Embryogenesis 동안 중복 기능을 테스트하기 위해 역방향 유전자 접근

다른 유전자에 의해 보상이있다면 유전자 기능이 손실의 기능 실험에 드러나지 수 있습니다. zebrafish 모델은 생활 배아에서 이러한 기능 중복을 나타내기 위해 상대적으로 높은 처리량 방법을 제공합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 정의된 세포 계통의 사양에 대해 두 유전자가 기능적으로 중복되는지 확인하는 것입니다. 이는 먼저 발달 중인 제브라피시 배아에 주입된 유전자 특이적 모르포스를 사용하여 각 개별 유전자의 기능 상실 표현형을 정의함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 세포 계통 사양 지정 또는 분화를 정량화하기 위한 분석을 개발하는 것입니다.

예를 들어, 여기에서 보여드릴 것처럼 리포터 물고기 변형을 사용합니다. 절차의 세 번째 단계는 두 유전자의 기능 상실을 동시에 목표로 두 개의 morph FENO를 결합하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 이중 녹다운으로 인한 표현형을 평가하는 것입니다.

궁극적으로, 계통 리포터의 검사 또는 계통 특이적 마커에 대한 발현 분석을 통해 특정 계통의 세포에 대한 기능의 손실 또는 획득을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 마우스 모델에서 knockout을 결합하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 단일 실험에서 검증된 morphos를 결합하기만 하면 물고기 모델에서 2개 또는 3개의 유전자를 표적으로 삼을 수 있다는 것입니다. 100개 이상의 배아를 주입할 수 있으며 며칠에 걸쳐 표현형을 평가할 수 있습니다.

이 방법은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포의 운명을 조절하는 전사 경로를 정의하는 것과 같은 발달 생물학에서, 주요 조절 경로는 종종 기능적으로 중복되는 관련 유전자의 작은 계열로 표현됩니다. 따라서 그들의 역할은 자매 유전자의 보상으로 인해 마우스 녹아웃 연구에서 분명하지 않습니다.

이 모델은 제브라피시 배발생에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 동일한 유전 프로그램이 일반적으로 진화 전반에 걸쳐 잘 보존되기 때문에 그 결과를 마우스와 같은 다른 시스템에 적용할 수 있습니다. 배아를 주입하기 전에 미세주입판을 준비합니다. 어항 시스템에서 직접 가져온 깨끗한 물인 12%agros를 100mm 페트리 접시의 거꾸로 된 뚜껑에 약 2ml의 시스템 물을 붓습니다.

두 개의 현미경 슬라이드를 약 45도 각도로 뚜껑의 양쪽에 끼웁니다. 아그로스가 응고되면 뚜껑에서 슬라이드를 부드럽게 당겨 주입 모프 포 동안 배아가 쉴 곳을 만들고, 줄기는 주입하기 전에 1 밀리 몰 및 멸균 증류수 탈 이온수의 농도로 실온에서 유지됩니다. 모르포스 스톡을 섭씨 65도에서 5분 동안 배양하여 완전히 용액에 담겼는지 확인합니다.

스톡을 실온으로 식히십시오. 새로 설계된 각각의 morpho는 활성 및 배아 내성에 대해 경험적으로 검증되어야 합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에서 증류된 탈이온수에 스톡 모르포를 1-2회 연속 희석하여 1밀리몰, 0.5밀리몰, 0.25밀리몰 및 0.125밀리몰의 작업 농도를 산출합니다.

해부 범위 아래에서 흡입을 사용하여 마이크로 매니퓰레이터에 부착되고 적절한 위치에 있는 보정된 주사 바늘을 전면에 로드합니다. 바늘에 약 1마이크로리터의 가장 낮은 농도의 모르포 용액을 로드합니다. 전달 피펫을 사용하여 수정된 1세포 배아를 미세주입판의 홈통으로 이동합니다.

피펫을 사용하여 플레이트에서 과도한 물을 제거하여 배아가 물마루 바닥으로 떨어지도록 합니다. 주입판을 현미경 아래에 놓고 바늘을 코리온을 통해 노른자로 내려갑니다. 바늘을 제거하고 다음 배아에 접근하기 위해 주입 플레이트의 위치를 변경하기 전에 각 배아를 주입합니다.

주입을 배울 때 다음과 같이 세포로의 주입을 시각화하기 위해 바이탈 염료를 사용하는 것이 도움이 될 수 있으며, 배아를 섭씨 28.5도에서 시스템 수질 배양과 함께 100mm 페트리 접시로 다시 옮깁니다. 바늘에서 남아 있는 모르포 용액을 모두 배출하고 적절한 발달 단계에서 다음 배아 배치를 주입하기 위해 다음으로 높은 농도의 모르포로 채웁니다. 주입된 각 모르포 농도에서 표현형에 대해 배아를 검사합니다.

각 morpho에 대한 임계값은 정의된 신뢰할 수 있는 표현형이 있는 가장 낮은 용량입니다. 부정확한 임계값을 정의하기 위해 여러 차례의 적정이 필요할 수 있습니다. 두 개의 서로 다른 유전자 사이의 유전적 상호 작용을 찾는 것입니다.

관심 있는 두 가지 morphos의 혼합물을 준비하며, 각각은 해당 임계값 농도에서 준비합니다. 배아는 주사당 20나노그램 이상의 총 모르포를 견디지 못할 수 있다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 이전과 같은 방법으로 배아를 주입합니다.

실험군과 대조군 간에 주입량을 일정하게 유지하며, 여기에는 해부 현미경에서 각 모르포만으로 주입된 세트가 포함되어야 합니다. 주입된 배아를 주사 직후 모니터링하고 하루 종일 여러 번 이식 피펫을 사용하여 죽거나 죽어가는 배아를 제거합니다. 이는 이식으로 남아 있는 모르핀의 생존력을 손상시킬 수 있기 때문에 피펫은 언제든지 배아를 이동, 진정제 또는 안락사시킵니다.

관찰을 위해 함몰 슬라이드를 가리킵니다. 사진 촬영용. 필요한 경우 날카로운 집게를 사용하여 코리온을 제거하십시오.

3%메틸 셀룰로오스 스크리닝 배아의 한 방울에서 배아를 안정화하여 뚜렷한 표현형을 나타내며, 이는 단일 모르핀의 표현형의 더 큰 침투력과 대조적으로 모르포스의 조합에 고유합니다. 다음은 역치에서 모르포를 주입할 때 발생하는 몇 가지 야생형 배아입니다. gata five의 경우, 전형적인 표현형은 심장 이분증(cardio bifida) 또는 두 개의 심장(two hearts)인데, 이는 전구 세포가 정중선에서 융합하지 못했기 때문입니다.

화살표로 표시된 GFP 양성 심근세포를 주목하십시오. 6개의 모르핀에 대한 표현형에는 제대로 고리를 이루지 못하는 기형적인 심장이 포함되어 있습니다. 이 배아는 또한 GFP 양성 심근세포를 발달시킵니다.

그러나, 여기에 나타난 가타 5 및 가타 6 모르포의 조합으로 주입된 배아. 심근세포 발달의 총 소실을 보임은 심근세포가 발현되기 위해서는 gata five 또는 gata six가 발현되어야 함을 나타냅니다. 두 유전자는 심근세포 사양에 대해 기능적으로 중복됩니다.

이 절차를 시도하는 동안 먼저 morphos를 완전히 검증하고 이 절차를 따라 단일 유전자 표적의 진정한 녹다운을 나타내는지 가능한 한 확신하는 것이 중요합니다. 동일한 유전자가 기능한다는 것을 보여주기 위해 조건부 마우스 null 대립유전자를 결합하는 것과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 포유류도 마찬가지입니다.

비디오를 시청한 후에는 배발생 중에 두 유전자가 기능적으로 중복되는지 확인하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.