초파리 굴을 파고 터널을 파는 분석: 파리 유충의 조직 저산소증을 평가하는 방법

- 배아 수집 케이지를 설정하려면 신선한 효모 페이스트가 보충된 포도 주스 한천 플레이트를 사용하고 적절한 유전자형의 수컷 및 암컷 초파리 파리가 들어 있는 케이지에 플레이트를 놓습니다. 효모와 포도 주스에서 나는 냄새가 매력적이며 암컷의 알을 낳는 것을 촉진합니다. 일정 기간 동안 알을 낳을 수 있습니다. 그런 다음 성충을 제거하고 배아 플레이트를 24시간 동안 배양하여 첫 번째 instar 유충을 얻습니다. 그런 다음 포도 주스 플레이트에서 몇 마리의 유충을 플레이트 중앙의 한천에 있는 구멍을 잘라내고 효모 페이스트로 채운 한천 전용 테스트 플레이트로 부드럽게 옮깁니다.

어린 유충은 발달하기 위해 체중을 늘리기 위해 먹이를 먹어야 하므로 먹이 공급원인 효모 페이스트에 굴을 파고 들어갑니다. 유충은 성장하면서 방황 단계에 들어가 번데기가 될 장소를 찾기 위해 먹이에서 멀리 터널을 뚫습니다. 저산소증을 평가하려면 유충이 기질에서 형성하는 터널링 패턴을 검사하십시오. 터널링이 부족하거나 불충분하면 산소 결핍의 징후입니다. 예제 프로토콜에서는 굴 굴 및 터널링 분석을 설정하는 방법을 볼 수 있습니다.

- 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 알을 낳는 접시에 대조군 및 실험적 유전자 교배를 설정합니다. 시간 제한 알 수집을 시작하기 전에 최소 이틀 동안 파리를 어둠 속에 두십시오. 시간 제한 난자를 채취하려면 이른 아침에 신선한 효모 페이스트로 장식된 새 포도 한천 플레이트로 성체를 옮기고 성체가 4시간 동안 접시에 알을 낳을 수 있도록 합니다. 4 시간 후, 성인을 신선한 포도 한천 플레이트로 옮깁니다.

다음으로, 4시간 수집 플레이트를 섭씨 25도에서 밤새 배양합니다. 다음 날 오후쯤이면 대부분의 애벌레가 부화할 것입니다. 각 실험 그룹당 최소 50명을 확보하도록 계획합니다.

단일 분석 실행의 경우 실험 그룹당 최소 5개의 분석 플레이트를 준비합니다. 가열하여 16ml의 탈이온수에 700g의 파리 한천을 추가합니다. 95% 에탄올에 17.5ml의 니파젠을 준비합니다. 한천 용액이 거의 완전히 용해 될 때까지 가열하십시오. 그런 다음 한천 용액에 Nipagen 용액을 넣고 한천이 완전히 용해될 때까지 가열합니다. 한천 용액을 잠시 식힌 다음 10cm 플레이트에 15ml의 한천 용액을 넣습니다. 한천이 굳으면 접시에 뚜껑을 덮고 실온에서 몇 시간 또는 밤새 건조시킵니다.

경화된 한천은 만졌을 때 단단해야 하며 조각을 잘라낼 때 부서지지 않아야 합니다. 한천이 경화되면 1.5cm 코르크 천공을 사용하여 각 플레이트의 한천 젤에 중앙 구멍을 만듭니다. 그런 다음 신선한 효모 페이스트로 구멍을 깔끔하게 채웁니다.

유충을 분석 플레이트로 옮기려면 간단한 도구를 만드십시오. 플라스틱 마이크로주걱의 끝 부분으로 곡선을 구부리고 끝을 효모 페이스트에 담궈 유충에 접착되도록 합니다. 이제 첫 번째 instar 유충을 개별적으로 집어 음식 더미에 가까운 한천 접시에 놓습니다. 각 실험 그룹에 대해 각각 10마리의 유충이 있는 최소 5개의 플레이트를 준비합니다.

분석 복제 간의 재현성을 보장하려면 각 분석 플레이트에 10마리의 유충만 배치하는 것이 중요합니다. 마이크로주걱 끝으로 유충을 분만할 때마다 한 마리의 유충만 옮겨지는지 확인하기 위해 분석 플레이트를 주의 깊게 확인하십시오.

접시가 적재되면 라벨을 붙이고 덮은 다음 뚜껑 면이 위로 향하게 하여 실온에서 어두운 곳에 두십시오. 모든 유충이 죽거나 번데기가 될 때까지 매일 각 접시를 검사하십시오. 다음은 분석 2일차부터 8일차까지의 야생형 균주에 대한 플레이트의 예입니다. 둘째 날에는 유충이 먹이에 묻히고 터널이 생기지 않습니다. 터널 공사는 3일째에 시작되어 유충이 방황을 멈추고 터널에서 번데기가 되면서 5일에서 8일 사이에 최대에 이릅니다.

구부러진 놀리는 바늘로 번데기를 포도 접시에 조심스럽게 옮기고 원하는 경우 번데기가 얼마나 많은 번데기가 닫히는지 세십시오. 번데기의 형성을 기록하고 번데기의 이상 유무를 평가한다.