선충 동기화(Nematode Synchronization): 동일한 발달 단계에 있는 벌레 개체군을 얻는 방법

-박테리아 먹이 공급원이 뿌려진 접시에 마지막 유충 단계에있는자가 수정 벌레를 배치하는 것으로 시작하십시오. 유충이 기생충 안에 알이 풍부하고 접시에 낳을 때까지 성숙한 성충으로 성장하도록 하십시오. 알과 벌레를 모으기 위해 완충제로 접시를 씻으십시오.

다음으로, 완충액을 성충을 용해시키는 표백제 용액으로 교체하십시오. 난자 껍질로 보호되는 배아는 비록 다른 발달 단계에 있을지라도 이 치료에서 살아남을 것입니다. 그런 다음 표백제를 완충액으로 교체하고 배아가 발달하도록 합니다. 유충이 먹이가 없는 상태에서 알 껍질에서 부화함에 따라 첫 번째 유충 단계에서 발달이 멈춥니다.

발달을 재개하기 위해 유충을 음식과 함께 접시로 옮깁니다. 이것은 나머지 유충 단계를 통해 동기 진행을 자극합니다.

기생충이 마지막 유충 단계에 도달하면 먹이와 자손 생산을 막는 DNA 합성 억제제인 FUdR이 담긴 접시로 옮깁니다. FUdR이 있는 상태에서 지속적인 개발은 불임 성충 개체군을 생성합니다. 이 실험에서는 선충 C. elegans의 개체군을 동기화합니다.

-시작하려면 원하는 유전적 배경을 가진 L4 유충을 선충 성장 배지 또는 NGM 플레이트에 갓 파종한 대장균 잔디밭으로 옮깁니다. 각 변형률에 대해 최소 2개의 100mm 또는 3개의 60mm 플레이트를 사용하십시오.

3-4일 동안 또는 플레이트가 많은 수의 알과 임신한 벌레로 농축될 때까지 적절한 성장 온도에서 벌레를 배양합니다. 선충 100mm 플레이트당 약 6ml의 M9 버퍼를 사용하여 플레이트에서 알과 벌레를 씻어냅니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 균주에 대해 계란과 벌레를 개별 15ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 튜브를 6,180g에서 3분 동안 돌립니다.

원심분리 후 동물과 난자 펠릿만 남아 있는 M9 완충액을 흡입합니다. 각 튜브에 3-4ml의 표백제 용액을 넣고 6분 동안 간헐적으로 소용돌이칩니다.

그런 다음 M9 버퍼를 추가하여 각 튜브를 채우고 6,180g에서 1분 동안 회전합니다. 상층액을 흡입하고 M9로 이 세척을 3회 반복합니다.

세척 후 계란 펠릿을 약 9ml의 M9 완충액이 들어 있는 새 15ml 튜브로 옮깁니다. 갓 부화한 벌레를 섭씨 20도에서 16-48시간 동안 너트팅하여 동기화합니다.

이 튜브를 6,180g에서 1.5분 동안 회전시킨 후, 동기화된 L1 동물을 개별 NGM 플레이트의 OP50 잔디밭에 갓 파종한 잔디밭에 놓습니다. 동물이 약 42시간 후에 L4 유충 단계에 도달할 때까지 플레이트를 섭씨 20도로 유지하십시오. 이때 백금 픽을 사용하여 L4 유충을 FUdR 1밀리리터당 0.5mg을 포함하는 OP50 파종 NGM 플레이트로 이동하여 자손 생산을 방지합니다.