머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

우리는 치료 평가 우리 셀 라인에 머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 실험적인 치료 regimens의 현재 표준 테스트를 가능 하 게 한 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 생체 외에서 모델의 진화 설명 민감성 및 미래에 인간의 표본에서 1 차 셀에 저항.

이 체외 방법의 전반적인 목표는 두경부 편평 세포 암종에 대한 현재 표준 또는 실험적 치료 요법을 테스트할 수 있는 3차원 세포 배양 스페로이드를 생성하는 것입니다. 이 방법은 방사선 또는 화학 방사선 치료에 노출되었을 때 두경부암 세포의 3차원 종양 성장을 이해하는 데 도움이 됩니다. 원발성 종양 세포를 다루는 것은 어렵고 항상 신뢰할 수 있는 3차원 스페로이드 형성으로 이어지는 것은 아니라고 말할

이 절차를 시연하는 사람은 우리 실험실의 기술자인 Sabina Schwenk-Zieger입니다. 종양 표본의 일차 세포를 사용하는 동안 표본을 적절하고 멸균된 표면에 놓고 멸균 일회용 메스로 매우 작은 조각으로 철저히 자릅니다. 일차 조직을 기계적으로 충분히 분리한 후 콜라겐분해효소 1과 2가 함유된 바이알에 옮기고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, 70 마이크로미터 Falcon 셀 스트레이너를 통해 혼합물을 체로 치고 HBSS로 현탁액을 세척합니다. 성공적인 분리 및 후속 세척 후 1-200만 개의 세포를 포함하는 현탁액을 T75 세포 배양 플라스크로 옮겨 최대 10일 동안 섭씨 37도에서 준포화까지 성장합니다. 현미경으로 종양 세포 성장을 확인합니다.

배양에서 세포를 계산합니다. 오목한 둥근 바닥을 가진 매우 낮은 접착 96 잘 판을 사용하여, 씨 5, 000의 1 차적인 종양 세포, 또는 1, 000에서 2의 중간 세포주, 우물로 매체의 200에서 300 microlit에서. 다음으로 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.

격일로 미디어 변경을 수행합니다. 매체를 변경하는 동안 피펫으로 스페로이드를 흡인하지 않도록 주의하십시오. 3차원 스페로이드 모양의 세포 덩어리가 관찰될 때까지 스페로이드를 배양합니다.

불규칙하거나 다중 스페로이드 형성이 있는 웰은 추가 조사에서 제외하는 것을 명심하십시오. 그런 다음 배지를 원하는 농도의 화학 요법제 및/또는 단클론 항체가 있는 배지로 변경합니다. 2.5, 5 또는 10 마이크로몰 농도의 시스플라틴을 첨가하거나 30 마이크로몰의 5-플루오로우라실을 첨가합니다.

이 절차에서는 그래픽 소프트웨어를 사용하여 6일차, 10일차 및 16일차에 디지털 사진 문서화 후 스페로이드 크기를 측정합니다. 520g에서 2.5분 동안 플레이트를 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 다음으로, 1x PBS로 세포를 세척하고 플레이트를 다시 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.

다음으로, 각 바이알에 100마이크로리터의 효소 세포 분리 용액을 추가하여 스페로이드가 용해되도록 합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 8분 동안 플레이트를 배양합니다. 현미경으로 스페로이드가 성공적으로 용해되었는지 확인합니다.

100마이크로리터의 DMEM을 추가합니다. 다음으로 520g의 플레이트를 2.5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 100마이크로리터의 DMEM에 세포를 현탁시킵니다.

그 후, 필요한 경우 상업적으로 이용 가능한 비색 증식 분석을 수행하고 ELISA 리더에서 분석을 읽습니다. 모든 세포주는 판독 시간과 크기에 차이가 있는 신뢰할 수 있는 스페로이드를 생성할 수 있습니다. 일차 세포는 초저 부착판에서 재현 가능한 스페로이드를 형성했습니다.

Ki-67 염색은 중심 세포보다 훨씬 높은 증식 속도를 보이는 배양물의 주변부를 보여주며, 종종 괴사 코어를 보이는 고형 점막 종양의 영양 분포를 모방합니다. 여기에서는 여러 화학 요법 및 방사선이 스페로이드 크기에 미치는 영향입니다. 시스플라틴으로 치료하기 전에 두 개의 회색을 가진 방사선을 조사하면 시스플라틴 단독에 비해 스페로이드 크기가 현저히 감소합니다.

1차 인간 세포에서 스페로이드를 생성하는 것이 추가로 확립됨에 따라 치료 테스트의 개념이 구현될 수 있습니다. 종양 생검 후 스페로이드를 생성한 다음 분자 특성과 치료 감수성을 테스트합니다. 우리는 세포주와 일차 인간 종양 세포 모두에 대해 세포 현탁액에서 재현 가능한 스페로이드를 생성하는 프로토콜을 확립할 수 있었습니다.

이 다중 모드 분석은 그룹 간의 작은 차이를 식별할 수 있을 만큼 충분히 민감합니다. 앞으로는 이 분석을 사용하여 먼저 표준 및 실험 치료 프로토콜에 대한 개별 반응을 평가할 수 있습니다. 둘째, 새로운 표본에서 종양 세포를 추가로 특성화합니다.

셋째, 치료 반응을 분자 패턴과 연관시킵니다. 일차 세포의 사용과 스페로이드의 생성은 개별 치료 반응을 연구하기 위한 비용 효율적인 분석과 함께 가능한 한 많은 생체 내 종양 성장 특성을 보존할 수 있습니다.