Drosophila Ensayo de madriguera y tunelización: un método para evaluar la hipoxia tisular en larvas de mosca

- Para instalar la jaula de recogida de embriones, utilice placas de agar de jugo de uva complementadas con pasta de levadura fresca y coloque los platos en jaulas que contengan moscas Drosophila machos y hembras del genotipo adecuado. El olor de la levadura y el jugo de uva es atractivo y promueve la colocación de huevos por las hembras. plato fue cortado y lleno de pasta de levadura.

Las larvas jóvenes deben alimentarse para ganar peso corporal para desarrollarse, por lo que se entierran en la fuente de alimento, la pasta de levadura. A medida que se desarrollan, las larvas entran en una fase errante y hacen un túnel lejos de los alimentos para buscar un sitio para la pupación. Para evaluar la hipoxia, examinar los patrones de tunelización se forman larvas en el sustrato.

- Establecer el control y las cruces genéticas experimentales en los platos de puesta de huevos como se describe en el protocolo de texto. Mantener las moscas en la oscuridad durante al menos dos días antes de comenzar a partir de las colecciones de huevos cronometrados. Para la recolección de huevos cronometrados, transferir a los adultos a nuevos platos de agar de uva decorados con un frotis fresco de pasta de levadura temprano en el día y permitir a los adultos poner huevos en los platos durante cuatro horas. Después de cuatro horas, transferir a los adultos a platos de agar de uva fresca.

A continuación, incubar las placas de recolección de cuatro horas durante la noche a 25 grados centígrados. Para la tarde siguiente, la mayoría de las larvas habrán eclosionado.

Para una sola ejecución del ensayo, prepare al menos cinco placas de ensayo por grupo experimental. Agregue 16 gramos de agar volador en 700 mililitros de agua desionizada calentando. Calienta la solución del agar hasta que se disuelva casi por completo. Luego agrega la solución de Nipagen a la solución del agar y calienta hasta que el agar se disuelva por completo. Enfríe brevemente la solución del agar, luego cargue las placas de 10 centímetros con 15 mililitros de la solución del agar.

El agar curado debe ser firme al tacto y resistirse a desmoronarse cuando las piezas se cortan de él. Una vez que el agar se haya curado, utilice un bómero de corcho de 1,5 centímetros para hacer un agujero central en el gel de agar en cada plato.

Para transferir las larvas a la placa de ensayo, haga una herramienta sencilla. Doble una curva en la punta de una microspaácula de plástico y sumerja la punta en pasta de levadura para hacerla adhesiva a las larvas. Ahora recoge las primeras larvas instar individualmente y colócalos en la placa del agar cerca del montículo de alimentos.

Para garantizar la reproducibilidad entre las réplicas de ensayo, es fundamental que solo se coloquen 10 larvas en cada placa de ensayo.

Una vez cargada la placa, etiquete, cúbrala, luego colóquela en la oscuridad con la tapa hacia arriba a temperatura ambiente. Examine cada plato diariamente hasta que todas las larvas hayan muerto o pupado. Aquí hay ejemplos de platos para una cepa de tipo salvaje desde el segundo día hasta el día ocho del ensayo. El segundo día, las larvas están enterradas en los alimentos y no se produce ninguna tunelización.

Transfiera cuidadosamente las pupas con una aguja de burla doblada a un plato de uva y, si lo desea, cuente cuántas pupas eclosa.