용하였다.

SOX 5 및 NR 4 A 3 유전자의 인간 3 프라임 UTR 리포터로부터의 상대적인 루시페라제 활성은 지시된 microRNAs의 존재 하에서 현저하게 감소하였다. 이 비디오를 시청한 후에는 신경 줄기 세포에서 그를 구별하고 마이크로 RNA 발현 및 표적 Messenger.RNA의 검증을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.