신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성

이 절차의 전반적인 목표는 고함량 스크리닝 또는 HCS 시스템을 사용하여 유전자 조작 줄기 세포를 신속하게 특성화하는 것입니다. 이는 먼저 96웰 플레이트에 대한 실험을 설계 및 준비한 다음 조작된 줄기 세포의 다양한 집단을 도금함으로써 달성됩니다. 다음으로, 고함량 스크리닝 시스템은 살아있는 세포 이미징을 위해 준비된 다음 원하는 기간 동안 타임 랩스 이미징을 시작합니다.

그런 다음 타임 랩스 이미징을 완료한 후 배양 플레이트에서 프로피듐 요오드화물, 세포 사멸 염색 또는 세포 증식을 특성화하기 위한 KI 67 면역 라벨링과 같은 세포 염색 절차를 준비합니다. 마지막으로, 96웰 플레이트는 형광 이미징 및 이미지 획득을 위한 고함량 스크리닝 시스템에 다시 로드됩니다. 궁극적으로 이미지 분석 소프트웨어는 다양한 세포 성장 매개변수를 결정하기 위한 데이터 분석을 수행하는 데 사용됩니다.

이 방법론은 줄기세포 분화를 자극하는 요인의 식별 및 특성화와 같은 줄기세포 생물학 분야의 주요 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 생체 내에서 사용되기 전에 세포 유형을 특성화하는 것이 중요하기 때문에 세포 기반 치료 전략으로 확장됩니다. 이 방법은 세포 거동에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 배양에서 잘 자라는 거의 모든 다른 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

또한 이러한 접근 방식은 제브라피시 유충과 같은 전체 유기체에 잠재적으로 사용할 수 있습니다. 먼저 여기에 표시된 96웰 플레이트와 같이 멸균 배양 후드 아래에서 검사할 다양한 기질과 세포 유형을 설명하는 맵을 만듭니다. 다양한 기질과 96웰 플레이트가 있는 워크스테이션을 준비합니다.

지도에 따라 각각에 100마이크로리터의 기질 용액을 추가합니다. 그런 다음 퍼필 스트립을 사용하여 뚜껑을 밀봉하고 텍스트 프로토콜에 따라 마우스 중간엽 줄기 세포를 분리하고 렌티바이러스 벡터로 감염시킨 후 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 보관하고 96웰 플레이트에서 기질 용액을 제거하고 약 200마이크로리터의 멸균 PBS를 사용하여 웰을 두 번 세척합니다. 최종 헹굼이 끝나면 200마이크로리터의 세포 배양 배지에서 플레이트를 제거하고 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 평형화합니다.

그 동안, 멸균 조건에서 플라스크에서 컨디셔닝 배지라고 하는 성장 배지를 먼저 15ml 원추형 튜브로 수집하여 MSC를 수확합니다. 그런 다음 플라스크에 8ml의 멸균 PBS를 추가하고 완충액을 흡입하기 전에 부드럽게 소용돌이칩니다.플라스크에서 세포를 분리하기 위해 1ml의 0.05% 트립신과 0.01%EDTA 용액을 추가합니다. 세포가 분리되면 세포 현탁액을 수집하고 웰당 약 300개의 세포로 세포를 다시 도금하기 전에 8ml의 컨디셔닝된 배지를 추가합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 세포가 배양하는 동안 MSC가 기질에 부착될 수 있도록 플레이트를 2시간 동안 배양합니다. HCS 시스템을 시작하고 평형을 이룰 때까지 2시간 동안 기다립니다. 환경 조절기를 섭씨 37도로 설정하고 공기 중 이산화탄소가 5% 함유된 혼합 가스 실린더를 일정한 공기 공급원을 공급하는 환경 챔버인 HCS 시스템으로 조심스럽게 켭니다.

다음으로, 2시간의 배양 기간이 끝난 후 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 HCS 시스템의 환경 챔버에 직접 놓습니다. 플레이트가 30분 동안 평형을 이룰 때까지 기다린 후 소프트웨어를 시작하여 플레이트 설정을 구성합니다. 이미징 매개변수가 설정되면 텍스트 프로토콜에 따라 레이저 자동 초점을 사용하여 웰 바닥에 초점을 맞추고 여러 사이트와 여러 웰에서 테스트 이미지를 촬영하여 최적화된 초점면을 찾습니다.

초점이 설정되면 60개의 모든 웰에 대해 48시간 동안 5분마다 이미지 캡처를 시작합니다. 실험이 끝나면 멸균 조건의 HCS 시스템에서 96 웰 플레이트를 제거하고 각 웰에서 컨디셔닝된 매체 샘플을 수집하여 새로운 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 이 샘플은 나중에 ELIZA가 KI 67 세포 증식 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

0.1 몰 인산염 완충액을 사용하여 세포 배양을 1분 동안 헹굽니다. 세척을 반복한 후 4%파라 포름알데히드 또는 PFA를 실온에서 20분 동안 사용하여 고정 후 배양물을 고정합니다. PFA를 제거하고 PBS를 사용하여 웰을 각각 7분씩 세 번 헹굽니다.

텍스트 프로토콜에 따라 세포를 차단한 후 각각에 1차 항체 용액 100마이크로리터를 적용합니다. 접시를 잘 덮고 밤새 섭씨 4도에서 배양합니다. 세포를 7분 동안 세 번 씻은 후.

씻을 때마다 2차 항체를 바르십시오. 세포를 어두운 곳에 놓고 실온에서 90분 동안 배양한 후 다시 세 번 씻습니다. 플레이트를 덮고 이미징할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오.

자동 이미징을 수행하려면 면역 표지된 플레이트를 HCS 시스템에 로드하고 플레이트가 20분 동안 평형을 이룰 때까지 기다립니다. HCS 시스템 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 엽니다. 10 x 대물렌즈에 대한 획득 설정은 카메라 벤딩을 1로 사용하고 게인 설정을 2로 사용하여 선택합니다.

자동 노출 기능을 사용하여 셀이 있는 Z 평면을 찾고 여기에 설명된 분석을 위해 관심 있는 각 파장에 대한 오프셋을 계산합니다. DAP, EGFP 및 S3용 이미지를 캡처합니다. negative control well이 이미지 획득에 대한 신호를 표시하지 않는 최대 intensity level을 선택합니다. 포지티브 웰에 대해 동일한 임계값 설정을 사용합니다.

마지막으로, 이미지 분석을 수행하기 전에 이미지를 캡처하여 데이터베이스에 저장합니다. 텍스트 프로토콜에 따르면, 여기에 표시된 바와 같이, MSC 아형의 5가지 다른 집단을 이 그림에서 서로 다른 기질로 사전 코딩된 96개의 웰 조직 배양 플레이트에 도말하고, 증식 세포를 식별하는 anti KI 67을 식별하고, DAPI를 사용하여 서로 다른 기질이 여기에 표시된 바와 같이 엔지니어링된 MSC의 서로 다른 집단의 증식에 영향을 미치는지 여부를 평가했습니다. 증식하는 MSC의 비율에는 차이가 있었지만 모든 기질은 각 MSC 아형에 대해 상당한 세포 증식을 지원했습니다. 이 플롯은 집단에서 죽은 세포를 식별하는 프로피듐 요오드화물 또는 PI 염색이 있는 세포의 비율이 대부분의 세포를 죽이는 70% 에탄올로 처리된 세포를 검사한 모든 기질에서 낮았으며, 높은 PI 표지율을 보였으며 다른 기질에서 MSC의 거동을 조사하기 위한 양성 대조군 역할을 한다는 것을 보여줍니다.

29시간 동안의 세포 이동은 타임 랩스 디지털 현미경을 사용하여 분석되었습니다. 셀 1과 셀 2의 마이그레이션 경로는 각각 녹색과 파란색 선으로 표시됩니다. 여기에서 볼 수 있듯이 MSC의 모든 하위 유형은 세포외 기질, 코팅된 표면에서 가장 빠른 이동 속도를 보였으며 코팅되지 않은 폴리스티렌 표면에서 가장 느린 이동 속도를 보였습니다.

이 절차를 시도하는 동안 이 절차를 따르는 96웰 플레이트와 같은 다중 웰 플레이트 형식에 대한 실험을 신중하게 계획하고 설계해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. Eliza S와 같은 다른 방법은 개발 후 조작된 줄기세포에 의한 치료 인자의 생산 및 분비에 관한 추가 질문에 답하기 위해 상태 배지에서 수행할 수 있습니다. High Content 스크리닝 절차는 줄기 세포 생물학 및 약물 개발 분야의 연구자들이 높은 처리량 방식으로 복잡한 생물학적 시스템을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.