Name: 머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 배우세요 머리와 목 편평 상피 세포 암 치료 평가를 위한 3D 스페로이드 배양 모델을 구축하는 방법입니다. 이 기법은 방사선 및 화학요법에 대한 종양 반응을 연구하여 맞춤형 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 뮌헨의 대학 교부 금에 의해 투자 되었다 (FöFoLe 프로젝트-번호: 789-781).

이 원고, 즉 인간의 종양 견본의 사용에 표시 된 모든 연구는 사전 결정에서 대학 의학의 마인츠/대학 뮌헨 의료 센터 윤리 위원회의 동의 보호 됩니다. 환자는 그들의 치료 과정에서 얻은 초과 생물학 자료의 과학적인 사용에 동의 하는 국가 법률 지침에 따라 동의 주었다. 연구는 인간의 복지에 대 한 모든 기관, 국가 및 국제 지침에 따라 수행 되었습니다.
1. 머리와 도대체 편평 세포 암 종에서 종양 생 검 복용
<ol><li>수행 일반 (propofol 및 sevoflurane, 근육 편안한 에이전트) 또는 로컬 침투 (2 %ultracaine, 아드레날린) / (xylocaine) 마 취 수술 실 또는 이비인후과 검사의 자에 표면. 표준 계기 운영 위 소화 및 호흡 관의 구두 구멍/인 두/후 두/다른 부분에서 종양 질량 시각화 하 고, 필요한 경우, 현미경.</li>
	<li>신선한 종양 생 검 암 병 변 주변에서 무딘 또는 절단 악기 가져가 라. 때문에이 지역에 풍부한 괴 사 병 변의 중심을 하지 마십시오. 얻은 조직 isotonic 나트륨 염화 물 솔루션 무 균 용기에 넣어.</li>
	<li>생 검 후 수행 hemostasis, 예를 들어필요에 따라., 바이 폴라 또는 monopolar 응고 장치 vasoconstrictive 물질의 사용 이외에.</li>
	<li>가져 종양 생 검 인접 한 실험실으로 직접 세포 배양 실험을 위해 사용 됩니다. 다른 종양 생 검 암을 배제 하기 위해 평소 병리학 자 보내기.</li>
	<li>실험실 기술 자가 직접 표본을 처리할 준비가 있는지 확인 합니다.</li>
</ol>2. 종양 견본 처리
<ol><li>적합 하 고 메 마른 표면에 종양 견본을 놓고 철저 하 게 멸 균 일회용 메스와 가능한 한 작은 조각으로 그것을 잘라. 주의: 감염 및 혈액을 매개로 질병의 상태는 잘 문서화 이며 기술자 표준 기관의 관심을 방지 하기 위해 프로토콜 바늘 막대기 또는 잠재적으로 biohazard 환자 소재 절단 부상 확인 및 가능한 부상 후 따라 프로토콜입니다.</li>
	<li>충분 한 기계적 분리의 기본 조직, 후 콜라를 포함 하는 유리병에 조직을 넣어 나 / II 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어 70 µ m 팔 콘 셀 스 트레이너를 통해 체질 하십시오 그리고 행 크 스 균형 소금물 (HBSS)와 현 탁 액을 씻어.</li>
	<li>
성공적인 분리 이후 세척 후에, 5% CO2 와 37 ° c.의 온도에 하위-confluency 성장 T75 셀 문화 플라스 (75 cm2)에 1-2 × 106 셀을 포함 하는 정지 장소 이 단계는 최대 10 일을 걸릴 수 있습니다.
	<ol>
<li>다음의로 구성 된 특별 keratinocyte 문화 매체를 사용 하 여: 125 mL Dulbecco의 독수리 매체 (DMEM) Keratinocyte 보완 매체 (보완된 매체 구성 된 500 mL Keratinocyte SF 매체의 소 뇌 하 수 체의 15 mg의 250 mL 수정의 추출 (BPE), 페니실린/스, 150 ng 재조합 인간 상피 성장 인자 (EGF), 300mm CaCl2의 516 µ L, 사전에 대비해 주식 혼합의 2.5 mL), F12 영양소 혼합, BPE (0.75 mL), 75 ng 재조합 인간 EGF의 10 mg의 125 mL (2 µ L) 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide (자료 테이블)의 3.75 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 낮은 접착 세포 배양 배지로 셀 시드
<ol><li>현미경 종양 세포 성장 확인. 문화에 있는 셀의 개수 (기본 또는 세포 배양) 5000 기본 종양 세포 또는 중간 셀 라인의 1000-2000 셀 씨와 / 오목와 함께 낮은 접착 판으로 미디어 (3.2 단계.)의 200-300 µ L에서 다른 셀 라인 라운드 바닥 (96-음).</li>
	<li>
1%에서 5% CO2 37 ° C에서와 동등한 부품 DMEM 그리고 기도 상피 세포 매체 (BEGM), 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린/스, 1% 나트륨 pyruvate, 1% 비 본질적인 아미노산, 셀 문화 L-글루타민 (2.3 단계.). 셀 라인 사용 되 DMEM 기초 미디어 충분 하다.
	<ol>
<li>미디어 변화를 매일 수행 합니다. 미디어 변경 시 피펫으로와 회전 타원 체를 발음 하지에 주의. 성장의 수준까지 문화는 spheroids로 descibed 3.3에 (약 7-10 일)에 도달.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 차원, 회전 타원 체 모양의 셀 대기업에 대 한 보고 현미경 자발적인 회전 타원 체 형성을 확인 합니다. 불규칙 한 또는 추가 조사에서 여러 회전 타원 체 형성 우물을 제외 합니다. 참고: Spheroids 표시 됩니다 맨 눈으로도, 더 처리 및 아래 설명 된 대로 미디어 변화를 촉진.</li>
</ol>4. 노출 복합 표준 또는 실험 종양 치료에 Spheroids
<ol><li>원하는 치료 처방을 선택 합니다. 치료 spheroids 또는 spheroids만 부분 치료 regimens, 예를 들어받는 치료의 비교를 허용 하는 충분히 큰 컨트롤 그룹을 디자인 합니다. 방사선 혼자입니다. 컨트롤 그룹의 크기 그리고 실험적인 그룹 디자인에 따라 보편적으로 정의할 수 없습니다.</li>
	<li>첨가제와 함께 미디어 미디어, chemotherapeutics 및/또는 원하는 농도에서 단일 클론 항 체와 의미 미디어를 교환 합니다. 2.5/5/10 µ M 또는 5-fluoruracil (5FU) 30 µ M의 농도에서 Cisplatin를 추가 합니다. 참고: 높은 처리량 실험 또는 큰 그룹 크기/다 수 그룹의, 하나 사용할 수 있습니다 자동된 pipetting 로봇 우리가 더 실험에서 설치 하 고 있다.</li>
	<li>또는 적합 한 방사선 시설을 사용 하 여 2 Gy에서 spheroids와 세포 배양 배지 방출. 주의: 직원의 유해한 방사선 노출의 방지에 관한 기관의 프로토콜을 존중 합니다. 방사선 보호 지침에 따라 지정 및 훈련 된 기술자 에서만 작동 합니다. 원하는 경우, chemotherapeutics 4.2 아래 설명 된 대로 추가 합니다. 이후에.</li>
	<li>앞에서 설명한 문화 조건 (37 ° C, 3.2 단계)에서 24 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
	<li>부 화 후 미디어 변경 최소 6 일 매일 세포 배양을 계속 합니다.</li>
</ol>5. 회전 타원 체 크기와 분석 결과 읽기에 대 한 세포질 확산의 정도 평가
<ol><li>회전 타원 체 크기 6 일에 디지털 사진 설명서 후 지역 (10 일, 16 일) 그래픽 소프트웨어 (매개 변수 1)를 측정 합니다.</li>
	<li>접시의 2.5 분 520 x g에서 원심 분리 후에 상쾌한을 제거 합니다. 1 x PBS와 접시 다시 설명, 뒤 상쾌한 (PBS)를 제거 하는 원심 분리기의 충분 한 양의 세포를 씻어.</li>
	<li>해산을 spheroids 수 있도록 각 유리병에 효소 세포 분리 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에 8 분 동안 접시를 품 어</li>
	<li>성공적인 현미경 회전 타원 체의 용 해를 확인 합니다. DMEM의 100 µ L를 추가 합니다. 원심에서 520 x g 2.5 분 제거에 대 한 접시는 상쾌한 고 DMEM의 100 µ L의 세포를 중단.</li>
	<li>예를 들어 서 부 표준시-8 분석 결과 제조업체의 지침25에 따라 각 유리병에 상용 색도계 확산 분석 결과 수행 합니다. 분석 결과 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 리더 (매개 변수 2)에 밖으로 읽기.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 세포 정지, 예비 실험, 기본 인간 종양 세포에서에서 그리고 두 셀 라인에서 재현 spheroids를 생성 하는 프로토콜을 설정할 수 있었다. 우리는 먼저 앞에서 설명한 두 가지 방법으로 평가 하 고 울 라-방법, 어디 낮은 접착 표면 배양 배지는 사용 되는 방법, 일정 한 3 차원 spheroids의 생성에 대 한 안전 하 고 더 안정적인 것을 확인. 분석 결과 읽기 (크기/위치 및 세포 생존)에 대 한 두 개의 별도 메서드를 결합해 서,이 복합 분석 결과 그룹 간의 작은 차이 식별 하기 위해 충분히 과민 하다. 이것은 나중의 통합 분석 결과 3 차 케어 센터에서 임상 경로 대 한 기술적 타당성의 증거를 향한 첫 번째 단계. 미래에, 그것은 (i) 일반적인 첫 번째 또는 두 번째-/ 제 3 라인 치료 프로토콜 (항 암 치료 시 약, 방사선)를 개별 종양 민감도 평가 하기 위해 사용 될 수 및 실험적인 치료 프로토콜, (ii) 더 신선한 표본에서 종양 세포의 특성 그리고 분자 표면 또는 세포질 패턴 치료 응답의 상관 관계...

머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)는 여섯 번째 가장 일반적인 암 전세계 점 막 인간 유 두 종 바이러스 (HPV) 감염 관련 pathogenesis, 대부분의 경우 과도 한 니코틴과 알콜으로 인 한 옆의 상승 부각 소비 1,2. 고급 단계와 재발 HNSCC에 대 한 치료 남아 공격적인 종양 침공으로 인해 도전 작은 종양 전 침략 적인 단계는 일반적으로 외과 절단, 일반적으로 자 궁 경부 림프절 절 개와 결합으로 잘 치료할 수 전이성 확산 및 저항 방사선 및 화학 요법 프로토콜3,,45,6,7,8. 최근 연구 제안 세포 표현 형의 높은 가변성 및 순환의 하위 특성화 고 전파 종양 세포 막9,10를 시작 했다. 고체, 균일 한 종양의 이전 신념 질량 과거에 최근의 연구에 비추어 수정 되어야 했다 년11,12,13,14. 종양 특성 및 주요 돌연변이의 id에 대 한 현재 접근 여러 유전자 치료 저항에 연결할 수 있지만 비용 집약적인 접근을 유지 하는 것을 식별할 수 있는. 또한, 유전자 형의 지식 표현 형 및 치료 응답의 신뢰할 수 있는 예측을 반드시 허용 하지 않습니다.
고급 단계와 재발 성 질환에 대 한 전체 및 질병-무료 생존 개선 몇 발전 되었습니다. 니코틴-로 바이러스 관련 암, 수술 외에 현재 치료 옵션이 공격적 방사선 및 백 금 기반의 화학요법 식이요법을 묶습니다. 자 궁 부정과 긍정적인 암; 사이 다른 응답 속도 대 한 의미 되었습니다. 그러나,이 되지 않은 아직 변화를 일반적 치료 지침 이어질. 저항 방사선 및 화학 요법 광범위 한 현상에서 모든 종양 단계 이며 백 금 기반 화학 요법 또한 타겟된 치료 (안티-EGFR;에 관해서는 존재 표 피 성장 인자 수용 체) 그리고 최근 검사점 금지15신흥. 효과 없는 방사선 및 화학 요법 dysphagia, mucositis, 구강 건조와 다른 사람 사이 신장 또는 심장 기능의 감소의 위험이 큰 환자 사망률의 높은 비용에 온다. 치료 응답 사전 예측 각 개별 환자에 대 한 일반적인 치료 개념의 결정 중요 한 목표는, 불필요 한 치료 개념, 부작용 및 비용 방지 될 것으로 보인다.
우리가 현재 표준 항 암 치료-방사선 기술 서 점에서 일반 및 품질 제어 종양 치료 알고리즘에 통합 될 수을 향해 개별 환자의 치료 민감성을 테스트 하는 모델을 확립 하고자 했다. 멀리 목표 그들은 제대로 그들의 변화 없이 실제 인간 종양 세포를 대표 하 고이 프로토콜의 설립 동안 지금, 아시다시피 이루어졌다 다양 한 셀 라인에 무 겁 게 변경 하 고 세 셀 라인을 사용 하지 않고 모델을 사용 했다. 상업적으로 사용 가능한 셀 라인 에서만 독립 수, 우리 최근 성공적으로 생성 "피 카" 라는 중간 셀 라인 인간의 종양 표본에서 기본 HNSCC 세포에서 그것의 표면 및 한정 된 구절 에 보존 세포 마커 16.이 피 카 셀 라인 나중 다음 신선한 인간의 암 세포 실험에서 종양 생 검에도 모델의 개발에 대 한 준비로 봉사 해야 한다. 그것은 그 문화는 다르게 반응 하는 3 차원 셀 및 더 많은 vivo에서세포 표시 되었습니다-monolayers17,,1819,20에서에서 성장 보다 암 약물의 관리 같은 ,21, 철새의 보존 때문에 주로 및 특정 셀 하위 집합22,,2324의 하위 차별화 속성. 여기, 우리가 중간 셀 라인에서 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 모델의 프로토콜을 설명 하 고 기본 인간의 편평 세포 암 종 세포와 방법을 어떻게 통합 같은 모델 머리와 목 외과 및 종양학 ( 의 암 치료 그림 1).

<table><tbody><tr><td>Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>F 0425</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco Life Technologies, Paisley, UK</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>A2212</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>L0473</td><td></td></tr><tr><td>non-essential amino acids</td><td>Biochrom, 베를린, 독일</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biochrom, 베를린, 독일</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche Life Sciences, Basel, Switzerland</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform</td><td>InSphero, Schlieren, Switzerland</td><td>PB-CS 06-001</td><td></td></tr><tr><td>GravityTRAP plate</td><td>InSphero, Schlieren, Switzerland</td><td>PB-CS-01-001</td><td></td></tr><tr><td>ULA(Ultra-low attachment) 배양판</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>기도 상피 세포 성장 배지</td><td>Promocell, Heidelberg, Germany</td><td>C-21060</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>A 2612</td><td></td></tr><tr><td>기도 상피 세포 성장 배지 보충제 믹스</td><td>Promocell, Heidelberg, Germany</td><td>C39165</td><td></td></tr><tr><td>WST-8 테스트</td><td>Promocell, 하이델베르크, 독일</td><td>PC PK-CA705-CK04</td><td></td></tr><tr><td>각질 세포 SFMedium + L-Glutamine 500mL</td><td>Invitrogen</td><td>#17005-034</td><td></td></tr><tr><td>소 뇌하수체 추출물(BPE), 25mg</td><td>Invitrogen</td><td>#37000015</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 상피 성장 인자 2.5 &micro; g</td><td>Invitrogen</td><td>#37000015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Invitrogen</td><td>#21068-028</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신 10000U/mL 페니실린/ 10000&마이크로; g/mL 스트렙토마이신</td><td>인비트로젠</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F12 영양 혼합물</td><td>인비트로겐</td><td>#21765-029</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스(NaCl 내 200mM L-알라닐-L-글루타민-디펩타이드)</td><td>인비트로젠</td><td>#35050087</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Ca, Mg)</td><td>Life Technologies</td><td>#14025-092</td><td>(페놀 레드 없음)</td></tr><tr><td>1x TrypLE Expres Enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>#12604-013</td><td>(페놀 레드 없음)</td></tr><tr><td>Accutase (효소 세포 분리 솔루션)</td><td>혁신적인 세포 기술</td><td>Cat# AT104</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 팔콘 세포 여과기</td><td>BD Biosciences, USA#</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3d 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

고급 및 재발 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)에 대 한 현재의 치료 옵션은 방사선 및 항 암 치료 방사선 접근 또는 수술 없이 묶습니다. 백 금 기반의 화학요법 식이요법 현재 효능 측면에서 금 표준을 동안에 대부분의 경우, 새로운 화학요법 식이요법, 즉 immunotherapy 등장 하고있다. 그러나, 응답 속도 및 치료 저항 메커니즘 중 항 암 치료 처방에 대 한 예측 하 고 제대로 이해 남아 있습니다. 항 암 치료 및 방사선 저항 메커니즘의 광범위 한 변화는 날짜를 알려져 있습니다. 이 연구는 표준화, 높은 처리량에 생체 외에서 분석 결과의 개인된 종양에 대 한 미래의 도구로 개별 환자에서 HNSCC 셀 라인의 응답 다양 한 치료 식이요법, 그리고 잘하면 1 차 셀을 평가 하기 위해 개발을 설명 합니다. 치료입니다. 분석 결과 우리의 제 3 배려 센터; HNSCC 환자에 대 한 품질 제어 표준 알고리즘에 통합 되 고 하도록 설계 되었습니다. 그러나,이 미래 연구의 대상이 될 것입니다. 기술적 타당성 실제 환자에서 종양 생 검에서 1 차 셀에 대 한 약속 같은 데. 표본은 다음 실험실으로 전송 됩니다. Biopsies는 기계적으로 따라 효소 소화에 의해 구분 됩니다. 다음 셀에 3 차원, 회전 타원 체 모양의 셀 대기업의 재현, 표준 및 자발적 형성을 촉진 하는 매우 낮은 접착 셀 문화 튜브 교양. Spheroids 다음 프로토콜과 immunotherapy 프로토콜 필요에 따라 항 암 치료 방사선에 노출 될 준비가 됩니다. 마지막 셀 생존 및 회전 타원 체 크기 치료 민감성의 지표 이며 환자 들 치료 가능성이 응답을 평가 하기 위해 미래에 고려 사항으로 얻을 수 수 있습니다. 이 모델 쪽으로 머리와 목 암 맞춤된 치료 가치, 비용 효율적인 도구 수 있습니다.

우리 reproducibly 나중 Hagemann 외 에 설명 된 대로 신선한 종양 생 검에서 파생 하는 기본 인간 암 세포에서에서 독점 피 카 셀 라인을 포함 하 여 다른 셀 라인에서 먼저 단일 셀 정지에서 spheroids 생성 수 있었다 . 26. 우리는 회전 타원 체 세대;에 대 한 두 가지 설립된 방법 평가 소위 교수형 되 고 두 드롭 (HD) 메서드와 매우 낮은 접착 (울 라) 메서드, 후자 더 효과적이 고 안전한 하나 되. 플레이트 처리, 무거운 진동, 그리고 균일성 ( 에서 더 많은 재현 회전 타원 체 성장 spheroids의 필연적인 손실 적은 문제 빠른 회전 타원 체 성장를 포함 하 여 HD에 비해 울 라 방법의 이점 강조 수 있었습니다. 그림 2). 유리병 당 여러 spheroids의 HD 방법에서 더 일반적 이었다. 우리는 회전 타원 체 ...

우리는 치료 평가 우리 셀 라인에 머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 실험적인 치료 regimens의 현재 표준 테스트를 가능 하 게 한 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 생체 외에서 모델의 진화 설명 민감성 및 미래에 인간의 표본에서 1 차 셀에 저항.

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

이 체외 방법의 전반적인 목표는 두경부 편평 세포 암종에 대한 현재 표준 또는 실험적 치료 요법을 테스트할 수 있는 3차원 세포 배양 스페로이드를 생성하는 것입니다. 이 방법은 방사선 또는 화학 방사선 치료에 노출되었을 때 두경부암 세포의 3차원 종양 성장을 이해하는 데 도움이 됩니다. 원발성 종양 세포를 다루는 것은 어렵고 항상 신뢰할 수 있는 3차원 스페로이드 형성으로 이어지는 것은 아니라고 말할 수 있습니다.이 절차를 시연하는 사람은 우리 실험실의 기술자인 Sabina Schwenk-Zieger입니다. 종양 표본의 일차 세포를 사용하는 동안 표본을 적절하고 멸균된 표면에 놓고 멸균 일회용 메스로 매우 작은 조각으로 철저히 자릅니다. 일차 조직을 기계적으로 충분히 분리한 후 콜라겐분해효소 1과 2가 함유된 바이알에 옮기고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.다음으로, 70 마이크로미터 Falcon 셀 스트레이너를 통해 혼합물을 체로 치고 HBSS로 현탁액을 세척합니다. 성공적인 분리 및 후속 세척 후 1-200만 개의 세포를 포함하는 현탁액을 T75 세포 배양 플라스크로 옮겨 최대 10일 동안 섭씨 37도에서 준포화까지 성장합니다. 현미경으로 종양 세포 성장을 확인합니다.배양에서 세포를 계산합니다. 오목한 둥근 바닥을 가진 매우 낮은 접착 96 잘 판을 사용하여, 씨 5, 000의 1 차적인 종양 세포, 또는 1, 000에서 2의 중간 세포주, 우물로 매체의 200에서 300 microlit에서. 다음으로 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.격일로 미디어 변경을 수행합니다. 매체를 변경하는 동안 피펫으로 스페로이드를 흡인하지 않도록 주의하십시오. 3차원 스페로이드 모양의 세포 덩어리가 관찰될 때까지 스페로이드를 배양합니다.불규칙하거나 다중 스페로이드 형성이 있는 웰은 추가 조사에서 제외하는 것을 명심하십시오. 그런 다음 배지를 원하는 농도의 화학 요법제 및/또는 단클론 항체가 있는 배지로 변경합니다. 2.5, 5 또는 10 마이크로몰 농도의 시스플라틴을 첨가하거나 30 마이크로몰의 5-플루오로우라실을 첨가합니다.이 절차에서는 그래픽 소프트웨어를 사용하여 6일차, 10일차 및 16일차에 디지털 사진 문서화 후 스페로이드 크기를 측정합니다. 520g에서 2.5분 동안 플레이트를 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 다음으로, 1x PBS로 세포를 세척하고 플레이트를 다시 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.다음으로, 각 바이알에 100마이크로리터의 효소 세포 분리 용액을 추가하여 스페로이드가 용해되도록 합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 8분 동안 플레이트를 배양합니다. 현미경으로 스페로이드가 성공적으로 용해되었는지 확인합니다.100마이크로리터의 DMEM을 추가합니다. 다음으로 520g의 플레이트를 2.5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 100마이크로리터의 DMEM에 세포를 현탁시킵니다.그 후, 필요한 경우 상업적으로 이용 가능한 비색 증식 분석을 수행하고 ELISA 리더에서 분석을 읽습니다. 모든 세포주는 판독 시간과 크기에 차이가 있는 신뢰할 수 있는 스페로이드를 생성할 수 있습니다. 일차 세포는 초저 부착판에서 재현 가능한 스페로이드를 형성했습니다.Ki-67 염색은 중심 세포보다 훨씬 높은 증식 속도를 보이는 배양물의 주변부를 보여주며, 종종 괴사 코어를 보이는 고형 점막 종양의 영양 분포를 모방합니다. 여기에서는 여러 화학 요법 및 방사선이 스페로이드 크기에 미치는 영향입니다. 시스플라틴으로 치료하기 전에 두 개의 회색을 가진 방사선을 조사하면 시스플라틴 단독에 비해 스페로이드 크기가 현저히 감소합니다.1차 인간 세포에서 스페로이드를 생성하는 것이 추가로 확립됨에 따라 치료 테스트의 개념이 구현될 수 있습니다. 종양 생검 후 스페로이드를 생성한 다음 분자 특성과 치료 감수성을 테스트합니다. 우리는 세포주와 일차 인간 종양 세포 모두에 대해 세포 현탁액에서 재현 가능한 스페로이드를 생성하는 프로토콜을 확립할 수 있었습니다.이 다중 모드 분석은 그룹 간의 작은 차이를 식별할 수 있을 만큼 충분히 민감합니다. 앞으로는 이 분석을 사용하여 먼저 표준 및 실험 치료 프로토콜에 대한 개별 반응을 평가할 수 있습니다. 둘째, 새로운 표본에서 종양 세포를 추가로 특성화합니다.셋째, 치료 반응을 분자 패턴과 연관시킵니다. 일차 세포의 사용과 스페로이드의 생성은 개별 치료 반응을 연구하기 위한 비용 효율적인 분석과 함께 가능한 한 많은 생체 내 종양 성장 특성을 보존할 수 있습니다.

therapy-testing-spheroid-based-3d-cell-culture-model-for-head-neck

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

우리는 neuroendocrine 암 세포 라인을 사용하여 3D 다세포 spheroids를 성장하는 간단한 아가로 오스 오버레이 플랫폼을 소개합니다. 이 방법은 neuroendocrine 종양 세포에 치료 약물의 효과를 시험하는 매우 편리한 방법을 제공합니다. 그것은 또한 우리가 암 치료를 위해 인간 neuroendocrine 종양의 spheroids을 설정하는 데 필요한 도움을 수 있습니다.

인간 Neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 Neuroendocrine 종양 세포 라인

스페로이드는 2D 세포 배양 단층 모델에 비해 세포의 환경을 보다 정확하게 표현하는 데 사용되는 3D 세포 배양 모델의 한 유형입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 결장직장암 세포주에서 스페로이드를 생성하고 라이브 셀 이미징을 적용하여 스페로이드의 성장을 추적하는 것을 볼 수 있습니다.

세포주에서 스페로이드 생성: 3차원(3D) 세포 배양 방법

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

이 프로토콜에 대 한 3 차원 구조적된 암 세포 (spheroids)에서 실시간으로 immunotherapeutic 리디렉션된 T-셀 (자동차 T-세포) 세포 독성을 평가 하기 위해 설계 되었습니다.

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

관련 인간 질병을 충실하게 재구성하는 포괄적인 체외 모델은 부족합니다. 현재 연구는 인간 간세포 암에서 종양 기질 상호 작용을 연구하는 신뢰할 수있는 체외 도구인 3차원 (3D) 종양 스페로이드 생성 및 문화를 제시합니다.

간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

이 글에서는 3차원 종양 스페로이드를 구성하기 위한 표준화된 방법을 보여줍니다. 자동화된 이미징 시스템을 사용한 스페로이드 관찰 및 이미지 기반 딥러닝 분석을 위한 전략도 설명합니다.

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

배우세요 머리와 목 편평 상피 세포 암 치료 평가를 위한 3D 스페로이드 배양 모델을 구축하는 방법입니다. 이 기법은 방사선 및 화학요법에 대한 종양 반응을 연구하여 맞춤형 치료 전략 개발에 활용됩니다.

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

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