머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료
2018년 4월 20일
우리는 치료 평가 우리 셀 라인에 머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 실험적인 치료 regimens의 현재 표준 테스트를 가능 하 게 한 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 생체 외에서 모델의 진화 설명 민감성 및 미래에 인간의 표본에서 1 차 셀에 저항.
이 체외 방법의 전반적인 목표는 두경부 편평 세포 암종에 대한 현재 표준 또는 실험적 치료 요법을 테스트할 수 있는 3차원 세포 배양 스페로이드를 생성하는 것입니다. 이 방법은 방사선 또는 화학 방사선 치료에 노출되었을 때 두경부암 세포의 3차원 종양 성장을 이해하는 데 도움이 됩니다. 원발성 종양 세포를 다루는 것은 어렵고 항상 신뢰할 수 있는 3차원 스페로이드 형성으로 이어지는 것은 아니라고 말할
수 있습니다.이 절차를 시연하는 사람은 우리 실험실의 기술자인 Sabina Schwenk-Zieger입니다. 종양 표본의 일차 세포를 사용하는 동안 표본을 적절하고 멸균된 표면에 놓고 멸균 일회용 메스로 매우 작은 조각으로 철저히 자릅니다. 일차 조직을 기계적으로 충분히 분리한 후 콜라겐분해효소 1과 2가 함유된 바이알에 옮기고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.
다음으로, 70 마이크로미터 Falcon 셀 스트레이너를 통해 혼합물을 체로 치고 HBSS로 현탁액을 세척합니다. 성공적인 분리 및 후속 세척 후 1-200만 개의 세포를 포함하는 현탁액을 T75 세포 배양 플라스크로 옮겨 최대 10일 동안 섭씨 37도에서 준포화까지 성장합니다. 현미경으로 종양 세포 성장을 확인합니다.
배양에서 세포를 계산합니다. 오목한 둥근 바닥을 가진 매우 낮은 접착 96 잘 판을 사용하여, 씨 5, 000의 1 차적인 종양 세포, 또는 1, 000에서 2의 중간 세포주, 우물로 매체의 200에서 300 microlit에서. 다음으로 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
격일로 미디어 변경을 수행합니다. 매체를 변경하는 동안 피펫으로 스페로이드를 흡인하지 않도록 주의하십시오. 3차원 스페로이드 모양의 세포 덩어리가 관찰될 때까지 스페로이드를 배양합니다.
불규칙하거나 다중 스페로이드 형성이 있는 웰은 추가 조사에서 제외하는 것을 명심하십시오. 그런 다음 배지를 원하는 농도의 화학 요법제 및/또는 단클론 항체가 있는 배지로 변경합니다. 2.5, 5 또는 10 마이크로몰 농도의 시스플라틴을 첨가하거나 30 마이크로몰의 5-플루오로우라실을 첨가합니다.
이 절차에서는 그래픽 소프트웨어를 사용하여 6일차, 10일차 및 16일차에 디지털 사진 문서화 후 스페로이드 크기를 측정합니다. 520g에서 2.5분 동안 플레이트를 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 다음으로, 1x PBS로 세포를 세척하고 플레이트를 다시 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.
다음으로, 각 바이알에 100마이크로리터의 효소 세포 분리 용액을 추가하여 스페로이드가 용해되도록 합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 8분 동안 플레이트를 배양합니다. 현미경으로 스페로이드가 성공적으로 용해되었는지 확인합니다.
100마이크로리터의 DMEM을 추가합니다. 다음으로 520g의 플레이트를 2.5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 100마이크로리터의 DMEM에 세포를 현탁시킵니다.
그 후, 필요한 경우 상업적으로 이용 가능한 비색 증식 분석을 수행하고 ELISA 리더에서 분석을 읽습니다. 모든 세포주는 판독 시간과 크기에 차이가 있는 신뢰할 수 있는 스페로이드를 생성할 수 있습니다. 일차 세포는 초저 부착판에서 재현 가능한 스페로이드를 형성했습니다.
Ki-67 염색은 중심 세포보다 훨씬 높은 증식 속도를 보이는 배양물의 주변부를 보여주며, 종종 괴사 코어를 보이는 고형 점막 종양의 영양 분포를 모방합니다. 여기에서는 여러 화학 요법 및 방사선이 스페로이드 크기에 미치는 영향입니다. 시스플라틴으로 치료하기 전에 두 개의 회색을 가진 방사선을 조사하면 시스플라틴 단독에 비해 스페로이드 크기가 현저히 감소합니다.
1차 인간 세포에서 스페로이드를 생성하는 것이 추가로 확립됨에 따라 치료 테스트의 개념이 구현될 수 있습니다. 종양 생검 후 스페로이드를 생성한 다음 분자 특성과 치료 감수성을 테스트합니다. 우리는 세포주와 일차 인간 종양 세포 모두에 대해 세포 현탁액에서 재현 가능한 스페로이드를 생성하는 프로토콜을 확립할 수 있었습니다.
이 다중 모드 분석은 그룹 간의 작은 차이를 식별할 수 있을 만큼 충분히 민감합니다. 앞으로는 이 분석을 사용하여 먼저 표준 및 실험 치료 프로토콜에 대한 개별 반응을 평가할 수 있습니다. 둘째, 새로운 표본에서 종양 세포를 추가로 특성화합니다.
셋째, 치료 반응을 분자 패턴과 연관시킵니다. 일차 세포의 사용과 스페로이드의 생성은 개별 치료 반응을 연구하기 위한 비용 효율적인 분석과 함께 가능한 한 많은 생체 내 종양 성장 특성을 보존할 수 있습니다.
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개요
본 논문은 두경부 편평세포암에서 치료 민감도와 내성을 평가하기 위해 설계된 스페로이드 기반의 3차원 인비트로(in vitro) 모델에 대해 설명합니다. 이 방법은 방사선 및 화학 요법 치료에 반응하는 종양 성장에 대한 이해를 높이는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 종양학
- 세포 생물학
배경
- 두경부 편평세포암종은 치료가 까다로운 암 유형입니다.
- 현재의 치료법들은 종종 효능이 가변적입니다.
- 3차원 세포 배양 모델은 생체 내 조건을 더 잘 모사할 수 있습니다.
- 일차 종양 세포를 다루는 것은 상당한 어려움이 따릅니다.
연구 목적
- 치료법 테스트를 위한 신뢰할 수 있는 in vitro 모델을 개발하기 위함입니다.
- 표준 및 실험적 치료법의 효과를 평가하기 위함입니다.
- 향후 일차 인간 세포 연구를 용이하게 하기 위함입니다.
사용된 방법
- 3차원 세포 배양 스페로이드 생성.
- 조직 해리를 위한 콜라게나제 사용.
- 원발성 종양 세포를 37 °C에서 배양.
- 처리 조건에 따른 종양 성장 평가.
주요 결과
- 원발성 종양 세포로부터의 성공적인 스페로이드 형성.
- 두경부암 세포의 성장 패턴에 대한 통찰.
- 통제된 환경에서의 치료 반응 평가.
- 연구 결과를 바탕으로 한 개선된 치료 전략의 가능성.
결론
- 개발된 모델은 향후 연구에 있어 가능성을 보여줍니다.
- 치료 내성을 이해하는 것은 더 나은 치료 결과로 이어질 수 있습니다.
- 방법론을 개선하기 위해 추가적인 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 스페로이드 기반 3D 세포 배양 모델은 두경부 편평세포암의 약물 개발을 위한 예측 가능한 전임상 시스템의 절실한 필요성을 해결합니다. 일차 종양 세포를 이용한 표준화된 치료제 감수성 테스트를 가능하게 함으로써, 이 분석법은 메커니즘적 리스크 감소와 중개 생체표지자 발굴을 지원합니다. 또한 정량적이고 재현 가능한 판독 결과를 제공하여 초기 발견 및 리드 물질 확인 단계에서 go/no-go 결정을 내리는 데 도움을 줌으로써 포트폴리오 선별 효율을 높입니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 생체 내 종양 구조를 모방한 질환 관련 3D 시스템에서 치료 가설의 검증을 가능하게 함.
- 운용적 가치: 처리 후 정량적인 스페로이드 크기 및 생존율 측정을 통해 기능적 타겟 검증을 지원함.
- 예측적 가치: 세포주 및 일차 표본 간의 치료 반응 변동성을 평가하는 데이터를 생성하여 기전적 리스크 감소를 도움.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 초저부착 플레이트를 사용하여 표준화된 고처리량 스페로이드 형성을 구현함으로써 일관된 화합물 스크리닝이 가능합니다.
- 운영적 가치: 정의된 종말점(스페로이드 크기, 생존율)을 통해 화학 방사선 및 면역 요법 처방에 대한 재현성 있는 노출을 가능하게 합니다.
- 확장성: 96-웰 포맷과 호환되어 분석법의 표준화 및 교차 기능적 워크플로우 통합을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 환자 고유의 종양 특성을 유지하기 위해 일차 인간 종양 세포를 사용하여, 임상 반응 예측에 대한 관련성을 높입니다.
- 기전적 리스크 감소: 치료 반응을 분자 패턴(예: Ki-67 염색)과 상관 분석하여 내성 기전을 식별할 수 있게 합니다.
- 전임상 모델: in vivo 연구에 앞서 표준 및 실험적 요법을 평가할 수 있는 비용 효율적이고 재현 가능한 시스템을 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 타겟 검증부터 리드 화합물 도출, 그리고 전임상 평가에 이르는 신약 개발 연속 과정에 적합하며, 특히 고형암에 집중하는 종양학 프로그램에 유용합니다.
- 발견 생물학: 치료 압력 하에서의 종양 성장 역학 및 미세환경 상호작용에 대한 가설 검증을 용이하게 합니다.
- 스크리닝: cisplatin, 5-FU 또는 방사선 조합 노출 후 정량적이고 재현 가능한 결과물(스페로이드 크기, 생존율)을 제공합니다.
- 분석: 디지털 사진 문서화 및 후속 분석을 위한 효소적 해리를 통해 치료군 간의 통계적 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 스페로이드 반응을 1차 검체 유래 증식 마커 및 분자 프로필과 연결함으로써 바이오마커 정렬을 지원합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 종양 유형 및 치료 양식에 적용 가능한 표준화되고 품질 관리된 분석 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 고형암에서 관찰되는 영양분 구배 및 증식 불균질성을 모델링하여 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
- 운영적 가치: 표준화된 분리, 파종 및 배지 교체 프로토콜을 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 환자 유래 모델에서 치료 감수성을 조기에 평가함으로써 생물학적 소모를 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 자원 집약적인 연구 수행 전 반응자와 비반응자를 식별하여 리스크가 조정된 진행 결정에 정보를 제공합니다.
구현 시 고려 사항
- 일차 종양 조직 처리 및 효소 분해 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 스페로이드 모니터링을 위해 초저부착 플레이트와 도립 현미경이 필요합니다.
- 피펫팅 중 스페로이드의 파손을 방지하기 위해 배지 교체 과정의 표준화된 워크플로우가 필요합니다.
- 강건성을 확보하기 위해 다양한 HNSCC 세포주 및 일차 검체에 대한 검증이 필요합니다.
- 일차 세포 스페로이드 형성 효율의 가변성으로 인해 제한이 있으며, 불규칙한 구조에 대한 제외 기준 설정이 필요합니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Processing the Tumor Specimen
1:39
Seeding the Cells on Ultra-low Adhesion Cell Culture Plates and Exposing Spheroids to Multimodal Standard or Experimental Tumor Therapy
2:52
Assessment of Spheroid Size and Extent of Cellular Proliferation for Assay Read-out
4:08
Results: Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
5:12
Conclusion
