행잉 드롭 방법(Hanging Drop Method): 3D 흑색종 스페로이드를 생성하는 기술

- 스페로이드는 생체 내 종양 구조를 모방하고 종양 내 상호 작용을 연구하는 데 도움이 되는 3차원 체외 세포 배양 모델입니다. 배양을 설정하려면 먼저 적절한 배지에서 흑색종 세포의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 다음으로, 이 세포 현탁액을 멸균된 비접착성 배양 접시의 뚜껑 내부 표면에 충분히 떨어뜨려 소량 발견합니다. 뚜껑을 조심스럽게 뒤집어 PBS가 들어있는 배양 접시 바닥에 놓아 수화 챔버를 만듭니다. 적절한 조건에서 플레이트를 배양합니다.

PBS의 수분은 매달린 방울에서 매체가 증발하는 것을 방지합니다. 몇 마이크로리터의 미디어를 교체하여 방울을 새로 고칩니다. 표면 장력으로 인해 물방울은 구형을 유지하고 판의 내부 표면에 매달려 있습니다. 중력은 세포가 퍼지지 않고 현탁 상태를 유지하는 것을 용이하게 하지만 응집되어 액적 내에서 3차원 스페로이드를 형성합니다. 마지막으로 PBS로 방울을 헹구어 스페로이드를 수확합니다. 접착력이 없는 배양 접시에 모으십시오.

다음 프로토콜에서는 행잉 드롭 방법을 통해 451-LU 흑색종 세포의 3차원 스페로이드를 생성하는 것을 시연합니다.

- 먼저 일반 세포 배양 프로토콜에 따라 10% FCS를 함유한 RPMI 배지를 사용하여 흑색종 세포 451-LU를 배양합니다. 흑색종 스페로이드를 생성하려면 배양된 흑색종 세포를 PBS에서 세척합니다. 그런 다음 PBS에 5ml의 1x 트립신-EDTA를 추가합니다. 실온에서 3-5분 동안 배양합니다. 트립신을 중화하기 위해 10% FCS를 함유한 RPMI 5ml를 첨가합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 200 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하여 세포를 채취합니다. 10% FCS를 함유한 RPMI에 세포 펠릿을 재현탁합니다.

다음으로, 세포를 계수하고 세포 현탁액을 밀리리터당 10,000개의 최종 농도로 희석합니다. 전자 멀티 피펫을 사용하여 멸균된 비접착성 10cm 세포 배양 접시의 뚜껑 내부 표면에 40 x 25마이크로리터의 세포 현탁액 반점을 만듭니다.

그런 다음 빠르고 부드러운 움직임으로 뚜껑을 뒤집고 PBS 5ml가 들어 있는 세포 배양 접시에 놓습니다. 매달린 드롭 접시를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에 10-14일 동안 배양합니다.

최초 낙하 발견 후 5일 후, 전자 디스펜서를 사용하여 10% FCS가 함유된 RPMI 10마이크로리터를 각 방울에 첨가합니다. 10일에서 15일 후에 PBS로 뚜껑을 부드럽게 헹구어 스페로이드를 수확합니다. 접착력이 없는 신선한 세포 배양 접시에 스페로이드를 수집합니다.