Name: CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 배우세요 CUBIC 프로토콜을 이용하여 마우스 전체 피부 생검에서 단일 세분해 단백질 발현을 3D로 시각화하는 방법을. 이 기술은 피부 해부학과 병리학 연구에 정확한 분석을 제공합니다.

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우리는 동물 실험과 지원을 위해 호주 생물 자원 (Garvan 연구소, 호주), 생물 자원 센터 (UNSW 호주)와 동물 관리 및 윤리위원회 감사합니다. 이 작품은 호주 국립 보건 의료 연구위원회 (프로젝트 그랜트 APP1062720)에 의해 지원되었다. 박사 세자르 P. 카날 레스는 CONICYT - Becas 칠레 장학금 (# 72101076)의받는 사람입니다. 씨 바셈 Akladios는 UNSW 호주로 대학 국제 대학원 상을받는 사람입니다.

윤리 문 : 동물 주제와 관련된 모든 절차 승인 ACEC 프로토콜 13 / 64B에서 UNSW 호주의 동물 관리 및 윤리위원회 (ACEC)의 지침을 따르십시오. 투명 마우스 피부 조직의 1. 준비 참고 : 본 연구에 사용 된 모든 마우스는 C57BL / 6 유전 적 배경에 있었다 <ol><li> 마우스 피부 조직의 컬렉션입니다. <ol><li> 인도적 경추 탈구로 쥐를 안락사. </li><li> 조심스럽게 피부에 상처하지 트리머 복용 관리와 관련 피부 영역에서 머리카락을 제거합니다. </li><li> 워시 피부 인산염 완충 식염수 (PBS)에 70 % 에탄올로 오염을 제거합니다. </li><li> 집게와 지느러미 목 피부를 들어 올리고 가위로 절개를합니다. </li><li> 지느러미 마우스 피부 (약 1.5 × 4cm)의 큰 영역을 해부하다. </li><li> 필터 종이에 피부 진피 쪽을 평평하게하고, 샘플의 전후방 방향을 기록하십시오. </li><li> 트라이PBS에서 새로 제조 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액으로 가득 15 ML 튜브에서 m 필터 해부 피부 주위에 종이, 장소. </li><li> 4 ℃에서 냉장고에 밤새 실온에서 1 시간 동안 고정하거나. </li><li> 15 ML 튜브에 PBS에 세척 피부 2 × 5 분. 참고 : 다음 (1.1.10 - 1.1.12)을 조직의 장기 저장을위한 선택적인 단계입니다. </li><li> 실온에서 1 시간 세정 단계 동안 15 ㎖의 튜브에 에탄올 (25 %, 50 % 70 %)의 농도가 증가하여 PBS에서 해부 피부 탈수. </li><li> 더 사용할 때까지 4 ° C에서 15 ML 튜브에 PBS에서 70 % 에탄올 탈수 피부를 저장합니다. </li><li> 4시간 지우기 전에 실온에서 1 시간 세정 단계 동안 15 ml의 튜브에서 에탄올 (70 %, 50 %, 25 %, 0 %)의 농도가 감소함에 따라 PBS에서 피부 조직을 재수. </li></ol></li><li> 마우스 피부 조직 검사를 지우기 <ol><li> 3.85 g의 요소와 3.85 g의 N, N, N을 용해하여 CUBIC1 클리어 솔루션을 준비 &#39;, N&#39;70 °의 C - (60)에 설정된 히터 증류수 5.38 ㎖ 중의은 - 테트라 (2- 히드 록시 프로필) 에틸렌 디아민. 뜨거운 교반기를 사용합니다. </li><li> 이 분명하고, 실온으로 냉각 후, 용액에 2.31 g의 폴리에틸렌 글리콜 모노 메틸 -p- isooctylphenyl 에테르 / 트리톤 X-100을 추가한다. </li><li> 대략적인 크기 0.2 × 0.5 cm의 생검에 날카로운 면도날와 마우스의 피부를 잘라, 그리고 15 ML 튜브에 CUBIC1 클리어 솔루션 5ml에 잠수함. 모낭의 시각화를 최적화하기 위해, 생검의 긴면이 샘플의 안테 - 후방 방향을 따라 절단되어 있는지 확인합니다. </li><li> 37 ° C에서 하이브리드 오븐에서 회전하는 플랫폼에 배치합니다. </li><li> 7 일 후 청산 솔루션을 변경합니다. 사용하기 전에 신선한 CUBIC1 솔루션을 준비합니다. </li><li> 7 일 후 조직의 투명성을 확인합니다. 필요한 경우 조직이 완전히 투명해질 때까지, CUBIC1 청산 용액에 조직 검사를 둡니다. </li><li> 피부 조직 검사가 투명하면,CUBIC1 솔루션을 제거하고 37 ℃에서 6 시간 동안 조직 4 번 씻어 1 × PBS의 4를 가하여. </li><li> 37 ℃에서 4 시간 동안 15 ml의 관에서 PBS에 V 크로즈 / w 20 %의 피부 조직을 세척 하였다. </li><li> -80 ° C 형 냉장고에 하룻밤 15 ML 튜브 매체 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물을 장착의 조직을 고정. 참고 :이 단계는 다음 단계에서 항체 침투를 위해 조직 검사의 투과성을 증가 할 것이다. </li></ol></li></ol> 2. 면역 형광 염색법 <ol><li> 3 시간 - 2 실온에 1.2.9에서 조직) 해동. </li><li> 실온에서 8 시간 동안 PBS 5 ㎖로 15 ML 튜브에 세척 조직의 OCT 화합물을 제거합니다. </li><li> 37 년 쉐이커에 3 일 PBST (PBS + 0.1 % 트리톤 - X100) 100 : 2 ML 튜브로 전송 생검, 모두 1 희석, 1 ml의 토끼 방지 Keratin14 또는 토끼 항 사료된다 항체의 조직을 품어 C 오븐 °. </li><li> 15 ㎖의 관,로 전송 생검차 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 PBST 5ml에 6 시간 동안 조직을 4 회 반복한다. </li><li> 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 삼일 PBST 100과 부화 : 2 ML 튜브로 전송 생검 1, 희석 차 항체 Alexa594 1 ml의 항 - 토끼를 추가합니다. </li><li> 15 ML 튜브로 전송 생검, 그리고 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 PBST의 5 ㎖에서 6 시간 동안 조직을 4 회 반복한다. </li><li> 2 ML 튜브로 전송 생검 추가, 1 ml의 4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 핵 Counterstain과 용액 (1 : 1,000) PBST와 37 ° C 오븐에 통에 밤새 품어. </li><li> DAPI의 대조 염색 액을 제거하고 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 조직을 6 시간 동안 4 회 씻어 2 ML 튜브에 PBST 1 ㎖​​를 추가합니다. 참고 : 선택 단계 : 생검 최소 3 주 동안 0.02 %의 아 지드 화 나트륨과 1X PBS에서 어둠 속에서 저장 될 수있다. </li></ol> 3. 나일 레드 염색 <ol><li> 1m의 최종 농도로 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 나일 레드 분말을 용해g / ㎖ </li><li> 1 μg / ML의 최종 농도는 1 ㎖의 PBS로 1 μL 나일 적색 용액을 추가한다. </li><li> 해동이 실온에 1.2.9에서 조직) - 3 시간 및 상온에서 8 시간 동안 5 ㎖ PBS로 세척한다. </li><li> 2 ML 튜브에 조직 검사를 전송하고, 실온에서 2.5 시간 동안 1 ml의 나일 레드 염색 용액에 조직을 잠수함. </li><li> 실온에서 30 분 동안 1 ml를 PBST로 4 회 2 ㎖의 튜브 피부 생검을 씻는다. </li><li> 상기 2 ㎖의 튜브에서 PBST 용액을 제거 DAPI 핵으로 대조 용액 (1 : 1000) 1 ㎖를 추가 PBST로 실온에서 밤새 배양한다. </li><li> DAPI의 대조 염색 액을 제거하고 실온에서 6 시간 동안 피부 조직을 4 회 씻어 2 ML 튜브에 PBST의 1ml를 추가합니다. 참고 : 선택 단계 : 생검 최소 3 주 동안 0.02 %의 아 지드 화 나트륨과 1X PBS에서 어둠 속에서 저장 될 수있다. </li></ol> 4. 이미지 <ol><li> (50)를 포함하는 CUBIC2 클리어 솔루션을 준비% 슈 크로즈, 25 % (w / v)의 요소, 10 % (/ V w) (w / v)의 2,2 &#39;, 2&#39; &#39;- nitrilotriethanol 및 0.1 % (v / v) 트리톤 X-100. </li><li> 37 ° C의 오븐에서 24 시간 동안 진탕 기에서 2 ㎖의 튜브에 1 ㎖의 용액 CUBIC2 피부 조직을 인큐베이션. 이 단계에서는 조직의 굴절률을 고르게한다. </li><li> 조직의 선명도를 확인합니다. 이 클리어되면, 유리 커버 슬립 상에 그 긴 변에 전체 피부 생검 (0.2 × 0.5 cm)에 위치, 모낭의 길이 방향이 커버 슬립의 표면에 평행 같은 것을 (# 1 24 X 60mm) 참고 : 선택 단계 : 항체 염색 생검은 약 7 일 동안 CUBIC2 용액에 저장 될 수있다. 나일 레드 염색 생검은 최대 1 일 동안 CUBIC2 솔루션에 저장 될 수 있으며, 가능한 한 빨리 군데해야합니다. </li><li> 영상 실을 준비합니다 (그림 1) (F를, 파란색 압정 반죽 또는 유사한을 재생하고,이 된 커버 (24 × 50 ㎜) : 이미징 챔버의 제조에 필요한 소모품은 다음과 같습니다 참고igure의 1A). <ol><li> 블루 압정의 두 개의 얇은 스트립 (직경 약 1mm × 2 ㎝)와 두 개의 커버 슬립 (그림 1B)를 준비합니다. </li><li> 피부 생검 (그림 1C)를위한 충분한 공간을 허용 한 커버 슬립에 파란색 압정 스트립을 놓습니다. 4.4.3) </li><li> CUBIC2 솔루션의 드롭 (그림 1C)의 커버 슬립에 스트립 사이에 피부 조직 검사를 놓습니다. </li><li> 두 번째 커버 슬립 (그림 1D)와 피부 생검을 커버. </li></ol></li><li> 공 초점 현미경의 무대에 탑재 된 피부 조직 검사와 영상 챔버를 놓고 빛 경로로 조직을 이동합니다. </li><li> 형광 염색 관심 지역을 식별하는 수은 또는 할로겐 광원 및 표준 표면 형광 필터 (예 DAPI / GFP / CY3 / CY5)를 이용하여 시료를 검사한다. </li><li> (a 10X 및 20X 대물 렌즈 (NA 0.75) 및 표준 촛점 형광 이미징 기술을 사용하여 예를 들어., DA로 주목 화상 영역PI 염색 샘플은 405 nm의 레이저와 조명과 425 사이의 형광 신호 수집 - 475 nm의, 그리고 알렉사 플 루어 594 또는 나일 레드 묻은 시료와 561 nm의 레이저와 조명과 570 사이의 형광 신호 수집 -) 620 nm의. </li><li> 현미경 Z 스택 화상 획득 소프트웨어를 이용하여 관심있는 각각의 영역의 영상 Z-스택을 생성한다 (예., 후술하는 바와 같이 소프트웨어 4.13 NIS 촬상 소자를 사용하여). <ol><li> 최적의 레이저 파워와 PMT HV를 확인 / 오프셋 설정은 샘플 형광을 수집하기 위해 선정되었다. </li><li> &quot;취득 제어&quot;에서 &quot;ND 취득&quot;도구 모음을 엽니 다. </li><li> (다른 모든 탭이 선택 해제되어 있는지 확인합니다) &quot;Z 시리즈 설정&quot;탭을 선택합니다. </li><li> 라이브 스캔하는 동안, 샘플의 상단에 초점을 맞추고 &quot;최고&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 샘플의 바닥에 집중하고 &quot;바닥&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 입력 필수 단계 크기 (누르거나 최적화 된 스텝 크기 버튼). </li><li> 사전SS 버튼 &quot;지금 실행&quot;. </li><li> 개별 티파니 이미지 스택과 같은 결과 Z-스택 (이미지 Z-스택 당 1 형광 색소)을 저장합니다. </li></ol></li><li> 3D 분석 소프트웨어를 사용하여 관심의 3 차원 볼륨 영역을 재구성 화상 Z-스택을 사용 (예., 후술 Imaris x64의 7.2.3를 사용하여). <ol><li> 분석 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 선택 3D 볼륨 생성을위한 도구 모음에 버튼을 &quot;능가&quot;. </li><li> 열기 최초의 컬러 이미지 Z 스택 (예., DAPI). </li><li> 추가 색상 채널, 형광 색소 당 하나의 채널을 추가하려면 &#39;채널을 추가&#39;도구를 사용합니다. 따라서 DAPI와 알렉사 플 루어 594 형광 색소를 모두 포함하는 샘플은 두 개의 채널이 필요합니다. </li><li> 위의 4.7에서의 결정에 따라, (XYZ)을 올바른 픽셀 (복셀) 크기를 설정하려면 &quot;이미지 속성&quot;도구를 사용합니다. </li><li> 필요에 따라 채널의 색상을 변경하려면 &quot;디스플레이 조정&quot;도구를 사용하여 (예를 들어, 파란색에 DAPI 채널을 설정 알렉사 플 루어 빨간색으로 594 채널). </li><li> 포에이미지 창에서 3D 볼륨을 sition, 필요에 따라 클릭하고 드래그 볼륨으로 컴퓨터 마우스를 사용합니다. </li><li> 3D 영상의 스크린 샷을 생성하기 위해 도구 모음에서 &quot;스냅 샷&quot;도구를 사용합니다. </li><li> 3D 샘플 회전의 영화를 생성하는 도구 모음에서 &quot;애니메이션&quot;도구를 사용합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+the+surface+of+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).</li>
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</ol>

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피부 개발 및 항상성 제어 규제기구는 가장 일반적으로 피부 형태학, 세포 집단 또는 단백질 발현의 제한된 하락 가능 항체와 조직 절편의 조직 학적 염색 또는 표지를 사용하여 2 차원으로 연구된다. 다수의 방법은 표피 전체 마운트 10-13의 3 차원 단일 세포 해상도 세포 단백질의 공간적 조직의 시각화를 개선하기 위해 개발되었다. 이들 중 일부는 특히 그러나 털이 피부를 사용하여 기술적 도전 진피에서 표피의 분리를 포함하고, 종종 모낭 조직 손상 및 파손을 초래한다. 또한, 배아 개발 및 조직의 항상성 동안 그들 사이에 발생하는 세포와 분자의 상호 작용을 연구 표피와 진피 손상의 분리. &#39;플랫 마운트 방식은&#39;다른 방법입니다 전체 두께 마우스피부 절개 및 면역 염색, 면역 후 신호 (14)를 유지하면서 벤질 벤조 에이트 및 벤질 알콜 (BBBA)을 이용하여 정화된다. 이 방법은 진피, 표피의 기술적 도전 분리를 필요로하지 않...

피부는 우리의 생존을 위해 필수적이다. 그것은 세 가지 주요 레이어 외부 표피, 진피 및 피하로 구성되어 있습니다. 표피는 높은 재생 조직이다. 그것은 주로 각질 구성된 층상 편평 상피이다. 각질 세포는 기저층에서 태어나 차별화하면서 suprabasal 레이어를 통해 위쪽으로 이동하고, 결국은 자신의 출생 후 한 달에 대한 외부 각질화 층에서 발산되어있다. 표피는 모낭 및 피지선 포함 부속물들을 개발하고있다. 모낭은 생활 1 전체에 순환 방식으로 재생. 표피의 재생 능력은 interfollicular 표피와 모낭 (2)의 기저층에있는 줄기 및 전구 세포의 존재에 의해 사용할 수 있습니다. 많은 신호 전달 경로는 표피 개발 및 재생에 관여하고있다. 이들 중 일부는 내 발생이러한 헤지 호그 경로로만 표피. 다른 신호 이벤트는 진피와 표피 세 사이에 발생한다. 예를 들어, 진피의 Wnt 신호 모낭 발달에 중요한 것으로 생각되며, 그들은 활성화 성장기의 발병 모유두에서 분비되는 모낭 벌지 줄기 / 선조 세포의 증식 및 모발 성장은 4. 더 나은들이 피부암으로 회생 피부 질환으로 교란 될 수있는 방법을 이해하는 표피 발달 및 재생을 제어하는​​ 세포 및 분자 적 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다. 이 문서에서는 C의 리어 설명, U는 전체 마운트 피부 준비를 명확히하고, 공 초점 현미경에 의한 단일 셀 해상도에서 3 차원 단백질 발현 패턴을 시각화하는 B 비 I의 maging 칵테일과 C omputational 분석 (CUBIC) 프로토콜 5-7 nobstructed. 입방 방법은 피부의 몰입을 포함한다이 아미노 알코올 기반 화학 칵테일의 조직. 이러한 솔루션은 단일 세포 면역 해상도를 허용 투명 단백질 손상 조직을두고 피부 샘플의 굴절률을 조정한다. interfollicular 표피와 모낭에서 각질 세포 인구를이 CUBIC 프로토콜, 기초를 사용하고 증식하는 안티 Keratin14 (K14) 및 안티 사료된다 항체를 사용하여 야생형 마우스의 전체 두께 피부 생검에 몇 군데 있었다. 야생형 피부 조직 검사에서 피지선은 나일 레드 염색을 사용하여 시각화 하였다. 마지막으로, 야생형 및 증식 YAP2-5SA-ΔC 피부 생검의 기초 각질 세포 인구 8을 비교 하였다. 이 CUBIC 프로토콜은 단일 셀 해상도에서 전체 두께 피부 조직 검사에서 단백질 발현의 시각적 평가를 가능하게하고, 유전자 변형의 피부의 표피 해부학과 형태 학적 결함을 인식하는 중요한 도구입니다마우스 및 표피 개발과 재생의 기초가되는 세포 및 분자 메커니즘을 조사합니다.

<table><tbody><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 96% (비변성)</td><td>Chem-supply</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>나일 레드</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>72485-100MG</td><td></td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)</td><td>로슈</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N' -tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 mono-p-isooctylphenyl ether</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>최적 절단 온도 (OCT) 화합물</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>항케라틴14 항체</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>항-Ki67 항체&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티-토끼 Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>우레아</td><td>머크 밀리포어</td><td>66612</td><td></td></tr><tr><td>2,2&프라임;,2&프라임; '-니트릴로트리탄올</td><td>Merck Millipore</td><td>137002</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon Instruments Inc</td><td>Nikon A1 - 컨포칼 현미경</td><td></td></tr><tr><td>cruZer6 페이스 트리머</td><td>Braun</td><td>Braun cruZer6 페이스</td><td></td></tr><tr><td>아지드나트륨</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td></td><td></td>438456</tr></tbody></table>

cubic 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

피부는 우리의 생존을 위해 필수적이다. 외부 표피 층은 모낭과 땀샘 우리의 몸과 표피 부속의 대부분을 커버하는 층상 편평 상피이다 interfollicular 표피로 구성되어 있습니다. 표피는 일생 동안 부상에 응답하여 재생을 겪는다. 이 긴밀하게 표피 내부와 표피와 진피 사이의 활성 여러 규제 메커니즘에 의해 규제되는 기저 상피 줄기 / 전구 세포 인구를 K14이 발현으로 활성화되어 있습니다. 이 문서는 전체 두께 마우스 피부 생검을 명확히하고, K14 단백질 발현 패턴을 시각화하는 간단한 방법을 설명, 사료된다 세포 증식라고 표시된, 나일 레드 sebocytes를 표시 및 3D에서 단일 셀 해상도 DAPI 핵 라벨. 이 방법은 정확한 평가와 피부 해부학과 병리학의 정량 및 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의 수 있습니다. 입방 프로토콜은 일입니다단일 셀 해상도에서 전체 두께 피부 생검 분자 및 세포 상호 작용을 조사 날짜에 사용할 수 전자 최선의 방법.

성인 야생형 마우스의 전체 두께 등의 피부 생검은 기저 각질 세포 마커 Keratin14 (K14)를 결합하는 항체로 염색, 명확하고, 핵은 DAPI 염색 용액 (그림 2, 영화 1)으로 대조 하였다. DAPI 양성 핵 샘플 (도 2A, C)에 걸쳐 볼 수 있었고, K14 염색 배타적 interfollicular 표피의 하나의 셀 두께의 기초 층에 표시이고, 피지선 (검은 색 별표)의 외주 루트 칼집을 개략적 모낭은 모발 이차 세균 (도 2B, C)에서, 앞서 구 출판. K14 염색 강도는 interfollicular 표피 원위 모낭 및 보조 헤어 세균 (흰색 별표)에 높고, 그리고 모낭 (도 2c에 니어)의 팽창 영역에서 상대적으로 낮았다. 진피 유두 명확하게 visibl도했다DAPI 라벨을 통해 전자 <...

이 보고서는 전체 두께가 마우스 피부 생검을 명확하게하고, 3 차원의 단세포 해상도 단백질 발현 패턴 증식 세포 및 sebocytes 시각화 입방 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 피부 해부학과 병리학의 정확한 평가를 가능하게하고, 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의.

CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

본 절차의 전반적인 목표는 단일 세포 수준에서 3차원으로 세포 증식 및 단백질 발현 패턴을 시각화하고, 피부의 해부학적 구조와 병리학적 상태를 정확하게 평가하는 것입니다. 이 방법은 세포 및 분자 메커니즘이 표피의 발달과 재생을 어떻게 조절하는지, 그리고 피부 질환 중에 이러한 메커니즘이 어떻게 교란되는지에 대한 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전층 피부 생검 조직 내의 개별 세포를 전례 없는 정확도로 3차원 시각화할 수 있는 기술적으로 단순한 프로토콜이라는 점입니다.이 방법은 전체 피부 샘플에서 표피와 진피 사이의 상호작용 연구를 용이하게 합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 모낭을 손상시키지 않고 작은 평면 피부 생검 조직을 준비하는 데 다소 어려움을 겪을 수 있습니다. 절차 시연은 UNSW Australia의 발달 및 재생 피부과 유닛 박사 과정생인 Betty Maclarios가 담당합니다.먼저 트리머를 사용하여 안락사시킨 마우스의 목 부분 털을 깎되, 피부에 상처가 나지 않도록 주의합니다. 그다음 70% ethanol과 PBS로 피부를 소독합니다. 이어서 핀셋으로 목 등쪽 피부를 들어 올리고 가위를 사용하여 약 1.5 by 4 cm 면적의 마우스 등쪽 피부를 제거합니다.그런 다음 피부의 진피 쪽이 아래로 향하게 하여 여과지 위에 평평하게 펴고, 시료의 전후 방향을 표시한 뒤 박리된 피부 주변의 종이를 다듬습니다. 최적의 영상을 얻기 위해서는 피부 시료가 평평하게 유지되어야 하며 모낭의 방향이 일정해야 합니다. 시료를 적절한 전후 위치로 유지하기 위해, 피부 조각을 직사각형 생검 형태로 여과지에 고정합니다.샘플을 갓 준비한 4% PFA와 PBS가 채워진 15 mL 튜브로 옮깁니다. 그 다음, 샘플들이 여과지에 단단히 고정되면 새로운 PBS가 담긴 15 mL 튜브로 옮겨 5분씩 두 번 세척합니다. 피부 생검 조직을 투명하게 만들기 위해, 두 번째 세척 후 날카로운 면도날을 사용하여 조직을 약 0.2 by 0.5 cm 크기의 조각으로 자르되, 샘플의 긴 쪽이 샘플의 전후 방향(anterior posterior direction)을 따라 절단되도록 주의합니다.모낭의 방향과 평행하게 생검 조직의 측면을 따라 절단하는 것도 광범위한 모낭 손상을 방지하는 데 도움이 됩니다. 그런 다음, 새 15 mL 튜브에 5 mL의 신선하게 준비된 cubic one 투명화 용액을 넣고 생검 조직을 침지시킨 후, 37 °C의 하이브리드화 오븐 내 회전 플랫폼 위에 튜브를 놓습니다. 조직 조각들이 투명해지면, 37 °C에서 4 mL의 PBS로 6시간씩 4회 세척하고, 이어서 20% w/v sucrose 및 PBS로 37 °C에서 4시간 동안 세척합니다.배양이 끝나면, 항체 침투에 대한 조직의 투과성을 높이기 위해 각 시료를 최적 절단 온도 화합물(optimal cutting temperature compound)과 함께 개별 15 mL 튜브에 넣고 80 °C에서 하룻밤 동안 동결시킵니다. 다음 날 아침, 피부 시료를 적절한 항체와 관심 있는 생체 염색약으로 염색합니다. 그 후, 조직의 굴절률을 균일하게 맞추기 위해 2 mL 튜브에 담긴 시료를 갓 제조한 1 mL의 cubic two 투명화 용액(clearing solution)에 넣고 37 °C 오븐 내 쉐이커에서 24시간 동안 배양합니다.조직이 투명해지면, 모낭의 성장 방향이 커버 슬립 표면과 평행하도록 각 유리 커버 슬립의 긴 쪽에 생검 조직을 배치하십시오. 조직 위에 cubic two solution을 한 방울 떨어뜨립니다. 커버 슬립 위에 1 mL x 2 cm 크기의 블루택(blue tack) 조각 두 개를 배치한 다음, 두 번째 커버 슬립으로 생검 조직을 덮으십시오.다음으로 이미징 챔버를 공초점 현미경 스테이지 위에 놓고 조직을 광로로 이동시킵니다. 적절한 광원과 표준 에피형광 필터를 사용하여 샘플을 스캔하여 형광 염색된 관심 영역을 식별한 다음, 해당 관심 영역의 형광 공초점 이미지를 획득합니다. 이 방법을 통해 성체 야생형 마우스의 두꺼운 등 피부 생검 조직을 투명화하고 기저 각질 형성 세포 마커인 keratin 14 항체로 염색할 수 있습니다.샘플 전체에서 Dappy 양성 핵이 관찰되며, 이를 통해 진피 유두와 같은 일부 해부학적 특징을 확인할 수 있습니다. K14 염색은 모낭간 표피의 단일 세포층인 기저층에서 뚜렷하게 나타납니다. 피지선과 모낭의 외근초, 그리고 2차 모아(hair germs)의 윤곽이 드러나며, 모낭의 팽대부(bulge area)에서는 낮은 수준의 K14 발현만이 검출됩니다.성체 야생형 마우스의 휴지기 전층 등 피부 생검 조직에서 증식하는 세포를 시각화하기 위해, 시연된 바와 같이 투명화 및 염색을 수행하면 모낭의 팽대부(bulge) 영역이 아닌 기저 간모낭 표피와 협부(isthmus)에 증식하는 각질형성세포가 존재함을 확인할 수 있습니다. 피지선을 시각화하기 위해 성체 야생형 마우스의 항원성 전층 등 피부 생검 조직을 투명화 및 염색하면 모낭의 협부 영역에서 피지선을 검출하는 것이 용이해집니다. 표피의 형태학적 변화와 형질전환 동물을 시각화하기 위해 전층 등 피부 생검 조직을 투명화 및 염색하면, 간모낭 표피의 과형성 및 진피 쪽으로 근위 방향으로 확장되어 확장된 형질전환 줄기세포 집단을 나타내는 K14 표지 세포 덩어리를 가진 비정상적인 모낭이 관찰됩니다.이 영상을 시청한 후, 피부 샘플을 준비 및 투명화하고 단일 세포 해상도의 3차원 공간에서 단백질 발현 패턴을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 수행하기 간단하며, 상대적으로 안전하고 저렴한 시약을 사용합니다. 향후 이 방법과의 적합성을 확인하기 위해 더 많은 항체를 테스트함으로써, 분석 범위를 확장하여 더 많은 단백질과 특정 관심 영역을 시각화할 수 있을 것입니다.더 큰 피부 샘플의 피부 해부학적 구조와 단백질 발현 패턴을 3차원으로 시각화하기 위해 라이트 시트 현미경법(light sheet microscopy)과 같은 다른 이미징 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술이 개발되면 피부과 분야의 연구자들이 유전자 변형 마우스 모델 및 당사의 피부 질환 모델에서 피부 항상성 유지 시 진피와 표피 사이의 세포 및 분자적 상호작용을 탐구하는 길이 열릴 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 3D의 단일 세포 해상도에서 전체 마운트 피부 생검에서 단백질 발현의 시각적 평가를 위한 조직 투명화 의존적 이미징 기술인 CUBIC 기반 시각화 기술에 대해 설명합니다. 기술적으로 간단한 이 프로토콜을 사용하면 피부 절편을 준비하지 않고도 피부 단백질을 시각화할 수 있습니다.

CUBIC 기반 단백질 발현 시각화: 전체 두께 마우스 피부 생검에서 단백질 발현을 시각화하는 절차

우리는 고분자 crowders (MMC)를 이용하여 세포 외 기질 단백질이 풍부한 세포 - 유래 매트릭스를 획득하기 위해 프로토콜을 제시한다. 또, 구조의 성숙을 유지하면서 배양 시간을 단축 차원의 Organotypic 피부 공동 배양 세대에서 MMC를 포함하는 프로토콜을 제시한다.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

Immunohistochemistry는 조직 내 단백질 국소화 및 발현을 평가하기 위한 강력한 실험실 기술입니다. 현재의 반자동 정량 분석 방법은 주관성을 도입하고 종종 재현성 없는 결과를 생성합니다. 여기에서는 다중 스펙트럼 이미징을 사용하여 multiplexed immunohistochemistry 및 단백질 발현 및 공동 국소화의 객관적인 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

우리는 동적 세포 돌출부의 길이에 따른 상대 단백질 농도의 반자동 추적을위한 소프트웨어 솔루션을 제시합니다.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

이 작품은 공 촛점 이미징 양식의 완전한 착취를 가능하게 두께, 3 차원 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 및 이미징 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 항원 성을 보존하고 피부 조직 및 잠재적으로 다른 조직 유형을 분석하는 강력한 시스템을 나타냅니다.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

여기 선물이 주소 드롭릿 microarrays (Adm), 작은 물방울 배열 기반 메서드 단일 셀에 절대 단백질 풍부를 확인할 수 있습니다. Adm의 기능 인간 암 세포 선에서 종양 억제기 단백질 p53의 표현에이 특성을 설명 합니다.

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

이 프로토콜은 마우스 모델에서 피부 각질을 분리하고, 금속 태그가 달린 항체로 염색하고, 다른 세포 주기 단계에서 관심 있는 단백질의 발현 패턴을 프로파일화하기 위해 질량 세포 측정에 의해 염색된 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

형태학적 변화는 활성화 다음 면역 반응 섬유 아세포 세포에서 발생하고 세포 모집에 변경을 촉진. 유전자 조작섬유아세포 특이적 단백질 1(FSP1)-cre와 함께 2광자 이미징을 활용; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) 마우스 라인과 녹색 형광 태그 lipopolysaccharide-FITC, 우리는 진피 섬유아세포와 생체 내 형태학적 변화에 있는 lipopolysaccharide의 고도로 특정 한 섭취를 설명할 수 있습니다.

피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

여기에서는 종양 미세 환경을 더 잘 특성화하고 특정 세포 집단을 식별하기 위해 Spatial Omics 기술의 관심 영역(ROI)을 미세 조정하는 프로토콜을 설명합니다. 단백질체학 분석의 경우 자동화된 맞춤형 프로토콜이 ROI 선택을 안내할 수 있는 반면, 전사체학 분석은 50μm의 작은 ROI를 활용하여 미세 조정할 수 있습니다.

조직에서 단백질 및 RNA 발현의 공간 프로파일링: 가상 미세 해부를 미세 조정하는 접근 방식

다중화 바코드 이미지 분석은 최근 종양 미세 환경의 특성을 개선하여 세포 구성, 기능 상태 및 세포-세포 상호 작용에 대한 포괄적인 연구를 가능하게 했습니다. 본 명세서에서는 올리고뉴클레오티드 접합 항체의 바코딩을 사용하는 염색 및 이미징 프로토콜과 고차원 이미지 분석 기술을 사용할 수 있는 사이클 이미징을 설명합니다.

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

IBEX(Iterative-bleaching-extends-multiplexity)와 상용 뉴클레오티드 표지 분석(Click-iT EdU)의 조합은 고정된 냉동 쥐 조직 절편에서 매우 역동적인 과정에서 분열하는 세포 유형을 검출하고 분류할 수 있습니다. 또한 새로운 오픈 소스 이미지 처리 파이프라인은 처리량이 많은 이미지 획득 및 분석을 제공합니다.

조직 샘플의 피부 세포 표현형 및 증식 상태를 평가하기 위한 고처리량 이미징 및 분석 워크플로우

배우세요 CUBIC 프로토콜을 이용하여 마우스 전체 피부 생검에서 단일 세분해 단백질 발현을 3D로 시각화하는 방법을. 이 기술은 피부 해부학과 병리학 연구에 정확한 분석을 제공합니다.

CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

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