Name: Embryogenesis 동안 중복 기능을 테스트하기 위해 역방향 유전자 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 배우세요 제브라피시(Danio rerio) 배아에서 유전자 특이적 모르핼리노 주입을 활용한 역방향 유전자 접근법으로 중복 기능을 테스트하는 방법입니다. 이 기술은 세포 계통 명세를 정량화하고 보상 메커니즘을 밝히는 데 도움을 줍니다.

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이 프레 젠 테이션을 준비하는 그들의 도움 에반스 실험실 구성원 감사합니다. 여기에 사용되는 morpholinos는 원래 박사 오드리 Holtzinger에 의해 확인되었다. TE는 국립 보건원 (HL064282 및 HL056182)에서 기금에 의해 지원됩니다. 동물 실험은 웨일 코넬 메디컬 칼리지의 동물 관리 및 사용위원회 연구소에 의해 명시된 지침 및 규정에 따라 수행되었다.

<ol><li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li>
<li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li>
<li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

실험이 여기에 설명된에서는, 우리는 두 morpholinos 혼자 phenotypes의 독특한 범위를 생성하는 각각을 결합하고, 그들이 함께 공동으로 주입되었다 완전히 다른 표현형을 발견했습니다. 물론, 우리는 처음부터이 실험을 수행하는 명분이 필요했습니다. 우리는 두 유전자이 경우 심장 사양에, 이전 기능에 대한 서로를 보상 수도 의심. 유전자가 매우 관련이 있습니다 (같은 DNA 시퀀스에 바인딩 수)과 5 embryogenesis 동안 패턴을 중복으로 표현되기 때문입니다. 또한, Drosophila의 유전자 실험은 가타의 전사 요소 심장 사양 6 필요합니다 지적했다. 그러나이 전략은 유전자 상호 작용에 대한 더 일반적으로 기능 중복 또는 테스트에 사용될 수있는 다른 상황이있다. 첫째, 하나 또는 둘 모두 유전자의 분해는 명백한 표현형를 생성하지 않을 수도 있습니다. 이 경우, 각 유전자에 대한 정의 임계값 수준가 없으...

<table><tbody><tr><td>물고기 사육 수조 및 격벽</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>물고기 뜰채</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시스템 용수</td><td></td><td></td><td>dH2O 리터당 60mg Instant Ocean&amp;#8221;</td></tr><tr><td>100mm 페트리 접시</td><td>BD Biosciences</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 니들 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97 Flaming/Brown</td><td></td></tr><tr><td>3.5&quot; 유리 모세관</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Personna Medical Care</td><td>94-120-71</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 그라인더</td><td>Narishige International</td><td>EG-4</td><td></td></tr><tr><td>눈금형 현미경 접안렌즈</td><td>Premiere</td><td>MF-02</td><td></td></tr><tr><td>마이크로미터</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>초고순도 아가로스</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>스파출라</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>일회용 칭량접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>2-202-B</td><td></td></tr><tr><td>일반 전자레인지</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>삼각 플라스크</td><td>Corning</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552</td><td></td></tr><tr><td>메스실린더</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6D</td><td></td></tr><tr><td>자동 피펫맨</td><td>BrandTech</td><td>2026333</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올 세척액</td><td>Tarr</td><td>801VWR</td><td></td></tr><tr><td>N2 탱크</td><td>Tech Air</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로인젝터</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터</td><td>Micro Instruments</td><td>LTD</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>American National Can</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>킴와이프스</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata5&lt;/em&gt; 스플라이스 사이트 모르폴리노</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>gata5 ATG 블로커</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata6&lt;/em&gt; 롱 이소폼 ATG 블로커</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>일회용 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine Methanesulfonate</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>메틸셀룰로스</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155495</td><td></td></tr><tr><td>히팅 블록</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-4</td><td></td></tr><tr><td>정밀 핀셋</td><td>Dumont</td><td></td><td>Size 55</td></tr><tr><td>오목 슬라이드 글라스</td><td>VWR international</td><td>48339-009</td><td></td></tr></tbody></table>

embryogenesis 동안 중복 기능을 테스트하기 위해 역방향 유전자 접근

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

embryogenesis 동안 유전자 기능은 일반적으로 마우스를 대상으로 돌연변이 유발 (녹아웃)에 의해 예를 들어, 손실의 기능을 실험에 의해 정의됩니다. zebrafish 모델에서 효과적인 반대로 유전자 기술은 유전자 특정 안티 센스 morpholinos의 microinjection을 사용하여 개발되었습니다. Morpholinos은 embryogenesis (최저)에 며칠 동안 억제 번역 또는 splicing에 의해 transiently 특정 기본 - 페어링 및 차단 유전자 기능을 통해 mRNA를 타겟팅할 수 있습니다. 그러나, 마우스 또는 zebrafish과 같은 척추 동물에서 일부 유전자의 기능이 손실에 대한 보상 다른 유전자의 존재로 인해 이러한 방식으로 드러나지 수 있습니다. 이 같은 개발 조직의 공동 표현 자매 유전자를 포함한 유전자 가족에 특히 사실이다. zebrafish에서 기능성 보상은 morpholinos의 공동 주입하여 상대적으로 높은 처리량 방식으로 테스트할 수있는 동시에 유전자의 대상 최저. 마찬가지로, morpholinos를 사용하여 임의의 두 유전자 사이에 유전자 상호 작용이 하위 임계값 수준에서 함께 두 유전자의 분해에 의해 입증하실 수 있습니다. 예를 들어, morpholinos는 어느 개인의 분해가 표현형을 생성 이러한 titrated 수 있습니다. 이러한 조건에서 두 morpholinos의 공동 주사가 표현형 원인 경우, 유전자 상호 작용이 나타납니다. 여기 두 관련 가타의 전사 요소의 컨텍스트에서 기능 중복을 표시하는 방법을 보여줍니다. 가타 요인은 심장 progenitors의 사양에 필수적인,하지만 이것은 Gata5와 Gata6 모두의 손실에 의해 드러났습니다. 우리는 microinjection 실험을 수행 morpholinos를 확인하고, cardiogenesis에 대한 보상 표현형을 평가하는 방법을 보여줍니다.

다른 유전자에 의해 보상이있다면 유전자 기능이 손실의 기능 실험에 드러나지 수 있습니다. zebrafish 모델은 생활 배아에서 이러한 기능 중복을 나타내기 위해 상대적으로 높은 처리량 방법을 제공합니다.

Embryogenesis 동안 중복 기능을 테스트하기 위해 역방향 유전자 접근

배아 발생 과정 중의 유전자 기능은 일반적으로 기능 상실 실험, 예를 들어 생쥐의 표적 돌연변이 유발(넉아웃) 등을 통해 정의됩니다. ...

이 절차의 전반적인 목적은 두 유전자가 특정 세포 계보의 지정에 있어 기능적으로 중복되는지 여부를 판단하는 것입니다. 이는 먼저 발달 중인 제브라피쉬 배아에 유전자 특이적 morpholino를 주입하여 각 개별 유전자의 기능 상실 표현형을 정의함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 세포 계보의 지정 또는 분화를 정량화하기 위한 분석법을 개발하는 것입니다.예를 들어, 여기서 보여줄 리포터 어류 계통을 사용하는 방법이 있습니다. 절차의 세 번째 단계는 두 개의 morph FENO를 결합하여 두 유전자의 기능 상실을 동시에 유도하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 이중 넉다운(double knockdown)으로 인해 나타나는 표현형을 평가하는 것입니다.최종적으로, 계통 리포터를 조사하거나 계통 특이적 마커의 발현을 분석함으로써 특정 계통 세포의 기능 상실 또는 획득을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 마우스 모델에서 녹아웃을 조합하는 것과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 검증된 모르포노(morphos)를 단일 실험에서 조합함으로써 어류 모델에서 두 개 또는 세 개의 유전자까지 간단히 타겟팅할 수 있다는 점입니다. 100개 이상의 배아에 주입이 가능하며, 며칠에 걸쳐 표현형을 평가할 수 있습니다.이 방법은 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 운명을 조절하는 전사 경로를 정의하는 것과 같은 발생생물학 분야에서, 주요 조절 경로는 종종 기능적으로 중복되는 관련 유전자들의 작은 가족군으로 나타납니다. 따라서 이러한 유전자들의 역할은 자매 유전자의 보상 작용으로 인해 마우스 녹아웃 연구만으로는 분명하게 드러나지 않습니다.이 모델은 제브라피시 배아 발생에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 동일한 유전적 프로그램이 일반적으로 진화 과정 전반에 걸쳐 잘 보존되어 있기 때문에 마우스와 같은 다른 시스템에도 그 결과를 적용할 수 있습니다. 배아에 주입하기 전 미세주입 플레이트를 준비하십시오. 100 밀리미터 페트리 접시의 뒤집힌 뚜껑에 어항 시스템에서 직접 채취한 깨끗한 물인 시스템 워터에 희석된 2% agros 약 12 밀리리터를 붓습니다.두 개의 현미경 슬라이드를 뚜껑의 양측면에 약 45도 각도로 걸쳐 놓습니다. 아가로스가 응고되면 슬라이드를 뚜껑에서 조심스럽게 당겨, 주입 과정 동안 배아가 놓일 홈을 만듭니다. morpho stock은 주입 전까지 상온에서 1mM

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연구

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Biology

생물학

이러한 유전자의 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사를 사용하여 조직 재생 등의 개발 및 생리 학적 항상성 이후 단계에서 유전자 기능을 평가하는 제브라 피쉬에 대한 적응력이 역 유전 방법.

Zebrafish의 유충의 여러 어려운 대상 조직을 형질 심장 심실 사출을 사용하여 유전 모르 폴리 노의 접근을 반전

우리는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자의 발현을 위한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 설명하고 이러한 유전자의 후속 분석을 위한 기술에 대해 논의합니다. 이 시스템은 광범위한 유전자 산물의 기능적 식별에 유용합니다.

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

이 프로토콜의 목표는 loss-을 설명하고 이득의 trophectoderm 및 착상 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 분화에 이르게 무대 특정 수용체​​로 neogenin 확인할 적용 기능 방법입니다.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다.

단순함의 힘 : 같은 성게 배아<em&gt; 생체</em&gt; 복잡한 세포 간 신호 전달 네트워크의 상호 작용 유학을위한 발달 모델

선물이 분열에 간단한 억압 화면 프로토콜 효 모. 이 방법은 효율적, 돌연 무료이 고 단일 게놈 소재 시에 자주 발생 하는 돌연변이 대 한 선택적입니다.  프로토콜은 진압 완화 돌연변이 또는 약물에 의해 발생 하는 액체 문화에서 성장 결함 격리 적합 합니다.

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

어둠 / 빛으로 전환 시험은 마우스의 동작과 같은 불안을 측정하기 위하여 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 여기, 우리가 테스트를 실시하는 방법에 대한 자세한 절차를 보여주는 동영상을 제시한다.

마우스에 대한 진한 / 라이트 전환 테스트

이 비디오는 새로운 문화, 병아리의 배아는 최대 24 시간까지 계란 이외의 양식하는가하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 초기 개발 (14 솜으로 원시적인 승리.) 마우스 E7 - 9에 해당하는 기간 동안 공부를 하나 있습니다. 이 기술의 응용은 현장 하이브리드화과 immunohistochemistry에 electroporation을 포함합니다.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

이 비디오는 현장 하이브리드화, 2 개의 다른 유전자의 공간과 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 배아에서 시각 될 수있는 방법 2 색 전체 마운트를 보여줍니다. 이 방법은 원래 데이비드 윌킨슨, 도밍고스 헨리크, 필 잉엄 데이비드 이쉬 - Horowicz에 의해 도입되었다.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

신경 유도는 뇌의 형성의 첫 단계입니다. 그것은 Hensen의 노드 (주최자), 신경 운명을 채택할에 인접한 조직을 지시하는 메커니즘이며, 신경 계통을 일으키다하는 즉. 이 비디오는 여자의 배아에서 신경 유도에 대한 분석을 보여줍니다.

칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

배우세요 제브라피시(Danio rerio) 배아에서 유전자 특이적 모르핼리노 주입을 활용한 역방향 유전자 접근법으로 중복 기능을 테스트하는 방법입니다. 이 기술은 세포 계통 명세를 정량화하고 보상 메커니즘을 밝히는 데 도움을 줍니다.

Embryogenesis 동안 중복 기능을 테스트하기 위해 역방향 유전자 접근

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