를 사용하여 기능성 복제

본 실험 절차의 전반적인 목표는 유능 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자 산물을 식별하는 데 적합한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 시연하는 것입니다. 이 방법은 유도 반응을 이끌어내는 데 어떤 유전자가 필요한가와 같은 발생생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Xenopus 난모세포를 발현 시스템으로 사용하여 표적 조직에 작용하는 유도 물질이나, 심지어 유도 물질의 상위에서 작용하는 유전자를 생성하고 식별할 수 있다는 점입니다.

해부 및 재조합 단계는 단계별 의존성이 매우 높고 정교한 기술이 필요하므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 유용합니다. 마취된 암컷 개구리로부터 난소 조직을 수집한 후, 조직을 각각 약 10~20개의 난모세포가 포함된 작은 조각으로 찢습니다. 이 조각들을 먼저 신선한 OR2-solution으로 옮긴 다음, 2.0 mg/mL collagenase A가 포함된 OR2-solution으로 옮깁니다. 이어서 조직이 포함된 혼합물을 쉐이커에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.

그 후 조각들을 새로운 콜라게나제 솔루션으로 옮기고 1시간 동안 추가로 교반합니다. 이 처리가 끝날 때쯤이면 응집이 해제된 난모세포가 관찰될 것입니다. 난모세포를 완전한 OR2로 10회 세척한 다음, OCM으로 약칭되는 난모세포 배양 배지에서 2회 세척하십시오.

그 후, 난자를 신선한 OCM에 넣고 해부 현미경으로 육안 검사를 수행합니다. 크기가 더 작고 미성숙한 난자들을 제거하여 6단계의 난자들만 분리합니다. 다음으로, OCM이 담긴 아가로스 코팅 페트리 접시에 난자를 옮기고, 주입 전까지 18 to 20 °C에서 유지합니다.

미세주입을 준비하려면, 유리 모세관 튜브를 니들 풀러(needle puller)에 넣고 당긴 다음, 유리의 끝부분을 부러뜨려 직경이 약 20 micrometers인 니들을 제작합니다. 복합 현미경에서 보정된 접안 마이크로미터를 사용하여 니들 팁의 크기를 측정합니다. 그다음, 35 by 10 millimeter 페트리 접시 바닥에 클레이를 밀어 넣어 균일한 층으로 만듭니다.

그 다음, 작은 프로브 형태의 도구를 사용하여 이 층에 평행한 홈을 만듭니다. 점토를 입힌 접시에 1x modified Barth's saline(MBS)에 희석한 3% Ficoll 약 2 milliliters를 채웁니다. 그리고 광구 파이펫을 사용하여 난모세포를 그곳으로 옮깁니다.

후속 미세주입 과정 동안 난자가 고정될 수 있도록 홈에 배치합니다. 미세주입기를 사용하여 이전에 준비한 mRNA 풀을 약 2 µL 정도 바늘에 채우고, 주입 시 난자의 세포질이 바늘 안으로 빨려 들어가는 것을 방지하기 위해 약간의 양압이 형성되도록 균형을 조정합니다. 그런 다음, 각 난자의 적도 부위에 20 nL의 RNA를 주입합니다.

그 후, 난자를 Ficoll MBS에 1시간 동안 둔 다음, 조심스럽게 1x MBS로 옮깁니다. 난자를 20°C에서 8~24시간 동안 배양합니다. 동물 캡 분석(animal cap assay)을 시작하려면, NAM 용액으로 약칭하는 3/4x 일반 양서류 배지(normal amphibian medium), 미세 핀셋, 헤어루프(hairloop), 이전에 주입된 난자, 그리고 stage 11~11.5의 제노푸스(xenopus) 배아를 준비합니다.

그 다음, 유리 커버 슬립을 약 1mm × 2mm 크기의 조각으로 부수고, 조각들의 가장자리가 매끄럽고 둥글게 될 때까지 불꽃에 통과시킵니다. 이어서, 앞서 설명한 대로 접시에 점토를 단일 층으로 눌러 폅니다. 그리고 작은 프로브를 사용하여 이 코팅 위에 개별적인 컵 모양의 홈을 만듭니다.

디쉬에 약 2 mL의 3/4x NAM을 채웁니다. 여기에 주입된 난자를 옮겨, 각 난자가 하나의 홈에 고정되도록 여러 개를 배치합니다. 배아를 준비하려면 3/4x NAM 용액이 들어 있는 디쉬로 배아를 옮깁니다.

외배엽의 연령에 따른 단계별 대조군으로 사용할 가스트룰라 일부를 선택하여 동일한 용액이 담긴 다른 배양 접시로 옮깁니다. 그리고 이 플레이트를 따로 둡니다. 동물 캡 분석(animal cap assay)에 사용할 배아의 경우, 두 쌍의 미세 핀셋을 사용하여 난황막을 제거합니다.

그 후, 가스트룰라를 난모세포가 들어 있는 점토 라이닝 접시로 옮깁니다. 먼저, 두 쌍의 미세 핀셋을 사용하여 배아에서 동물극 캡을 절제하며, 이때 적도 부위 조직이 포함되지 않도록 주의하십시오. 첫 번째 방법으로 재조합체를 생성하려면, 오목한 홈에 이미 배치된 난모세포의 동물극 반구에 동물극 캡의 내면이 접촉하도록 위치시킵니다.

이 과정을 주입된 여러 개의 난자에 대해 반복합니다. 이 재조합체들이 서로 고정되도록, 각각의 상단에 곡선형 유리 커버슬립 파편을 놓고, 배아가 납작해져 커버슬립이 점토에 닿을 때까지 아래로 압력을 가합니다. 두 번째 방법을 사용하여 재조합체를 생성하려면, 점토의 빈 개별 홈에 동물 캡과 난자를 함께 배치합니다.

동물극 캡의 내측 표면이 난자를 향하도록 확인하십시오. 그런 다음, 소량의 점토를 사용하여 두 조직을 함께 고정합니다. 두 방법 중 하나를 사용하여 여러 개의 재조합체가 생성되면, 이를 따로 떼어 놓은 대조군 배아와 함께 20 °C에서 배양하십시오.

대조군 배아가 원하는 단계에 도달하면, 재조합 배아에서 커버슬립을 제거하고 핀셋과 헤어 루프를 사용하여 동물극 캡 외배엽을 분리합니다. 분리한 외배엽 조각과 대조군 배아 모두를 MEMFA로 1시간 동안 고정합니다. 그 후 에탄올로 옮겨 이 조직을 -20°C에서 보관합니다.

본 실험에서는 점차적으로 적은 수의 클론 또는 콜로니에 해당하는 mRNA 풀을 난자 세트에 주입한 후, 동물극 캡(animal caps)과 함께 배양하였습니다. 이후, 초기 신경판 단계부터 소포 형성 단계까지 추정 렌즈 외배엽에서 통상적으로 관찰되며 본 실험에서 렌즈 유도 능력을 평가하는 마커로 사용된 foxe3를 발현하는 각 세트의 동물극 캡 수를 측정하였습니다. 이 방법을 통해 평가된 동물극 캡의 179개 중 50개(28%)에서 렌즈 유도 반응을 일으킬 수 있는 핵 인자 인코딩 유전자인 ldb1을 확인하였습니다.

여기 제시된 in situ hybridization 이미지는 약 stage 11에서 stage 23까지 ldb1이 주입된 난자와 함께 배양된 동물극 캡(animal caps)에서 화살표 머리로 표시된 foxe3 신호를 보여줍니다. 주입되지 않은 난자와 함께 배치된 해당 대조군 동물극 캡에서는 foxe3 발현이 관찰되지 않습니다. 이 동물극 캡으로 절편을 제작했을 때, 내측 및 외측 외배엽 층 모두에서 foxe3 발현이 관찰되었습니다.

내층에서의 발현은 수정체 반응의 특징입니다. 또는, 두 층 모두에서 신호가 나타나는 것은 후각판과 같은 다른 구조를 나타냅니다. 이 절차 이후에, 동물극 외배엽의 유도 반응을 평가하기 위해 면역조직화학, in situ hybridization 또는 형광 리포터 유전자의 직접 검출과 같은 방법을 수행할 수 있습니다.