1차 유방구의 생성: 세포 효능을 결정하는 기술

유방암의 줄기세포 하나가 원발성 유방구(primary mammosphere)라고 하는 세포 군집을 형성합니다. 이를 얻으려면 먼저 유방암 세포주를 70%에서 80% 농도가 될 때까지 배양하여 세포가 성장 단계에 있는지 확인합니다. Tripsin-EDTA를 첨가하여 플라스크에서 세포를 분리하고 혈청이 있는 배지를 추가하여 Tripsin의 작용을 중지합니다.

이제 튜브와 원심 분리기에 세포를 넣어 세포 펠릿을 얻습니다. 혈청이 없는 유방구 배지에 펠릿을 재현탁시키고 세포 스트레이너 캡 필터를 통해 현탁액을 통과시켜 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 이 현탁액은 줄기세포, 전구세포, 그리고 서로 다른 단백질 발현을 보이는 분화된 세포로 구성됩니다.

CD44와 CD24는 유방암 줄기세포의 특징인 세포 표면 단백질입니다. CD44 발현은 양성이고 CD24는 음성입니다. 형광 또는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 세포 현탁액에서 세포를 분리합니다. 다음으로, 분취량과 애드 트리판 블루 염색을 세포에 적용하고 혈구계 슬라이드를 사용하여 밀리리터당 생존 가능한 세포 수를 계산하여 파종 밀도를 찾습니다.

마지막으로, 세포가 부유 상태로 유지되도록 6개의 웰 초저 접착 플레이트에 세포를 파종합니다. 구체의 직경이 5미크론이 될 때까지 플레이트를 방해하지 않고 10-40일 동안 플레이트를 배양합니다. 다음 프로토콜에서는 유방암 세포주에서 1차 유방구를 생성합니다.

- 멸균 배양 후드 아래에서 작업하면서 70%에서 80% 농도인 MCF7 또는 MDA-MB-231 세포로 이 절차를 시작합니다. 플라스크에서 배지를 흡입합니다. PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 Tripsin-EDTA를 추가하고 2-6분 동안 배양합니다. 분리 후 10% FBS를 함유한 유방권 배지를 첨가하여 담금질합니다.

세포가 분리되면 15ml 원뿔형 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 200g 회전시킵니다. 이 원심 분리 후 상층액을 기울인 다음 1-5 밀리리터의 유방권 배지에 세포를 재현탁시킵니다. 세포 펠릿을 분해하기 위해 위아래로 10회 피펫팅합니다.

다음으로, 세포 현탁액을 40미크론 세포 변형 캡 필터로 옮기고 부착된 튜브를 통해 흐름을 수집하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 재현탁된 세포의 20마이크로리터 분취액을 혈구계에 피펫팅하고 현미경을 사용하여 검사합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 세포 클러스터가 관찰되면 주사기를 사용하여 25 게이지 바늘 안팎으로 현탁액을 한두 번

세포가 여기에 표시된 대로 단일 세포 현탁액으로 분산되면 형광 활성화 세포 분류 또는 LS 컬럼을 사용한 자기 활성화 세포 분류를 통해 CD44 양성, CD24 음성 세포 subset을 분리하여 CD44 양성 세포를 양성으로 선택합니다. 원하는 세포가 LS 컬럼의 벽에 부착되기 때문에 플로우스루를 버리고 컬럼에서 세포를 제거하고 5ml의 버퍼를 적용한 다음 컬럼과 함께 제공된 플런저를 적용하고 눌러 원하는 세포를 플러시합니다.

다음으로, LD-column을 사용하여 negative selection에 의해 개체군을 더욱 정제합니다. 여기서 CD24 양성 세포는 LD 컬럼에 부착됩니다. CD24 음성 세포를 포함하는 플로우스루를 수집합니다. 다음으로, 유세포 분석을 사용하여 모든 분리된 세포의 표현형을 확인합니다. 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 생존 가능한 세포의 밀도를 계산합니다.

세포 현탁액을 적절하게 희석한 후, 2밀리리터의 완전한 유방권 배지에 제곱센티미터당 500-4,000개의 세포가 있는 6웰 초저 부착 플레이트의 각 웰을 파종합니다. 구체가 관찰될 때까지 5-10일 동안 접시를 방해하지 않도록 주의하면서 플레이트를 배양합니다. 구체의 직경이 최소 40미크론이 될 때까지 배양을 계속하지만 아직 세포사멸로 변하기 시작하지 않았습니다.

• Seeding Density - The number of cells initially placed in a culture dish.
• Trypan Blue Staining - Vital stain technique used to determine cell viability.
• Hemocytometer - A microscopic slide device for counting cells.
• Cell Potency - The differentiation potential of stem cells into other cell types.
• Mammosphere - A cluster of breast cancer stem cells derived in culture.

• Introduce Seeding Density - Optimal cell number for growth in culture (e.g., Seeding Density).
• Key Concepts - Cell viability assessed by Trypan Blue staining (e.g., Trypan Blue Staining).
• Underlying Mechanisms - Differentiation of stem cells into different lineages (e.g., Cell Potency).
• Connect to Experiment - Generation of mammospheres from breast cancer stem cells.

• What is Seeding Density and how does it impact cell culture growth?
• What is the role of Trypan Blue Staining in assessing cell viability?
• How does Cell Potency define the ability of stem cells to differentiate?

• Practical Applications - Optimized cell culture methods (e.g., Seeding Density).
• Industry Impact - Advances in cancer research (e.g., Mammosphere culture).
• Societal Importance - Improved therapies for breast cancer (e.g., Cell Potency).
• Link to Scientific Advancements - Development of new methodologies in stem cell research.