CUBIC 기반 단백질 발현 시각화: 전체 두께 마우스 피부 생검에서 단백질 발현을 시각화하는 절차

- 피부는 여러 층으로 배열된 다양한 세포 집단으로 구성된 복잡한 기관입니다. 조직 투명화 기반 3차원 이미징 기술인 CUBIC은 전체 피부 생검을 사용하여 이러한 피부 세포 내부의 단백질 발현 패턴을 시각화하는 데 도움이 됩니다. 안락사된 쥐를 데려다가 등쪽 목 부위의 털을 제거하는 것으로 시작합니다. 피부 조각을 잘라 작은 조각으로 자릅니다.

조각을 CUBIC1 세척 용액에 담그고 배양합니다. 피부 세포는 광 산란을 일으키는 발색단과 지질의 존재로 인해 투명하지 않습니다. CUBIC 용액의 화학 물질은 이러한 분자를 제거하여 광 산란을 줄이고 조직을 투명하게 만듭니다.

다음으로, 피부 세포에서 발현되는 표적 세포 내 단백질에 특이적으로 결합하는 원하는 1차 항체로 조직을 처리합니다. 또한, 단백질-1차 항체 복합체에 결합하는 형광 표지된 2차 항체로 치료합니다. 핵을 염색하는 DNA 결합 염료로 조직을 counterstain합니다.

마지막으로 샘플을 CUBIC2 용액에 담급니다. 이 솔루션은 조직 내의 광 산란을 더욱 줄여 이미징을 위해 더 투명하게 만듭니다. 컨포칼 현미경으로 관찰하여 3차원 샘플에서 형광 표지된 관심 영역을 시각화합니다. 다음 프로토콜은 CUBIC 프로토콜을 사용하여 전체 마운트 피부 생검에서 각질 세포 증식 마커의 발현을 시각화할 수 있습니다.

- 트리머를 사용하여 안락사 된 마우스의 목에서 머리카락을 면도하고 피부에 상처가 나지 않도록주의하십시오. 그런 다음 PBS의 70% 에탄올로 피부의 오염을 제거합니다. 그런 다음 집게로 등쪽 목 피부를 들어 올리고 가위를 사용하여 약 1.5 x 4cm 크기의 등쪽 마우스 피부를 제거합니다. 그런 다음 여과지 한 장에 진피 쪽이 아래로 향하게 하여 피부를 평평하게 하고 샘플의 전후 방향을 기록하고 절개된 피부 주위의 종이를 다듬습니다.

- 최적의 이미징을 위해 피부 샘플은 일관된 모낭 방향으로 평평하게 유지되어야 합니다. 샘플을 적절한 전후 위치에 유지하기 위해 직사각형 생검에서 피부 조각을 여과지에 고정합니다.

- PBS에서 새로 준비된 4% PFA로 채워진 15ml 튜브에 샘플을 옮깁니다. 그런 다음 여과지에 단단히 고정되면 표본을 새 15리터 PBS 튜브로 옮겨 5분 동안 두 번 세척합니다.

두 번째 세척 후 피부 생검을 지우려면 날카로운 면도날을 사용하여 조직을 약 0.2 x 0.5cm 조각으로 자르고 샘플의 긴 면이 샘플의 전후 방향을 따라 절단되도록 주의하십시오.

- 모낭의 방향과 평행하게 생검의 긴 쪽을 자르는 것도 광범위한 모낭 손상을 방지하는 데 도움이 됩니다.

- 그런 다음 새로 준비된 CUBIC1 세정 용액 5ml에 생검을 새 15ml 튜브에 담그고 튜브를 섭씨 37도의 혼성화 오븐의 회전 플랫폼에 놓습니다. 조직 조각이 투명해지면 PBS 4ml로 생검을 세척하여 섭씨 37도에서 6시간 4회 세척한 다음 PBS의 자당 부피당 20% 중량으로 섭씨 37도에서 4시간 세척합니다.

배양이 끝나면 각 샘플을 개별 15ml 튜브의 최적 절단 온도 화합물로 섭씨 영하 80도에서 밤새 동결하여 항체 침투에 대한 조직의 투과성을 높입니다.

다음 날 아침, 적절한 항체와 관심 있는 필수 염료로 피부 샘플을 염색합니다. 그런 다음 갓 준비한 CUBIC2 세정 용액 1ml에 담긴 2ml 튜브에 담긴 시료를 셰이커의 2ml 튜브에 넣고 섭씨 37도 오븐에서 24시간 동안 조직의 굴절률이 균일해질 때까지 배양합니다.

조직이 투명해지면 모낭 성장 방향이 커버 슬립 표면과 평행이 되도록 개별 유리 커버 슬립의 긴 면을 따라 생검을 배치합니다. 조직 위에 CUBIC2 용액 한 방울을 떨어뜨립니다. 커버 슬립에 1mm x 2cm 크기의 파란색 압정 스트립 2개를 놓습니다. 그런 다음 두 번째 커버 슬립으로 생검을 덮습니다.

다음으로, 이미징 챔버를 컨포칼 현미경 스테이지에 놓고 조직을 광 경로로 이동합니다. 적절한 광원과 표준 epifluorescence 필터를 사용하여 샘플을 스캔하여 형광으로 염색된 관심 영역을 식별합니다. 그런 다음 관심 영역의 형광 컨포칼 이미지를 획득합니다.

• CUBIC - A tissue clearing and three-dimensional imaging technique for cell visualization.
• CUBIC2 - The solution used to further reduce light scattering, enhances tissue transparency.
• Protein Visualization - Process of marking proteins to visually track their expression levels.
• 3D Sample - Biological sample that can be analyzed in three dimensions.
• CUBIC cleared mouse - Mouse skin sample that's been made transparent by the CUBIC technique.

• Introduce CUBIC - Transparentizes tissue for 3D imaging of cellular proteins (e.g., cubic2).
• Key Concepts - Uses specific chemical solutions to remove light scattering molecules (e.g., theory).
• Underlying Mechanisms - Marker proteins and DNA-binding dyes are used for visualization.
• Connect to Experiment - Describes a step by step procedure of utilizing CUBIC method on mouse skin samples.

• What is the CUBIC and CUBIC2 method and how to make tissue transparent for imaging?
• What are the key concepts behind skin tissue clearing and protein visualization?
• How does the addition of marker proteins and DNA-binding dye aid in cellular visualization?

• Practical Applications - CUBIC method assists in studying skin cell's protein expression (e.g., protein visualization).
• Industry Impact - Biomedical industry benefitting from 3D imaging of cells (e.g., healthcare).
• Societal Importance - Enhanced understanding of cell structure and function (e.g., cubic_video).
• Link to Scientific Advancements - Advances in 3D imaging and pathology analysis.