CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

이 절차의 전반적인 목표는 단일 세포 수준에서 세포 증식 및 단백질 발현 패턴을 3차원으로 시각화하고 피부의 해부학적 구조와 병리학을 정확하게 평가하는 것입니다. 이 방법은 세포 및 분자 메커니즘이 표피 발달 및 재생을 어떻게 제어하는지, 그리고 피부 질환 중에 이러한 메커니즘이 어떻게 교란되는지에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 전례 없는 정확도로 전체 두께의 피부 생검에서 개별 세포를 3차원으로 시각화하기 위한 기술적으로 간단한 프로토콜이라는 것입니다.

이 방법은 또한 전체 피부 샘플에서 표피와 진피 사이의 상호 작용에 대한 조사를 용이하게 합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 연구자들은 모낭을 손상시키지 않고 작고 편평한 피부 생검을 준비하는 데 약간의 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 UNSW Australia의 발달 및 재생 피부과 부서의 박사 과정 학생인 Betty Maclarios입니다.

트리머를 사용하여 안락사된 쥐의 목에서 털을 면도하고 피부에 상처가 나지 않도록 주의하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 70% 에탄올과 PBS로 피부의 오염을 제거합니다. 그런 다음 집게로 등쪽 목 피부를 들어 올리고 가위를 사용하여 약 1.5 x 4cm 범위의 등쪽 마우스 피부를 제거합니다.

그런 다음 샘플의 전방 후방 방향을 기록한 여과지 조각에 피부 진피 면을 아래로 향하게 하고 절개된 피부 주위의 종이를 다듬습니다. 최적의 이미징을 위해 피부 샘플은 일관된 모낭 방향으로 평평하게 유지되어야 합니다. 샘플을 적절한 전방 또는 후방 위치에 유지하기 위해 직사각형 생검에서 여과지에 피부 조각을 고정합니다.

새로 준비한 4% PFA 및 PBS로 채워진 15mL 튜브에 샘플을 옮깁니다. 그런 다음 여과지에 단단히 고정되면 표본을 새로운 15mL PBS 튜브로 옮겨 5분 동안 두 번 세척합니다. 피부 생검을 깨끗이 하려면 두 번째 세척 후 날카로운 면도날을 사용하여 조직을 약 0.2 x 0.5cm 조각으로 자르고 샘플의 긴 면이 샘플의 전방 후방 방향을 따라 절단되도록 주의하십시오.

모낭의 방향과 평행하게 생검 측면을 따라 절단하는 것도 광범위한 모낭 손상을 방지하는 데 도움이 됩니다. 그들은 새로운 15mL 튜브에 갓 준비된 5mL의 큐빅 원 세정 용액에 생검을 담그고 섭씨 37도의 혼성화 오븐의 회전 플랫폼에 튜브를 놓습니다. 조직 조각이 투명해지면 4mL의 PBS로 생검을 섭씨 37도에서 6시간 동안 4회 세척한 다음 부피당 20%의 자당 중량으로 4시간 동안 37도로 세척합니다.

배양이 끝나면 각 시료를 최적의 절단 온도 화합물로 개별 15mL 튜브에 넣고 섭씨 80도에서 하룻밤 동안 동결하여 항체 침투에 대한 조직의 투과성을 높입니다. 다음 날 아침, 적절한 항체와 관심 있는 필수 염료로 피부 샘플을 염색합니다. 그런 다음 2mL 튜브에 담긴 갓 준비한 큐빅 투 세정 용액 1mL에 검체를 24시간 동안 셰이커에 넣고 섭씨 37도 오븐에서 조직의 굴절률이 균일해질 때까지 배양합니다.

조직이 투명해지면 모낭 성장 방향이 커버 슬립 표면과 평행하도록 개별 유리 커버의 긴 면을 따라 생검을 배치합니다. 조직 위에 입방 2 용액 한 방울을 떨어뜨립니다. 커버 슬립에 1mL x 2cm 크기의 파란색 압정 스트립 2개를 놓고 두 번째 커버 슬립으로 생검을 덮습니다.

그런 다음 이미징 챔버를 컨포칼 현미경 스테이지에 놓고 조직을 광 경로로 이동합니다. 적절한 광원과 표준 epifluorescence filters를 사용하여 샘플을 스캔하여 형광으로 염색된 관심 영역을 식별한 다음 관심 영역의 형광 공초점 이미지를 획득합니다. 이 방법을 사용하면 성체 야생형 마우스의 두 두께의 등쪽 피부 생검을 모두 명확히하고 기저 각질 세포 마커 케라틴 14에 대한 항체로 염색 할 수 있습니다.

Dappy positive nuclei는 샘플 전체에서 볼 수 있으며 피부 유두와 같은 일부 해부학적 특징을 감상할 수 있습니다. K14 염색은 여포간 표피의 1세포 두께의 기저층에서 뚜렷합니다. 피지선과 모낭의 바깥쪽 뿌리초, 그리고 모낭의 돌출 부위에서 낮은 수준의 K14 발현만 감지되는 2차 모발 세균의 윤곽을 보여줍니다.

증식하는 세포를 시각화하기 위해 성체 야생형 마우스의 휴지기 상태에서 전체 두께의 등쪽 피부 생검을 통해 규명하고 염색할 수 있으며, 이를 통해 기저 여포 표피와 협부에 증식하는 각질세포의 존재를 밝힐 수 있지만 모낭의 돌출 부위에는 존재하지 않습니다. 피지선을 전체 두께의 등쪽 피부 생검을 시각화하기 위해 성체 야생형 마우스의 항원에서 생검을 통해 명확하고 염색할 수 있으며, 이를 통해 모낭의 협부 영역에서 피지선을 쉽게 검출할 수 있습니다. 표피 및 형질전환 동물의 형태학적 변화를 시각화하기 위해 전체 두께의 등쪽 피부 생검을 통해 여포 간 표피의 증식과 K14 표지 세포 덩어리가 진피로 근방으로 확장되어 확대된 형질전환 줄기 세포 집단을 나타내는 비정상적인 모낭의 증식을 드러낼 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 피부 샘플을 준비하고 정화하는 방법과 단일 세포 해상도에서 단백질 발현 패턴을 3차원으로 시각화하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다. 이 방법은 수행이 간단하며 비교적 안전하고 저렴한 시약을 사용합니다. 앞으로 더 많은 항체가 이 방법과의 호환성에 대해 테스트될 예정이며, 이를 통해 더 많은 단백질과 특정 유형의 관심 물질을 시각화할 수 있도록 이 분석을 확장할

광시트 현미경과 같은 다른 이미징 방법을 수행하여 더 큰 피부 샘플의 피부 해부학 및 단백질 발현 패턴을 3차원으로 시각화할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 피부과 분야의 연구자들이 피부 항상성, 유전자 변형 마우스 모델 및 피부 질환 모델 중 하나에서 진피와 표피 사이의 세포 및 분자 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열 것입니다.