를 사용하여 기능성 복제 Xenopus의 난자 발현 시스템

우리는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자의 발현을 위한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 설명하고 이러한 유전자의 후속 분석을 위한 기술에 대해 논의합니다. 이 시스템은 광범위한 유전자 산물의 기능적 식별에 유용합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자 산물을 식별하는 데 적합한 동물 캡 시스템인 Xenopus 난모세포를 입증하는 것입니다. 이 방법은 귀납적 반응을 불법화하는 데 어떤 유전자가 필요한지와 같은 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Xenopus 난모세포를 발현 시스템으로 사용하여 표적 조직에 작용하는 유도체 또는 유도 물질의 상류에 작용하는 유전자를 생성하고 식별한다는 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 해부 및 재조합 단계가 단계에 따라 크게 달라지고 정교한 기술이 필요하기 때문에 매우 유용합니다. 마취된 암컷 개구리에서 난소 조직을 채취한 후 조직을 각각 약 10-20개의 난모세포가 포함된 작은 조각으로 찢습니다. 그리고 이 파편을, 첫째로 신선한 OR2 해결책에, 그 후에 OR2 포함 밀리리터 콜라겐 분해 효소 당 2.0 밀리그램 옮기십시오 A.1 시간 동안 셰이커에 조직 함유 혼합물을 온화하게 교반해서 계속하십시오.

그런 다음 단편을 새로운 콜라겐 분해 효소 용액으로 옮기고 추가로 한 시간 동안 교반합니다. 이 치료가 끝날 때 탈응집된 난모세포를 관찰할 수 있습니다. 완전한 OR2에서 난모세포를 10회 세척한 다음 OCM으로 약칭되는 난모세포 배양 배지에서 2회 세척합니다.

그 후, 난모세포를 새로운 OCM에 넣고 해부 현미경으로 육안으로 검사합니다. 6단계에 있는 난모세포는 더 작고 미성숙한 난모세포를 제거하여 분리합니다. 다음으로, OCM이 함유된 아가로스로 코팅된 페트리 접시에 난모세포를 넣고 주입할 때까지 섭씨 18-20도를 유지합니다.

미세 주입을 준비하려면 유리 모세관 튜브를 바늘 풀러에 넣고 당긴 다음 유리에서 팁을 떼어내어 직경 약 20마이크로미터의 바늘을 생성합니다. 복합 현미경에서 보정된 안구 마이크로미터로 바늘 끝을 측정합니다. 다음으로, 35 x 10mm 페트리 접시 바닥의 균일한 층에 점토를 밀어 넣습니다.

그런 다음 쇼핑몰 프로브와 같은 도구를 사용하여 이 레이어에 평행한 홈을 만듭니다. 점토를 깐 접시에 1x 변형 바르트 식염수 또는 MBS에 3%Ficoll 약 2ml를 채웁니다. 그런 다음 넓은 구멍의 피펫을 사용하여 난모세포를 옮깁니다.

난모세포를 숲에 배치하여 후속 미세주입 동안 제자리에 고정되도록 합니다. 마이크로인젝터를 사용하여 이전에 생성된 mRNA 풀의 약 2마이크로리터를 바늘에 채우고 균형을 조정하여 약간의 양압을 생성하면 주입 중에 난모세포 세포질이 바늘로 빨려 들어가는 것을 방지할 수 있습니다. 그런 다음 적도 지역에서 각 난모세포에 20나노리터의 RNA를 주입합니다.

그 후, 난모세포를 Ficoll MBS에 1시간 동안 그대로 두었다가 1x MBS로 부드럽게 옮깁니다. 섭씨 20도에서 8-24시간 동안 난모세포를 배양합니다. 동물 뚜껑 분석을 시작하려면 11기에서 11.5단계에서 NAM 용액, 미세 집게, 헤어루프, 이전에 주입된 난모세포 및 이종 배아로 약칭되는 3/4x 일반 양서류 배지를 수집합니다.

그런 다음 유리 덮개를 약 1mm x 2mm 크기의 파편으로 분해하고 가장자리가 연마되고 그려질 때까지 이 조각을 화염에 통과시킵니다. 다음으로, 앞에서 설명한 대로 점토를 접시의 단일 층으로 누릅니다. 그리고 몰 프로브를 사용하여 이 코팅에 개별 컵 모양의 인상을 만듭니다.

접시에 약 2밀리리터의 3/4x NAM을 채웁니다. 그리고 주입된 난모세포를 옮기고, 각각이 단일 움푹 들어간 곳에서 고정되도록 여러 개를 배치합니다. 배아를 준비하려면 3/4x NAM 용액이 들어있는 접시에 옮겨 넣습니다.

외배엽의 나이에 대한 병기 조절제로 사용할 gastrula의 하위 집합을 선택하고 동일한 용액을 포함하는 다른 접시로 옮깁니다. 그리고 이 접시를 따로 보관하십시오. 동물 뚜껑 아세트에 사용될 배아의 경우, 두 쌍의 미세한 집게로 유리막을 제거합니다.

그런 다음 gastrula를 난모세포와 함께 점토를 깐 접시에 옮깁니다. 먼저 두 쌍의 미세한 앞두를 사용하여 배아에서 동물 뚜껑을 자르고 적도 조직을 피하도록 주의하십시오. 첫 번째 방법을 사용하여 재조합체를 생성하려면, 내부 표면이 이미 움푹 들어간 곳에 위치한 난모세포의 동물 반구와 접촉하도록 동물 캡을 배치합니다.

그리고 주입된 여러 난모세포에 대해 이 과정을 반복합니다. 이러한 재조합체가 함께 고정되도록 하려면 각 재조합 물질 위에 구부러진 유리 커버슬립 조각을 놓고 동물이 평평해지고 커버슬립이 점토에 닿을 때까지 아래쪽 압력을 가합니다. 두 번째 방법을 사용하여 재조합 물질을 생성하려면 동물 뚜껑과 난모세포를 점토의 빈 개별 움푹 들어간 곳에 함께 배치합니다.

그리고 동물 뚜껑 내부 표면이 난모세포를 향하고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 점토를 약간 확장하여 두 조직을 함께 고정합니다. 두 방법 중 하나를 사용하여 여러 개의 재조합 물질이 생성되면 섭씨 20도에서 배양하고 따로 놓은 대조 배아를 배양합니다.

대조 배아가 원하는 단계에 도달하면, 재조합 배아에서 커버슬립을 제거하고 겸자와 털 고리를 사용하여 동물 뚜껑 외배엽을 분리합니다. 1시간 동안 MEMFA에서 두 외배엽 단편을 모두 고정하고 배아를 제어합니다. 그리고 그것들을 에탄올로 옮기고 이 조직을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

여기서, 난모세포 세트에 점진적으로 더 적은 수의 클론 또는 콜로니에 해당하는 mRNA 풀을 주입한 다음, 동물 뚜껑으로 배양했습니다. 그 후, 초기 신경판 단계에서 소포 형성에 이르기까지 추정 수정체 외배엽에서 일반적으로 관찰되는 마커인 foxe3를 발현하는 각 세트에서 수정체 유도 능력을 평가하기 위해 여기에서 사용하는 동물 뚜껑의 수를 측정했습니다. 이 방법은 핵 인자 인코딩 유전자 ldb1에서 확인되었으며, 이는 179개 중 50개 또는 평가된 동물 뚜껑의 28%에서 렌즈 유도 반응을 생성할 수 있습니다.

여기에 표시된 것은 대략 11기에서 23기까지 ldb1 주입 난모세포로 배양된 동물 뚜껑에서 화살촉으로 표시되는 foxe3 신호를 묘사하는 현장 혼성화 이미지입니다. 주입되지 않은 난모세포에 배치된 해당 대조군 동물 캡에서는 foxe3 발현이 관찰되지 않습니다. 이 동물 모자에서 절편이 생성되었을 때, 내부 및 외부 외배엽 층 모두에서 foxe3 발현이 관찰되었습니다.

내층의 발현은 렌즈 반응의 특징입니다. 또는 두 층에서 신호된 바와 같이 후각 플라코드(olfactory placode)와 같은 다른 구조를 나타냅니다. 이 절차에 따라 면역조직화학, 현장 혼성화 또는 형광 리포터 유전자의 직접 검출과 같은 방법을 수행하여 동물 캡 외배엽의 유도 반응을 평가할 수 있습니다.