CUBIC 기반 단백질 발현 시각화: 전체 두께 마우스 피부 생검에서 단백질 발현을 시각화하는 절차

- 피부는 여러 층으로 배열된 다양한 세포 집단으로 구성된 복잡한 기관입니다. 조직 투명화 기반 3차원 이미징 기술인 CUBIC은 전체 피부 생검을 사용하여 이러한 피부 세포 내부의 단백질 발현 패턴을 시각화하는 데 도움이 됩니다. 안락사된 쥐를 데려다가 등쪽 목 부위의 털을 제거하는 것으로 시작합니다. 피부 조각을 잘라 작은 조각으로 자릅니다.

조각을 CUBIC1 세척 용액에 담그고 배양합니다. 피부 세포는 광 산란을 일으키는 발색단과 지질의 존재로 인해 투명하지 않습니다. CUBIC 용액의 화학 물질은 이러한 분자를 제거하여 광 산란을 줄이고 조직을 투명하게 만듭니다.

다음으로, 피부 세포에서 발현되는 표적 세포 내 단백질에 특이적으로 결합하는 원하는 1차 항체로 조직을 처리합니다. 또한, 단백질-1차 항체 복합체에 결합하는 형광 표지된 2차 항체로 치료합니다. 핵을 염색하는 DNA 결합 염료로 조직을 counterstain합니다.

마지막으로 샘플을 CUBIC2 용액에 담급니다. 이 솔루션은 조직 내의 광 산란을 더욱 줄여 이미징을 위해 더 투명하게 만듭니다. 컨포칼 현미경으로 관찰하여 3차원 샘플에서 형광 표지된 관심 영역을 시각화합니다. 다음 프로토콜은 CUBIC 프로토콜을 사용하여 전체 마운트 피부 생검에서 각질 세포 증식 마커의 발현을 시각화할 수 있습니다.

- 트리머를 사용하여 안락사 된 마우스의 목에서 머리카락을 면도하고 피부에 상처가 나지 않도록주의하십시오. 그런 다음 PBS의 70% 에탄올로 피부의 오염을 제거합니다. 그런 다음 집게로 등쪽 목 피부를 들어 올리고 가위를 사용하여 약 1.5 x 4cm 크기의 등쪽 마우스 피부를 제거합니다. 그런 다음 여과지 한 장에 진피 쪽이 아래로 향하게 하여 피부를 평평하게 하고 샘플의 전후 방향을 기록하고 절개된 피부 주위의 종이를 다듬습니다.

- 최적의 이미징을 위해 피부 샘플은 일관된 모낭 방향으로 평평하게 유지되어야 합니다. 샘플을 적절한 전후 위치에 유지하기 위해 직사각형 생검에서 피부 조각을 여과지에 고정합니다.

- PBS에서 새로 준비된 4% PFA로 채워진 15ml 튜브에 샘플을 옮깁니다. 그런 다음 여과지에 단단히 고정되면 표본을 새 15리터 PBS 튜브로 옮겨 5분 동안 두 번 세척합니다.

두 번째 세척 후 피부 생검을 지우려면 날카로운 면도날을 사용하여 조직을 약 0.2 x 0.5cm 조각으로 자르고 샘플의 긴 면이 샘플의 전후 방향을