Name: 를 사용하여 기능성 복제 Xenopus의 난자 발현 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 배우세요 Xenopus 난자 및 동물 모자 조직을 이용한 기능성 복제 발현 시스템으로, 유도 반응을 일으키는 유전자를 식별하고 발달 생물학에서 유전자 기능을 분석하는 방법을 익히세요.

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이 작업은 Shepherd University Foundation의 C.Z.P.에 대한 Professional Development Grant의 지원을 받았습니다. 저자는 프로토콜에 대한 유용한 토론을 해준 Brett Zirkle과 Malia Deshotel, 그리고 관대한 도움을 준 Carol Hurney 박사에게 감사를 표합니다.

모든 실험 절차는 버지니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다. 참고도 1은 실험 과정의 개략도를 나타낸다. 난자 1. 준비 <ol><li> 사전 프라임 (X) 난 모세포의 분리에 앞서 임신 마레 혈청 성선 자극의 150 U (PMSG) 약 1 주일와 여성을 laevis의. 29 G 바늘 1 CC 멸균 주사기 등의 림프 낭에 1 ml의 150 U / ㎖의 PMSG를 주사. </li><li> 난 모세포 주입 및 난자 동물 캡 분석을위한 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 칼슘을 준비 ++ / 마그네슘 + + - 무료 OR2 (OR2-) : 82 mM의 염화나트륨, 2.5 밀리미터의 KCl, 1.5 밀리미터 나 2 HPO 4, 50 mM의 HEPES pH가 7.2. </li><li> OR2- 플러스 1 mM의 염화칼슘 2, 1 밀리미터의 MgCl 2 : OR2를 준비합니다. </li><li> 60 % 라이 보 비츠 L15, 0.4 ㎎ / ㎖ BSA, 100 μg의 / ㎖ 겐타 마이신, pH가 7.8 : OCM을 준비합니다. </li><li> 사전1X MBS 깎다 : 88 mM의 염화나트륨, 1 mM의 KCl을을 0.7 mM의 CaCl2를, 1mM의 황산, 5 mM의 HEPES (PH 7.8), 2.5 mM의 NaHCO3을. </li><li> 1X MBS의 3 % 피콜을 준비합니다. </li><li> 1X NAM을 제조 : 110 mM의 염화나트륨, 2 밀리미터의 KCl, 1 mM의 칼슘을 (NO 3) 2, 1mM의 황산, 0.1 mM의 EDTA, 1mM의 NaHCO3을, 2 mM의 나트륨 3 PO 4, pH가 7.4. </li></ol></li><li> 0.1X MBS 에틸 -3- 아미노 벤조 에이트, 메탄 술폰산 염을 0.03 % 용액 (MS222)으로 여성 마취위한 용액 개구리 배치하여 (제 10 ml의 95 % 에탄올 중의 0.3 g의 MS222을 용해하고 1 L 0.1X의 MBS에 희석) 10-15 분 또는 응답하지 않는 때까지. <ol><li> 그 마취가 응답하지 않도록 (불완전 마취 된 개구리가 사지를 움직이거나 몸을 뒤집)하기 위해 다시에 마취 된 개구리를 돌려 완료 확인합니다. </li></ol></li><li> 수술 집게로 난소 조직을 분리, 메스 블레이드와 피부 및 신체 벽을 통해 복부 절개를하여 난소 조각을 분리가위. OR2-에 난소 조각을 놓습니다. 24mm 곡선 바늘에 3-0 실크 봉합사와 신체 벽을 닫고 같은 봉합 별도로 피부를 닫습니다. 물에 1g / L 수족관 소금에 여성의 복구를 허용합니다. </li><li> (- 20 난자 10) 조각과 신선한 OR2-로 전송 작은으로 미세 집게, 눈물 난소 조직을 사용. </li><li> 1 시간 동안 진탕 기에서 부드럽게 교반 신선한 콜라게나 제에 전송하고 하나의 추가 시간 동안 교반하여 OR2- 2.0 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제에 Defolliculate 난소 조각. </li><li> 워시 작은 난자를 폐기 OR2에 [칼슘 + + / 마그네슘 + +를 ​​포함하는 10 번, 난자. </li><li> OCM에 두 번 난자를 세척하고 신선한 OCM에 전송합니다. 육안 검사에 크기에 따라 단계 VI 난자를 분리하고 미숙 (작은) 난자를 폐기 : 단계 VI 난자는 동물 반구도 색소 침착과 미성숙 난자보다 큰 약 직경 1.2-1.4 mm이다. </li><li> 20 ° C 형 I - 18에서 난자를 유지주입하기 전에 N OCM. 주 : 아가 로스 코팅 페트리 접시는 접시 난자의 점착을 최소화하기 위해 사용될 수있다. </li></ol> 도서관 성적 증명서 2. 사출 <ol><li> 개발의 적절한 단계 (예를 들어, 신경 판 단계 14 10)에서 추출 방향 cDNA 라이브러리 (15) 사용하여 RNA를 준비합니다. cDNA 라이브러리를 구입하거나 아래의 4 단계 개요 당 상용 키트를 사용하여 하나를 구축합니다. <ol><li> 폴리 (A) + RNA (재료의 표 참조) 풍부하게 제품을 사용하고 제조업체의 지침에 따라 약 5 μg의 mRNA의를 격리합니다. 주 : 사체 (원하는 조직의 미세 절제 다음과 같은 신경 판으로) 유도 조직에 한정 될 수있다 cDNA 라이브러리를 생성하기 위하여 사용되는, 또는 특정 단계에서 전체 배아 일 수있다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라, 상용 키트의 cDNA를 생성합니다. </li><li> vecto로 cDNA를 NG 약 20 결찰R은 상용 키트 또는 다른 적절한 벡터에 포함. 적절한 플라스미드 벡터는 mRNA의 안정성 등 5 &#39;β-글로빈 3 폴리 (A) 시퀀스 (PCS2 +, pTnT, pCS105)에 대한 시퀀스를 포함한다. </li><li> 열충격 형질 전환 공급자의 권장 프로토콜을 사용하여 능력 균체 내로 결찰 변환. 참고 : 또는 오픈 리딩 프레임 (ORFeome) 클론의 수집이 시판되고 주입 전 사체를 생성하기 위해 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 10 4 복잡성 (10월 4일에서 10월 5일까지 총 복잡성) 10 (3)의 플라스미드 (10) 풀을 준비합니다. 10,000 식민지 각 - 이것은 1000 10 판을 나타냅니다. <ol><li> 37 ℃에서 18 시간, 7 ㎖의 (LB)에 유리 스프레더와 부드러운 압력에 의해 각에서 식민지를 수집 - 플레이트 도서관 문화 10 15-CM LB-암피실린 플레이트 상에, (12)을 성장 </li><li> 0.5 ml의에서 글리세롤 주식을 준비합니다 (-20에서 0.2 ml의 멸균 글리세롤 및 저장에 추가# 730; C), 및 표준 제조사의 지침에 따라 시판중인 DNA 미니 프렙 키트 DNA를 제조 6.5 mL의 나머지를 사용한다. </li></ol></li><li> 1.5 시간 - 효소 (1) 37 ℃에서 16 다이제스트 적절한 제한과 - (2.0 μg의 1.0) 풀링 된 플라스미드 DNA를 선형화. 사용 된 RNA 폴리머 라제 키트의 사양에 물 및 에탄올 침전에 재 부유 한 다음 페놀 / 클로로포름 추출과 선형화 된 DNA를 분리. 제조업체의 지침에 따라 상업 RNA 중합 효소 키트 센스 RNA를 합성. </li><li> 약 20 μm의 직경 (유리 모세관 튜브와 바늘 풀러를 사용하여) 미세 주입 용 바늘을 준비; 교정 된 안구 마이크로 미터와 복합 현미경에 바늘 끝을 측정한다. 참고 : 니들 풀러 설정이 미세 집게로 깨진 경우 원하는 팁 크기를 얻을 수 있도록 좋은 팁 바늘을 생산하는 경험적으로 결정되어야한다. </li><li> (에 점토를 밀어를 준비접시의 바닥)에 균일 한 층 점토 늘어선 35 X 10mm 미세 주입하는 동안 장소에 난자를 유지하는 병렬 홈으로 배양 접시를; 불꽃의 끝에서 융합 쇼핑몰 프로브 또는 파스퇴르 피펫으로 홈을 생산하고 있습니다. 점토에 대한 대안으로서, 엘라스토머 (17)와 톱니 형을 아가로 요리를 준비한다. 점토 늘어선 요리의 행에 1X MBS의 3 % 피콜 (약 2 ㎖)에 넓은 구멍 피펫으로 전송 난자. </li><li> 마이크로 인젝터를 사용하여, 1 NG / NL RNA와 바늘을 작성하고 (난자 세포질의 그리기 방지하기 위해) 약간의 긍정적 인 압력을 생산하기 위해 균형을 조정합니다. </li><li> 적도 지역에서 약 20 NL RNA와 난 모세포를 주입한다. 다음, 피콜-MBS에 남아 1X MBS에 부드럽게 전송 주입 난 모세포에 대한 1 시간을 허용합니다. 이전에 동물 캡 분석에 20 ℃에서 24 시간 - 8 품어. </li></ol> 3. 동물 모자 분석 <ol><li> 미세 집게, 헤어 루프, 곡선 coverslip에 조각, 점토 늘어선 DIS 3 / 4 배 NAM을 준비하고 획득컵 모양의 톱니와 HES는 난자를 개최합니다. 곡선 부분을 생산, (4 MM - - 2 MM × 2 약 1)과 가장자리 광택과 처지까지 불꽃을 통과하는 작은 조각으로 커버 글라스를 따로 끊어서 곡선 coverslip에 조각을 확인합니다. </li><li> X를 기름지게 laevis의 달걀 체외 또는 자연 교배와 단계 낭배하는 문화를 통해 18 - 이전 단계에 의해 정렬에 0.1X MBS (10 실온에서 11 시간 포스트 수정을); 10 배아 - 중간 낭배 (11.5 단계 11)를 수집합니다. </li><li> 3 / 4 배 NAM와 약 반 전체 배양 접시로 전송 배아. 미세 집게 두 쌍을 사용하여, gastrulae에서 수정 (난황) 막을 제거합니다. </li><li> 전송 점토 늘어선 요리 3 / 4 배 NAM (약 2 ㎖)에 난자 홈이 상기 된 개별 배아를 수용하기 위해 인상을 생산, 점토의 개별 노출에 고정. </li><li> 점토 늘어선 요리로 전송 배아 및 G 오프 동물 모자를 잘라astrulae 잘 포셉 두 쌍을 사용하여. 만 아니라 적도 조직 (18) 동물 모자 외배엽을 분리주의하십시오. </li><li> 난자와 접촉하는 동물 캡의 내부 표면과 각 난자의 동물 반구에 동물 캡을 놓습니다. 8 시간 이상 - 6 난자의 표면에 노출 된 내부 층으로 열려있다 (커버 슬립 연락처 동물성 캡 점토 외배엽 평탄화, 곡면 유리 커버 슬립 단편을인가하고, 유리로 하향 압력을인가하여 재조합을 함께 보유 ). , 또는 위쪽을 향 내면에 점토 들여 쓰기에 동물 캡을 배치하고 뚜껑에 난자를 배치; 참고 : 점토의 작은 확장자를 가진 재조합을 고정합니다. </li><li> 20 ° C에서 문화 제어 배아는 분석 무대를 원하는에 도달 할 때까지. </li><li> 커버 슬립 / 진흙을 제거하고 집게와 헤어 루프 외배엽을 분리하여 별도의 재조합. </li><li> MEMFA에서 1 시간 (3.8 %를 외배엽 조각을 수정(MEM) [0.1 M MOPS의 pH가 7.4, 2 mM의 EGTA, 1 mM의 황산 4]에서 포름 알데히드). </li><li> -20 ℃에서 에탄올과 저장소로 MEMFA에서 전송 조각 (및 제어 배아). </li></ol> 에서의 현장 하이브리드 화에 의한 외배엽에서 응답 4. 분석 (ISH) <ol><li> ISH을위한 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 1X PBS를 준비 : 0.01 M 인산 완충 식염수, 염화나트륨 0.138 M, pH가 7.4 </li><li> 제조 PBS-트윈 (PTW) 1X PBS, 0.1 % 트윈 -20 </li><li> 100 × 덴 하르트의 용액을 제조 하였다 : 2 % BSA, 2 % 폴리 비닐 피 롤리 돈을, 2 % 피콜 </li><li> 혼성화 완충액을 제조 50 % 포름 아미드, 5 배 SSC, 1 mg의 / ㎖ torula 효모 RNA, 1 μg의은 / ㎖ 헤파린 1X 덴 하르트의 용액, 0.1 % 트윈 -20, 0.1 % CHAPS, 10 mM의 EDTA, DEPC-H 2 O </li><li> 제조 말레 산 완충액 (MAB) : 100 mM의 말레 산, 150 mM의 염화나트륨, pH가 7.5 </li><li> (용해 60 ℃에 열) MAB, 2 % 시약을 차단 : MAB + 블록을 준비 </li><li> 100 mM 트리스 : 알카라인 포스파타제 (AP) 버퍼를 준비합니다pH가 9.5의 50 mM의 MgCl 2, 100 mM의 염화나트륨, 0.1 % 트윈, DH 2 O </li></ol></li><li> RNA 프로브를 준비합니다. <ol><li> 1.5 ML 튜브 (50 μL 반응)에 추가, 상업 RNA 중합 효소 키트를 사용하여 혼합 - NTP의 발굴 : 25.5 μL의 DEPC-H 2 O, 10 μL 5 배 전사 버퍼, 2.5 μL 10 배 발굴-NTP 믹스, 5 μL 100 밀리미터 DTT, 2 μL RNAsin, 2 μL 선형화 DNA 주형 (~ 1 μg의 / μL), 3 μL RNA 중합 효소와 90 분 동안 37 ℃를 품어. </li><li> 2 μL RNA 중합 효소를 추가하고 60 분 동안 37 ℃를 품어. </li><li> 1 % 아가 로스 젤에 반응 2 μL를 확인합니다. </li><li> 1 μL의 RQ1 RNA 분해 효소가없는 DNase를 추가하고 20 분 동안 37 ℃를 품어. </li><li> 50 μL의 DEPC-H 2 O, 25 ㎕의 10 M 암모늄 아세테이트 및 에탄올 313 μL를 첨가하여 침전물을 프로브. -20 ℃에서 보관 하룻밤 (O / N)은 다음 20 분 동안 13,800 XG에서 원심 분리하여 RNA를 복구 할 수 있습니다. 간단히 회전, 500 μL 75 % 에탄올로 세척, 제거에탄올과 공기 건조에 펠렛을 할 수 있습니다. 추가 50 μL의 DEPC-H 2 O </li><li> 0.5 μg의 / μL ~의 최종 농도 하이브리드 버퍼를 추가합니다. </li></ol></li><li> 하이브리드를 위해 조직을 준비합니다. 특별히 언급하지 않는 한, 각 솔루션의 변화를 설명 (약 4 mL)로 정상에 튜브를 입력합니다. <ol><li> 수평 로커에, 10 분 각 75 % 에탄올 / PTW, 다음 50 % 에탄올 / PTW에 튜브 및 이식란으로부터 에탄올을 제거합니다. </li><li> 5 분 로커에 각각 PTW에 세 번 씻으십시오. </li><li> 10 μg의 PTW에서 / μL 테 K 처리로 이동; 바위 튜브를 수직으로 15 분. </li><li> 수직 바위 튜브 - 0.1 M 트리에탄올 아민 pH가 7.8에 두 번 10 분 각 씻어. </li><li> 튜브에 12.5 μL에게 무수 초산을 추가하고 수직으로 5 분 바위. 5 분 동안 추가로 12.5 μL 아세트산 무수물로 반복한다. </li><li> 로커에 분 수직 PTW 5 씻으십시오. </li><li> 로커에 4 % 파라 포름 알데히드 20 분에 REFIX. 열 하이브리드 버퍼60 ℃에. </li><li> 5 분 로커에 각각 PTW에 세 번 씻으십시오. </li><li> 250 μL HYB 버퍼를 각 튜브에서 PTW의 모든하지만 ~ 1 ml의를 제거하고 추가; 부드럽게 섞어 튜브를 소용돌이 친다. 락 튜브를 수직으로 5 분. </li><li> 60 ℃ HYB 버퍼 (0.5 ml)로 교체하고 60 ℃ 10 분에서 부드럽게 교반. 신선한 HYB 버퍼로 교체하고 60 ℃에서 2 4 시간에서 교반. </li><li> 열 프로브 (60) C (3 분)에 (0.5 μg의 HYB 버퍼에 / μL에서 1 ㎖). HYB 버퍼를 제거하고 튜브에 프로브를 추가 할 수 있습니다. O / N은 ​​60 ℃에서 부드럽게 선동. </li></ol></li><li> 항체를위한 조직을 준비합니다. <ol><li> 60 ℃로 따뜻한 HYB 버퍼 및 배 SSC + 0.1 % 트윈 20 솔루션을 제공합니다. </li><li> (- 배 재사용이 -20 ℃에서 프로브를 저장) HYB 버퍼와 프로브 솔루션을 교체합니다. 10 분 동안 60 ℃에서 씻으십시오. </li><li> 배 SSC-트윈에서 60 ℃ (20 분 교반과 함께 각)에서 세 번 씻으십시오. </li><li> 0.2X SSC-트윈에서 60 ℃ (20 분 교반과 함께 각)에서 세 번 씻으십시오. </li><li> 로커에 15 분마다 수평에 대해 MAB (RT)에 두 번 씻으십시오. </li><li> 1 ML의 MAB + 블록을 추가합니다. 로커에 수직으로 2 시간을 씻으십시오. </li><li> 1 / 2,000 안티 digoxygenin-AP를 포함하는 1 ML의 MAB + 블록에 전송. 4 주 / N에서 수직 바위. </li></ol></li><li> 색상 시약을위한 조직을 준비합니다. <ol><li> MAB와 항체 솔루션을 교체; MAB 5 분마다 수평 로커에 세 번 씻는다. </li><li> MAB 1 시간에 각각의 수평 로커에 세 번 씻으십시오. </li><li> AP 버퍼 10 분에 각각 수평 로커에 두 번 씻으십시오. </li><li> 여러 웰 플라스틱 트레이로 조직을 이동 AP 버퍼를 제거하고 BM에게 보라색 시약을 추가 (1 ~ ㎖). 반응이 O / N 어두운 5 분에 할 수있게합니다. </li><li> 적절한 염색이 달성되면, PTW의 바이알에 조직을 전송. 로커에 PTW에 두 번 10 분 각각을 씻으십시오. </li><li> 로커에 4 주 / N에서 Bouin의 솔루션에 고정합니다. </li><li> 실온에서 Bouin의 세 70 % 에탄올 / 30 % PTW 세척과를 세척 할 것. T를 진행필요한 경우 18 에피 조명 및 현미경에 장착 된 카메라, 표백을 사용 O 이미지 캡처. </li></ol></li></ol> 5. SIB 선정 및 복제 <ol><li> 가장 높은 활성을 선택 풀 (외배엽 조직에 가장 큰 응답). </li><li> (위의 프로토콜 섹션 2를 사용) 이전 단계의 식민지를 가장 높은 활성을 가진 풀의 글리세롤 주식을 (적절한 밀도 LB로 희석) 약 십분의 일에 열 새로운 판을 판 적정한다. </li><li> 활동이 하나의 식민지로 추적 될 때까지 풀의 크기를 줄입니다. </li><li> 벡터 표준 프라이머를 이용하여 DNA 서열을 얻습니다. </li></ol>

<ol><li>Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Screens+in+Xenopus.+Using+Transposon-Mediated+Insertional+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).</li>
<li>Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tropicalis.+as+a+Model+Organism+for+Genetics+and+Genomics%3A+Past%2C+Present+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).</li>
<li>Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Targeted+Mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51, 835-843 (2013).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis.</a> Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+Genetic+Studies+Using+Antisense+Morpholino+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injected+Xwnt-8.+RNA+acts+early+in+Xenopus.+embryos+to+promote+formation+of+a+vegetal+dorsalizing+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center.</a> Cell. 67, 753-765 (1991).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin.%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+in+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+of+induction+of+anterior+head+ectodermal+properties+in+Xenopus.+embryos+are+mediated+by+transcriptional+cofactor+ldb1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus.+ectoderm%3A+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Development. 112, 177-188 (1991).</li>
<li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+P+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).</li>
<li>Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+Siamois.%2C+a+Xenopus.+homeobox+gene+expressed+in+dorsal-vegetal+cells+of+blastulae+and+able+to+induce+a+complete+secondary+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis.</a> Cell. 81, 85-94 (1995).</li>
<li>Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+a+Xenopus+T.-related+gene+%28Xombi.%29+involved+in+mesodermal+patterning+and+blastopore+lip+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation.</a> Development. 122, 4001-4012 (1996).</li>
<li>Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus.+dorsalizing+factor+Gremlin+identifies+a+novel+family+of+secreted+proteins+that+antagonize+BMP+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities.</a> Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).</li>
<li>Lustig, K., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+oocyte+expression+assay+to+reconstitute+inductive+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li>Viczian, A., Zuber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Determination+Using+the+Animal+Cap+Transplant+%28ACT%29+Assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis.</a> J. Vis. Exp. (39), e1932(2010).</li>
<li>Sive, H., Grainger, R., Harland, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+H+%22Early+development+of.Xenopus+laevis.%3A+A+laboratory+manual%22">Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).</li>
<li>Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activation+during+early+stages+of+lens+induction+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus.</a> Development. 125, 3509-3519 (1998).</li>
<li>Medina-Martinez, O., Jamrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxe+view+of+lens+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxe view of lens development and disease.</a> Development. 134, 1455-1463 (2007).</li>
<li>Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+in+the+tetraploid+Xenopus.laevis.+enables+genome-wide+insight+in+a+classic+developmental+biology+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism.</a> Methods. 66, 398-409 (2014).</li>
<li>Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+large+set+of+full-length+clones+from+a+Xenopus+tropicalis+EST+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project.</a> Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).</li>
<li>Karpinka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus.+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signaling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PLoS ONE. , e79469(2013).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

유능한 외배엽에서 반응을 유도 할 수있는 유전자의 기능적 클로닝 여기 기재된 방법은 유전자 산물의 넓은 범위를 식별하기 위해 사용될 수있다. 이 방법은 표현의 복제 기술과 조직 유도 분석을 결합하여 과거의 일에 확장합니다. 우리는 RNA 주입 다음, 직접 또는 간접적으로 유도 인자의 생성 소스로서 제노 푸스 난 모세포의 대사 경로를 이용한다. 이것은, 관심 cDNA 라이브러리 또는 클론의 다른 컬렉션으로부터 발생 전 사체의 발현을 사용하여 6,7의 유전자를 클로닝하기위한 확립 된 방법의 사용과 조합하여 배아 관련된 새로운 관심의 유전자를 동정하고자하는 사람들에게 유용한 방법을 제공한다 유도. 새로운 유전자의 기능 식별이 방법의 광범위한 적용은 흥미로운 새로운 역 유전 적 접근 방법에 대한 유용한 보완하고, 또한 높은 THR 사용하여 확인 시험 성적 증명서를 기능적하는 데 사용할 수 있습니다oughput (예 : RNA-서열 등)의 방법 (21). <p class="...

기능 또는 기능 상실을 통해 관심 유전자를 식별하는 순방향 유전적 접근방식 1,2은 발달 과정에서 복잡한 패터닝 이벤트를 이해하는 데 필수적인 부분입니다. 3-5 점점 더 확장되는 시스템 및 연구자들이 이용할 수 있는 강력한 역유전 기술과 함께, 이제 경로에서 핵심적인 기능적 역할을 하는 유전자를 식별한 다음 세포 수준에서 그리고 다른 유전자 산물과의 상호 작용에서 해당 기능을 규명할 수 있습니다. 과거에 많은 중요한 발견을 산출한 관심 유전자를 기능적으로 식별하는 한 가지 방법은 발현 클로닝입니다6,7.
우리의 최근 목표8은 척추동물의 수정체 유도 과정의 초기 단계가 가스트룰라 단계부터 일어난다는 것이 입증되었기 때문에 초기 렌즈 유도 요인을 식별하는 것이었습니다. 이를 위해 우리는 유도를 위한 반응 조직으로 Xenopus 배아의 일시적인 렌즈 기능을 가진9 동물 모자 외배엽(11-11.510기)을 사용하고, 유도 인자를 위한 생산 원으로 VI기 Xenopus 난모세포를 사용했습니다.
다음 프로토콜은 Smith 및 Harland6,7의 표현식 복제 및 sib 선택 프로토콜을 기반으로 하며, 다른11-13에서도 성공적으로 사용되었습니다. 당사의 난모세포 발현 시스템(Lustig 및 Kirschner14에 의해 유도 인자 생산에 처음 사용됨)에서 동물 뚜껑 외배엽에서 렌즈 유도 반응을 유도하는 인자를 직간접적으로 유발할 수 있는 주입된 전사체 풀을 선택하고 식별합니다. 이 시스템은 분비 유도 분자를 직접 발현하는 데 유용하기 때문에(난모세포 주입 INHBB mRNA는 중배엽 수용 동물 캡 외배엽8에서 중배엽 유도를 유발함) 원래 스크리닝 절차가 주로 부분비 인자를 식별하는 데 유용할 것으로 예상했습니다. 그러나 스크리닝에서 핵 인자(ldb18)를 확인했기 때문에 이 시스템을 사용하여 전사 또는 번역 조절 인자, miRNA, 보조 인자 또는 병치형 인자와 같은 다양한 분자를 식별할 수 있음이 분명합니다.

<table><tbody><tr><td>12/101 항체</td><td>개발 연구 Hybridoma Bank</td><td>12/101</td><td>근육 조직 검출을 위한 단클론 항체</td></tr><tr><td>20x SSC 버퍼</td><td>ISH</td>아세트산 무수물용 <td>시그마</td><td>S6639</td></tr> ISH <tr><td>Anti-Dig-AP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>용</td><td>시그마</td><td>A6404</td></tr> ISH <tr><td>Aurum 플라스미드 미니 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6400</td>용 Roche 11093274910<td>플라스미드 DNA 정제</td></tr><tr><td>ISH BM 용</td> <td>차단 시약</td><td>Roche</td><td>11096176001</td></tr><tr><td>Purple</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td>ISH</td></tr><tr><td>Boekel 혼성화 오븐</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-245-121</td><td>ISH</td></tr> 용 <tr><td>Bouin의 솔루션</td><td>시그마</td><td>HT10132</td><td>ISH</td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A9647</td><td>OCM</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>시그마</td><td>C3023</td><td>ISH의 경우</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>난모세포의 Defolliculation</td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C121800</td><td>Dejelly 배아</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP5611</td><td>ISH</td></tr><tr><td>용 Dig-RNA 라벨링 믹스</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td>ISH 프로브 Dumont</td></tr><tr><td># 5 집게</td><td>Vitelline 봉투 용 World Precision Instruments</td><td>500233</td><td> 제거</td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이</td>트 <td>시그마</td><td>A5040</td><td>MS222 마취제</td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td> 주입 <td>매체용</td><td>시그마</td><td>F4375</td></tr> ISH <tr><td>겐타마이신 황산염</td><td>시그마</td><td>F9037</td><td>OCM</td>유리 모세혈관용 시그마 G1914</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td>3.5인치 길이, I,D, 0.530mm</td></tr><tr><td>유리 샘플 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-408B</td><td>ISH</td></tr><tr><td>헤어 루프</td><td></td><td></td><td>조직 조작을 위해 파스퇴르 피펫에 부착</td></tr><tr><td>된 헤파린 나트륨 염</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td>ISH</td></tr><tr><td>인젝터 용 Nanoliter 2010</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanoliter 2010</td><td>Microprocessor 제어 microinjector</td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>캐롤라이나</td><td>972433</td><td>수족관 소금 개구리 회복</td></tr><tr><td>IRBG XGC Xenopus 검증된 전체 길이 캠 cDNA</td><td>출처 Bioscience</td><td>989_IRBG</td><td>cDNA 라이브러리&nbsp;</td></tr><tr><td>100 &micro를 가진 LB 한천 판; g/ml Ampicillin</td><td>Teknova</td><td>L5004</td><td>150mm 사전 주입 LB-Amp 플레이트 sib 선택을 위한</td></tr><tr><td>LB Luria Broth</td><td>Teknova</td><td>L8650</td><td>LB 플레이트에서 sib 선택 및 배양 희석을 위한</td></tr><tr><td>자성 mRNA 분리 키트</td><td>New England BioLabs</td><td>S1550S</td><td>폴리(A) 농축 RNA Maleic</td></tr><tr><td>Acid</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td>분리용 ISH</td></tr><tr><td>수동 Microfil Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3310R</td><td>수동 micromanipulator</td></tr><tr><td>너트 믹서</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-152</td><td>ISH 용 로커</td></tr><tr><td>Permoplast</td><td>Nasco</td><td>SB33495M</td><td>주입 및 해부 접시</td></tr> 용 <tr><td>점토 인산염 완충 식염</td>수 <td>시그마</td><td>P5368</td><td>ISH</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>시그마</td><td>G4877</td><td>난모세포 발달을 자극하기 위해</td></tr>ISH 프로그래밍 가능한 풀러<tr><td>용</td> <td>폴리비닐피롤리돈</td><td>시그마</td><td>PVP40</td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>PUL-1000</td><td>마이크로피펫 니들 풀러</td></tr> ISH pTnT<tr><td>용</td><td>단백질 분해 효소 K</td><td>시그마</td><td>P6556</td></tr><tr><td>Vector</td><td>Promega</td><td>L5610</td><td>cDNA 라이브러리 구성</td></tr><tr><td>Riboprobe Combination System</td><td>Promega</td><td>P1450</td><td>in vitro 전사</td></tr><tr><td>위 첨자 전체 길이 cDNA 라이브러리 구성 키트</td><td>Life Technologies</td><td>18248013</td><td>키트 cDNA 라이브러리 구축</td></tr><tr><td>봉합사, 3-0 실크</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td>난모 세포 제거 후 봉합</td></tr>사 <tr><td>Torula RNA</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td>ISH</td></tr><tr><td>용</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>트리에탄올 아민 시그마 T1502Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>for ISH</td></tr><tr><td>Universal RiboClone cDNA Synthesis System</td><td>Promega</td><td>C4360</td><td>alternative kit for cDNA library construction</td></tr><tr><td>Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration</td><td>Source Bioscience</td><td>5055_XenORFeome</td><td>ORFeome Clones</td></tr><tr><td>XL2-Blue Ultracompetent Cells</td><td>Agilent Technologies</td><td>200150</td><td>cDNA 형질전환용 세포 도서관</td></tr></tbody></table>

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

배아 유도를 담당하는 유전자의 확인은 여러 가지 도전을 제기합니다. 몇 가지 예를 들자면, 분비된 관심 분자는 풍부하지 않을 수 있고, 분비되지 않고 신호 세포에 묶여 있을 수 있으며, 결합 파트너 또는 상위 조절 분자의 존재를 필요로 할 수 있습니다. 따라서 유능한 외배엽에서 초기 수정체 유도 반응을 유도할 수 있는 유전자 산물을 찾기 위해 부분비 또는 병치환 인자뿐만 아니라 전사 또는 기타 조절 단백질을 식별할 수 있는 발현 클로닝 시스템을 활용했습니다. mRNA 풀을 Xenopus 난모세포에 주입하고 반응 조직을 난모세포에 직접 배치하고 공동 배양했습니다. 렌즈가 장착된 동물 캡 외배엽에서 초기 수정체 플라코드 마커 foxe3의 발현을 유도하는 능력에 기초하여 신경판 단계 cDNA 라이브러리에서 ldb1을 기능적으로 복제한 후, mRNA 발현 패턴을 특성화하고 ldb1의 과발현 또는 녹다운에 따른 발달 진행을 분석했습니다. 이 시스템은 유능한 조직에서 기능적 반응을 사용하여 유도 물질 또는 그 업스트림 조절 분자를 식별하고자 하는 매우 다양한 상황에 적합합니다.

동물 캡 조직 응답, 난자에 주입의 mRNA의 발현에 대응하여 현장 하이브리드 (그림 2, 표 1)에 의해의 Otx2의 발현을 측정 하였다;의 Otx2이 렌즈 placode를 통해 신경관 폐쇄에서 추정 렌즈 외배엽 (PLE)로 표현된다 농축 (19). 도의 Otx2 PLE 외부 전방 신경 외배엽뿐만 아니라 비 - 신경 외배엽 헤드 표현이기 때문에,이를 신경과 placodal 반응 모두와 연관된다. foxe3 신경 판으로부터 PLE 표현되므로 foxe3의 사용은 발현 클로닝의 목적에 더 구체적인 접근을 허용 가능한 렌즈 유능한 동물 캡 외배엽의 렌즈의 유도 반응을 생성 할 수있는 유전자 산물의 라이브러리를 선별 할 인접 placodal 지역에 존재하지만 neuroectoder 결석 단계와 렌즈 소포 형성 <su...

우리는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자의 발현을 위한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 설명하고 이러한 유전자의 후속 분석을 위한 기술에 대해 논의합니다. 이 시스템은 광범위한 유전자 산물의 기능적 식별에 유용합니다.

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 유능 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자 산물을 식별하는 데 적합한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 시연하는 것입니다. 이 방법은 유도 반응을 이끌어내는 데 어떤 유전자가 필요한가와 같은 발생생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Xenopus 난모세포를 발현 시스템으로 사용하여 표적 조직에 작용하는 유도 물질이나, 심지어 유도 물질의 상위에서 작용하는 유전자를 생성하고 식별할 수 있다는 점입니다.해부 및 재조합 단계는 단계별 의존성이 매우 높고 정교한 기술이 필요하므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 유용합니다. 마취된 암컷 개구리로부터 난소 조직을 수집한 후, 조직을 각각 약 10~20개의 난모세포가 포함된 작은 조각으로 찢습니다. 이 조각들을 먼저 신선한 OR2-solution으로 옮긴 다음, 2.0 mg/mL collagenase A가 포함된 OR2-solution으로 옮깁니다. 이어서 조직이 포함된 혼합물을 쉐이커에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.그 후 조각들을 새로운 콜라게나제 솔루션으로 옮기고 1시간 동안 추가로 교반합니다. 이 처리가 끝날 때쯤이면 응집이 해제된 난모세포가 관찰될 것입니다. 난모세포를 완전한 OR2로 10회 세척한 다음, OCM으로 약칭되는 난모세포 배양 배지에서 2회 세척하십시오.그 후, 난자를 신선한 OCM에 넣고 해부 현미경으로 육안 검사를 수행합니다. 크기가 더 작고 미성숙한 난자들을 제거하여 6단계의 난자들만 분리합니다. 다음으로, OCM이 담긴 아가로스 코팅 페트리 접시에 난자를 옮기고, 주입 전까지 18 to 20 °C에서 유지합니다.미세주입을 준비하려면, 유리 모세관 튜브를 니들 풀러(needle puller)에 넣고 당긴 다음, 유리의 끝부분을 부러뜨려 직경이 약 20 micrometers인 니들을 제작합니다. 복합 현미경에서 보정된 접안 마이크로미터를 사용하여 니들 팁의 크기를 측정합니다. 그다음, 35 by 10 millimeter 페트리 접시 바닥에 클레이를 밀어 넣어 균일한 층으로 만듭니다.그 다음, 작은 프로브 형태의 도구를 사용하여 이 층에 평행한 홈을 만듭니다. 점토를 입힌 접시에 1x modified Barth's saline(MBS)에 희석한 3% Ficoll 약 2 milliliters를 채웁니다. 그리고 광구 파이펫을 사용하여 난모세포를 그곳으로 옮깁니다.후속 미세주입 과정 동안 난자가 고정될 수 있도록 홈에 배치합니다. 미세주입기를 사용하여 이전에 준비한 mRNA 풀을 약 2 µL 정도 바늘에 채우고, 주입 시 난자의 세포질이 바늘 안으로 빨려 들어가는 것을 방지하기 위해 약간의 양압이 형성되도록 균형을 조정합니다. 그런 다음, 각 난자의 적도 부위에 20 nL의 RNA를 주입합니다.그 후, 난자를 Ficoll MBS에 1시간 동안 둔 다음, 조심스럽게 1x MBS로 옮깁니다. 난자를 20°C에서 8~24시간 동안 배양합니다. 동물 캡 분석(animal cap assay)을 시작하려면, NAM 용액으로 약칭하는 3/4x 일반 양서류 배지(normal amphibian medium), 미세 핀셋, 헤어루프(hairloop), 이전에 주입된 난자, 그리고 stage 11~11.5의 제노푸스(xenopus) 배아를 준비합니다.그 다음, 유리 커버 슬립을 약 1mm × 2mm 크기의 조각으로 부수고, 조각들의 가장자리가 매끄럽고 둥글게 될 때까지 불꽃에 통과시킵니다. 이어서, 앞서 설명한 대로 접시에 점토를 단일 층으로 눌러 폅니다. 그리고 작은 프로브를 사용하여 이 코팅 위에 개별적인 컵 모양의 홈을 만듭니다.디쉬에 약 2 mL의 3/4x NAM을 채웁니다. 여기에 주입된 난자를 옮겨, 각 난자가 하나의 홈에 고정되도록 여러 개를 배치합니다. 배아를 준비하려면 3/4x NAM 용액이 들어 있는 디쉬로 배아를 옮깁니다.외배엽의 연령에 따른 단계별 대조군으로 사용할 가스트룰라 일부를 선택하여 동일한 용액이 담긴 다른 배양 접시로 옮깁니다. 그리고 이 플레이트를 따로 둡니다. 동물 캡 분석(animal cap assay)에 사용할 배아의 경우, 두 쌍의 미세 핀셋을 사용하여 난황막을 제거합니다.그 후, 가스트룰라를 난모세포가 들어 있는 점토 라이닝 접시로 옮깁니다. 먼저, 두 쌍의 미세 핀셋을 사용하여 배아에서 동물극 캡을 절제하며, 이때 적도 부위 조직이 포함되지 않도록 주의하십시오. 첫 번째 방법으로 재조합체를 생성하려면, 오목한 홈에 이미 배치된 난모세포의 동물극 반구에 동물극 캡의 내면이 접촉하도록 위치시킵니다.이 과정을 주입된 여러 개의 난자에 대해 반복합니다. 이 재조합체들이 서로 고정되도록, 각각의 상단에 곡선형 유리 커버슬립 파편을 놓고, 배아가 납작해져 커버슬립이 점토에 닿을 때까지 아래로 압력을 가합니다. 두 번째 방법을 사용하여 재조합체를 생성하려면, 점토의 빈 개별 홈에 동물 캡과 난자를 함께 배치합니다.동물극 캡의 내측 표면이 난자를 향하도록 확인하십시오. 그런 다음, 소량의 점토를 사용하여 두 조직을 함께 고정합니다. 두 방법 중 하나를 사용하여 여러 개의 재조합체가 생성되면, 이를 따로 떼어 놓은 대조군 배아와 함께 20 °C에서 배양하십시오.대조군 배아가 원하는 단계에 도달하면, 재조합 배아에서 커버슬립을 제거하고 핀셋과 헤어 루프를 사용하여 동물극 캡 외배엽을 분리합니다. 분리한 외배엽 조각과 대조군 배아 모두를 MEMFA로 1시간 동안 고정합니다. 그 후 에탄올로 옮겨 이 조직을 -20°C에서 보관합니다.본 실험에서는 점차적으로 적은 수의 클론 또는 콜로니에 해당하는 mRNA 풀을 난자 세트에 주입한 후, 동물극 캡(animal caps)과 함께 배양하였습니다. 이후, 초기 신경판 단계부터 소포 형성 단계까지 추정 렌즈 외배엽에서 통상적으로 관찰되며 본 실험에서 렌즈 유도 능력을 평가하는 마커로 사용된 foxe3를 발현하는 각 세트의 동물극 캡 수를 측정하였습니다. 이 방법을 통해 평가된 동물극 캡의 179개 중 50개(28%)에서 렌즈 유도 반응을 일으킬 수 있는 핵 인자 인코딩 유전자인 ldb1을 확인하였습니다.여기 제시된 in situ hybridization 이미지는 약 stage 11에서 stage 23까지 ldb1이 주입된 난자와 함께 배양된 동물극 캡(animal caps)에서 화살표 머리로 표시된 foxe3 신호를 보여줍니다. 주입되지 않은 난자와 함께 배치된 해당 대조군 동물극 캡에서는 foxe3 발현이 관찰되지 않습니다. 이 동물극 캡으로 절편을 제작했을 때, 내측 및 외측 외배엽 층 모두에서 foxe3 발현이 관찰되었습니다.내층에서의 발현은 수정체 반응의 특징입니다. 또는, 두 층 모두에서 신호가 나타나는 것은 후각판과 같은 다른 구조를 나타냅니다. 이 절차 이후에, 동물극 외배엽의 유도 반응을 평가하기 위해 면역조직화학, in situ hybridization 또는 형광 리포터 유전자의 직접 검출과 같은 방법을 수행할 수 있습니다.

functional-cloning-using-a-xenopus-oocyte-expression-system

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

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