Name: 멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 학습하세요 멀티플렉스 면역조직화학법과 다중스펙트럼 영상을 활용하여 단백질 발현 및 공동현지화를 객관적으로 정량화하는 방법을. 이 기술은 연산자 주관성을 제거하여 재현성 있는 결과를 제공합니다.

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저자는 시설과 서비스 사용을 위해, 병리 및 진단 검사 의학의 UW 부에 의해 지원되는 부분 UWCCC 부여 P30의 CA014520에, 병리 실험실에서 위스콘신 중개 연구 이니셔티브의 대학 감사합니다.

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<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fibrillar+collagens+and+extracellular+matrix+of+glandular+benign+prostatic+hyperplasia+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules.</a> PLoS One. 9 (10), e109102(2014).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+is+elevated+in+human+benign+prostatic+hyperplasia+specimens+compared+to+histologically+normal+prostate+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Exp+Urol%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue.</a> Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).</li>
<li>Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD147+expression+predicts+biochemical+recurrence+after+prostatectomy+independent+of+histologic+and+pathologic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features.</a> BMC Cancer. 15 (1), 549(2015).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finasteride+treatment+alters+tissue+specific+androgen+receptor+expression+in+prostate+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues.</a> Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).</li>
<li>Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+steroid+receptor+expression+and+localization+in+benign+prostatic+hyperplasia+varies+with+tissue+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment.</a> Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).</li>
<li>Taylor, C. R., Levenson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+II%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.</a> Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).</li>
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<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).</li>
<li>Ong, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+pathological+immunohistochemistry+scoring+is+more+time-effective+than+conventional+scoring%2C+but+provides+no+analytical+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage.</a> Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

단백질 발현을 평가하기위한 기존의 면역 조직 화학의 사용은 분석 22,23 주관적 반 정량 방법에 의해 제한된다. 사전 플랫폼은 바이오 마커의 발현 및 지역화의 높은 처리량 분석을 위해 만들어졌습니다. 조직과 세포 내 구획 모두의 상세한 분할은 사용자가 관심의 다른 마커와 바이오 마커의 발현, 현지화 및 공동 현지화를 연구 할 수 있습니다. 이전의 연구에서, 우리는 같은 세포 구획 18,20,21에 지역화 된 단백질을 연구하는 데 특히 IHC 및 다중 분광 영상의 유틸리티를 증명하고있다. 조직 마이크로 어레이 (24)와 결합하면, 이러한 기술은 병리학 자에 의해 수동 분석에 의해 허용 된 것보다 단백질 발현의 신속하고 객관적인 정량 허용합니다. 단백질 정량에 대한 면역 조직 화학 염색의 사용과 한 가지 문제 때문에 subjec에 결과 irreproducibility입니다분석과 기술 및 시약의 고유 한 차이점적인 성격....

<html> 면역 조직 화학 (IHC)는 조직 내 단백질의 검출을위한 표준 실험실 기술이며, IHC 여전히 널리 연구 및 진단 병리학 모두에 사용된다. IHC 염색의 평가 결과의 해석에 잠재적 인 편견을 도입, 자주 반 정량적이다. 많은 반 정량적 인 접근 방식은 최종 진단 1-4로 염색 강도 및 염색 정도를 모두 통합하는 개발되었다. 다른 시스템은 더 나은 식 (5)를 국산화하기 위해 채점 강도와 세포 내 위치를 포함한다. 다수 시청자의 평균 점수의 혼입은 종종 단일 뷰어 바이어스 (6)의 효과를 최소화하기 위해 이용된다. 이러한 노력에도 불구하고, 분석 주관 여전히 7 오염의 정도를 평가하는 특히, 남아있다. 인간의 입력에서 프로토콜 표준화 및 최소화 주관 정확하고 재현성 IHC 결과를 만드는 중요합니다. 콘텐츠 &quot;&gt; 조직 내 단백질 발현을 결정하기위한 IHC 이외에 다른 옵션이있다. 이러한 면역과 같은 다른 기술은 단백질 발현을 조사하는 금 표준으로 간주되는 동안 연구 설정 내 면역 전통적 단백질 지역화 8을 조사하는 수단으로 간주되어 . 결정 조직 또는 세포 구획 별 발현 조직 슬라이드 형광 항체의 사용은 합리적인 타협을 제공한다. 이러한 세포 분획 또는 레이저 캡처 미세 절제 9,10와 같은 고급 기법을 도입하지 않고 어렵지만 의한 NADPH에 배경 형광도, lipofuscins, 망상 섬유, 콜라겐과 엘라스틴은 11 정확한 정량 어렵게 만들 수 있습니다. 자동 계산 병리 플랫폼은 병리 염색 12-15의보다 객관적인 정량을위한 유망 방향입니다. 조직 마이크로 어레이와 멀티 스펙트럼 영상을 결합큰 샘플 크기에서 단백질 발현의 높은 처리량 분석을 용이하게한다. 범주 형 포맷 (16)보다 연속적으로 데이터를 리턴하는 동안 실질적으로 고유 편향 및 분석에 필요한 시간의 양을 줄이면서 이러한 기술로 단백질 공동 지역화 염색 얼룩이, 조직 및 세포 내 편재 분석이 가능하다. 따라서, 본 연구의 목적은 멀티 스펙트럼 영상 소프트웨어를 사용하여 분석 면역 다중화를 수행하는 유틸리티의 방법을 설명 하였다. 이 프로토콜은 네 개의 최적화 된 단일 클론 항체와 단일 조직 섹션 슬라이드 설명서, 멀티 플렉스 면역 조직 화학 염색을 위해 작성되었습니다. 대표 실험으로서, 핵 항 - 토끼 에스트로겐 수용체 알파 (ERα) 및 안드로겐 수용체 (AR)은 막 - 결합 항 - 마우스 CD147 및 막 - 결합 항 - 마우스 E-cadherin과 함께 다중화된다. 선택의 항체는 SUBSTITUT 할 수있다여기에 나와있는 항체 에드하지만, 항체의 각 조합은 별도의 최적화가 필요합니다. 모든 항체에 대한 사전 처리는 동일해야합니다. 아칸소와 CD147 항체 칵테일로 개별적으로하고 최적화해야합니다. 각 항체는 비오틴없는 중합체 시스템 및 4 고유 발색제 중 하나를 사용하여 검출된다.

<table><tbody><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3F1GAL</td><td>NFPA 등급: 건강 &ndash; 2, 화재 &ndash; 3 , 반응성 &ndash; 0</td></tr><tr><td>에틸 알코올-200 증명</td><td>Fisher Scientific</td><td>4355223</td><td>NFPA 등급: 건강 &ndash; 0, 화재 &ndash; 3 , 반응성 &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>NFPA 등급: 건강 &ndash; 2, 화재 &ndash; 0 , 반응성 &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td>NFPA 등급: 건강 &ndash; 2, 화재 &ndash; 0 , 반응성 &ndash; 0</td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>Chem-Impex</td><td>1512</td><td>NFPA 등급: 건강 &ndash; 0, 화재 &ndash; 1 , 반응성 &ndash; 0</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td>NFPA 등급: 건강 &ndash; 1, 화재 &ndash; 0, 반응성 &ndash; 0</td></tr><tr><td>Peroxidazed</td><td>Biocare Medical</td><td>PX968</td><td>피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 피부 자극 및 눈 손상을 일으킬 수 있습니다.</td></tr><tr><td>에스트로겐 수용체 알파</td><td>Thermo Fisher Scientific-Labvision</td><td>RM9101</td> 위험한 안드로겐 수용체<td>로 분류되지 않음</td></tr><tr><td></td><td>SCBT</td><td>sc-816</td><td>위험한</td></tr><tr><td>CD147</td>로 분류되지 않음 <td>Biodesign</td><td>P87535M</td><td>위험한 것으로 분류되지 않음</td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>Dako</td><td>M3612</td><td>위험한 것으로 분류되지 않음</td></tr><tr><td>Renoir Red Andibody Diluent</td><td>Biocare 의료</td><td>PD904</td><td>이것은 Tris 기반 항체</td></tr><tr><td>DeCloaking Chamber</td>와 함께 작동하도록 특별히 설계되었습니다&nbsp;<td>Biocare Medical</td><td>Model DC2002</td> 압력솥 배리어 펜-Immuno Edge<td>를 사용하기 위한 일반적인 예방 조치를 취하십시오</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>변성 키트-용리 단계</td><td>Biocare 의료</td><td>DNS001H</td> 위험한 마하 2 염소 항 토끼 HRP 폴리머<td>로 분류되지 않음</td></tr><tr><td></td><td>Biocare 의료</td><td>RHRP520</td><td>위험한</td></tr><tr><td>마하 2 염소 안티 토끼 AP 폴리머</td><td>Biocare 의료</td><td>RALP525</td> 위험한 마하 2 염소 안티 마우스 HRP 폴리머<td></td></tr><tr><td></td><td>로 분류되지 않음Biocare Medical</td><td>M3M530</td><td>유해로 분류되지 않음</td></tr><tr><td>베타조이드 DAB 발색 키트</td><td>Biocare Medical</td><td>BDB2004</td><td>1. DAB는 발암물질로 의심되는 것으로 알려져 있습니다. 2. DAB 구성 요소를 강한 빛이나 직사광선에 노출시키지 마십시오. 3. 적절한 개인 보호 장비와 의복을 착용하십시오. 4. DAB는 피부 과민성을 유발할 수 있습니다. 피부와 눈의 접촉을 피하십시오. 5. 폐기에 관한 모든 연방, 주 및 지역 환경을 준수</td></tr>하십시오 <tr><td>Warp Red Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>WR806</td><td>Corrosive. 피부 자극이나 눈 손상을 유발할 수 있는 산.</td></tr><tr><td>Vina Green Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>BRR807</td><td>삼키면 유해</td></tr>한 <tr><td>Bajoran Purple Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>BJP807</td><td>가연성 액체. 열, 화염 및 스파크로부터 멀리 보관하십시오. 섭취 또는 흡수로 인해 유해합니다. 피부나 눈과의 접촉을 피하고 흡입을 피하십시오.</td></tr><tr><td>고양이 Hematoxylin</td><td>Biocare Medical</td><td>CATHE</td><td>보라색 &nbsp; 솔루션 &nbsp; 와 함께 &nbsp; ᅡ &nbsp; 마일드 &nbsp; 아세트산 &nbsp; 산성 &nbsp; (식초) &nbsp; 향기. &nbsp; 5월 &nbsp; be &nbsp; 짜증나는 &nbsp; 에 &nbsp; 피부 &nbsp; 또는 &nbsp; 이목구비. &nbsp; 피하십시오 &nbsp; 연락처 &nbsp; 와 함께 &nbsp; 피부 &nbsp; 그리고 &nbsp; 이목구비. &nbsp; 피하십시오 &nbsp; 음식물 섭취.</td></tr><tr><td>XYL 마운팅 미디어</td><td>Richard Allen</td><td>8312-4</td><td>NFPA 등급: 건강 &ndash; 2, 화재 &ndash; 3 , 반응성 &ndash; 0</td></tr><tr><td>1.5 커버슬립</td><td>Fisher 브랜드</td><td>22266858</td><td>날카로운 가장자리</td></tr><tr><td>배양 (습도)챔버</td><td>구식 구</td><td>식</td><td>여러 공급업체 사용 가능</td></tr><tr><td>대류 오븐</td><td>안정성- Therm</td><td>C-4008-Q</td><td></td></tr><tr><td>배경 퍼니셔 차단 시약</td><td>Biocare Medical</td><td>BP974</td><td>이 제품은 위험으로 분류되지 않았습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>inForm 소프트웨어</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS135781</td><td>원고에 사용되는 기본 다중 스펙트럼 이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>Nuance 소프트웨어</td><td>PerkinElmer</td><td>Nuance EX</td><td>원고 내에서 스펙트럼 라이브러리를 만드는 데 사용되는 소프트웨어</td></tr><tr><td>Vectra 현미경 및 슬라이드 스캐너</td><td>PerkinElmer</td><td>VECTRA</td><td>IM3 이미지 큐브를 얻기 위한 자동 슬라이드 스캐너 및 현미경</td></tr></tbody></table>

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry는 조직 내 단백질 발현 및 국소화를 조사하기 위해 일반적으로 사용되는 임상 및 연구 실험실 검출 기술입니다. 면역조직화학을 사용하여 발현을 채점하기 위해 많은 반정량적 시스템이 개발되었지만, 내재된 주관성으로 인해 결과의 재현성과 정확성이 제한됩니다. 또한, 핵 전사 인자(nuclear transcription factor)와 같이 공간적으로 중복되는 바이오마커에 대한 조사는 현재의 면역조직화학 기술로는 어렵습니다. 당사는 다중 면역조직화학(multiplexed immunohistochemistry) 및 다중 스펙트럼 이미징(multispectral imaging)의 고처리량 방법을 사용하여 여러 단백질을 동시에 조사할 수 있는 시스템을 개발하고 최적화했습니다. 다중화된 면역조직화학은 1차 항체와 horseradish peroxidase 또는 alkaline phosphatase에 접합된 2차 항체를 순차적으로 적용하여 수행됩니다. 관심 있는 각 단백질을 검출하기 위해 다양한 발색체가 사용됩니다. 염색된 슬라이드는 자동화된 슬라이드 스캐너에 로드되고 자동화된 이미지 획득을 위한 프로토콜이 생성됩니다. 스펙트럼 라이브러리는 각각에 단일 발색체가 있는 슬라이드 세트를 염색하여 생성됩니다. 대표적인 염색 이미지의 하위 집합을 멀티 스펙트럼 이미징 소프트웨어로 가져오고 이미지에서 조직 구획을 정의하여 조직 유형을 구별하는 알고리즘을 만듭니다. 세포 내 구획은 hematoxylin counterstain을 사용하고 intrinsic algorithm을 조정하여 세분화됩니다. 양성 및 단백질 공동 국소화를 결정하기 위해 임계값이 적용됩니다. 그런 다음 최종 알고리즘이 전체 조직 세트에 적용됩니다. 결과 데이터를 통해 사용자는 조직 유형(예: 상피 대 기질) 및 세포 내 구획(핵 대 세포질 대 원형질막)을 기반으로 단백질 발현을 평가할 수 있습니다. 공동 국소화 분석을 통해 이중 양성, 이중 음성 및 단일 양성 세포 유형을 조사할 수 있습니다. 다중 스펙트럼 이미징과 다중 면역조직화학 및 자동 이미지 획득을 결합하는 것은 조직 내 바이오마커를 조사하기 위한 객관적이고 처리량이 많은 방법입니다.

도 1에서, 트레이닝이 아닌 조직 함과 함께, 상피 및 간질 부분으로 분할 이미지 전립선 조직에 대해 수행된다. 상피 막 마커 E-cadherin의를 사용하여 세포 분할이도 2에 도시 된 핵, 세포질 및 막 부분을 분리 하였다. 한 실험에서는도 3에 도시 한 바와 같이, AR, ERα, E 헤린 및 CD147의 발현 및 위치 파악을 조사 다중화 IHC를 사용 하였다. 이러한 기술을 사용하여, 우리는 ERα 모두 핵 발현 양성 세포를 식별 할 수있다 AR (그림 3B - 3C)도 3a에 녹색 화살표와 같이 비색 신호를 중첩에도 불구하고. 우리는 홍보의 다른 상태에서 더블 긍정적 인 ...

Immunohistochemistry는 조직 내 단백질 국소화 및 발현을 평가하기 위한 강력한 실험실 기술입니다. 현재의 반자동 정량 분석 방법은 주관성을 도입하고 종종 재현성 없는 결과를 생성합니다. 여기에서는 다중 스펙트럼 이미징을 사용하여 multiplexed immunohistochemistry 및 단백질 발현 및 공동 국소화의 객관적인 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

이 방법의 전반적인 목표는 다중 스펙트럼 이미징을 사용하여 단백질 발현과 공국소화(co-localization)를 객관적으로 정량화하는 것입니다. 이 방법은 치료 후 또는 질병 진행 과정에서 단백질의 발현과 국소화가 어떻게 변화하는지와 같이 기초 연구 및 진단 병리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존 정량화 방법에 내재된 분석자의 주관성을 제거한다는 점입니다.정량 분석 프로세스를 시작하려면, 개별 발색제로 염색된 기존의 대조 슬라이드와 헤마톡실린 염색 슬라이드를 이용하여 스펙트럼 라이브러리를 구축하기 위해 다중 분광 이미징 소프트웨어를 엽니다. 다음으로, 대조 슬라이드에서 획득한 이미지 큐브를 열고, 발색제를 광학적으로 정의하기 위해 양성으로 염색된 영역을 4~5곳 선택합니다. 모든 발색제를 나타내는 완전한 스펙트럼 라이브러리가 생성될 때까지 다른 대조 슬라이드의 이미지 큐브에 대해 이 단계를 반복한 후, 스펙트럼 라이브러리를 저장합니다.이미지 포맷 옵션에서 Multispectral 또는 im3를 선택하고, 샘플 포맷에서 Brightfield를 선택하여 다중 스펙트럼 이미징 소프트웨어 내에서 새 프로젝트를 시작합니다. segment tissue, find features, phenotyping, score 및 export를 선택하여 프로젝트를 구성합니다. 필요한 경우, 분석 시간을 단축하기 위해 이미지 해상도를 변경하십시오.이전에 생성한 스펙트럼 라이브러리를 가져오고 분석에 포함할 모든 발색제를 선택하십시오. Open Image Cube 옵션을 선택하여 훈련 데이터 세트에 포함할 이미지 큐브를 엽니다. 훈련 정확도를 보장하기 위해 분석할 전체 이미지 수의 최소 18%를 선택하십시오.다음으로, 이미지 훈련 세트를 선택합니다. 세그멘테이션 정확도를 높이기 위해 모든 질병 상태를 나타내는 이미지를 선택하십시오. 이 단계에서 편향이 발생하는 것을 방지하려면 훈련 세트에 충분한 양의 음성 염색 이미지를 포함하십시오.스포이드 도구를 선택하고 이미지 내의 흰색 영역을 지정하여 학습 세트 이미지의 화이트 밸런스를 조정합니다. 다음 버튼을 선택하여 조직 분할 단계로 이동합니다. 그런 다음 조직 범주 패널을 사용하여 분석할 조직 유형을 선택하십시오. 더 정확한 단백질 조직 국소화를 위해 조직 범주 선택 기능을 사용할 수 있습니다.펜 도구를 사용하여 훈련 이미지 내의 세포 그룹 주변을 그려 알고리즘을 생성하고 조직 범주를 정의하기 시작하십시오. 한 가지 조직 범주에 대한 작업이 완료되면 다른 조직 범주에 대해 이 단계를 반복하십시오. 이미지 내에서 해당 조직 범주 유형의 특징을 나타내는 세포 그룹을 선택해야 합니다.조직 세그멘터(tissue segmenter) 학습에 포함할 구성 요소를 선택하십시오. 조직 세그멘터를 학습시키기에 적절한 패턴 스케일을 선택하십시오. 그런 다음 학습된 조직 세그멘터 버튼을 선택하십시오.적절하게 분류된 훈련 영역 내 픽셀 비율의 정확도를 표시하는 팝업 창을 확인하십시오. 'segment images'를 클릭하여 전체 훈련 이미지 세트를 분할하십시오. 완료되면 훈련 세트를 검토하여 현재 훈련 알고리즘으로 잘못 분류된 조직이 있는지 확인하십시오.조직 분할 알고리즘 결과가 확실하면 advance 버튼을 선택하십시오. 세포질 및/또는 막을 선택하려면 먼저 핵이 선택되어 있는지 확인하십시오. nuclei 탭을 선택하고 핵 분할에 적절한 설정을 선택하십시오.그런 다음 개별 조직 범주 또는 모든 조직 범주를 분할에 포함할지 선택하십시오. 좋은 결과를 얻기 위한 간편한 방법으로는 카운터스테인 객체 기반 임계값 접근법을 선택하십시오. 다음으로, 신뢰할 수 있는 핵 카운터스테인을 사용하여 객체 기반 임계값 접근법을 선택하십시오.cytoplasm 탭을 선택하여 세포질 형태 매개변수를 선택하십시오. 다음으로, 핵까지의 외부 거리를 선택하십시오. 그런 다음 최소 크기를 선택하십시오.기본, 보조 및 3차 옵션을 보조 옵션으로 설정하여 다음 옵션 구성 요소를 선택하십시오. 막(membrane) 탭으로 이동하십시오. 사용된 막 특이적 마커에 대해 첫 번째 항목을 선택하십시오.전체 스케일 광학 밀도(OD)를 조정하여 세포막의 각 마커에 대한 최소 임계값 또는 양성을 설정하십시오. membrane 탭에서 계속하여 최대 세포 크기를 선택하십시오. 모든 옵션을 선택한 후 segment all을 선택하십시오.이미지에 설정을 적용하고 관찰하십시오. 'advance'를 선택하여 IHC 점수 산정 단계로 이동한 다음, 점수를 산정할 조직 범주를 선택하십시오. 원하는 점수 산정 유형을 선택하고, 점수 산정 분석에 사용할 세포 구획을 선택하십시오.다음으로, 구성 요소 데이터 보기(view component data)를 선택하고 훈련 이미지 위에 커서를 이동하여 관심 구성 요소의 양성 세포에 대한 적절한 염색 광학 밀도 최소 임계값을 찾습니다. 조직 분할, 세포 분할 및 점수 산출 값을 통해 생성된 알고리즘을 테스트하기 위해 훈련 세트의 데이터를 내보내십시오. 안내 메시지에 따라 내보내기 디렉토리를 위한 새 폴더를 생성합니다. 분석에 포함하여 생성할 이미지와 표를 선택하십시오.다음으로 '모두 내보내기'를 선택하여 분석을 수행하십시오. 분석이 완료되면, 설정의 정확성을 평가하기 위해 염색 강도가 높은 이미지와 낮은 이미지 모두에서 세포 분할 및 점수 산정 데이터를 확인하십시오. 설정이 만족스러우면 배치 분석 탭을 클릭하여 알고리즘을 활성 프로젝트로 복사하십시오.그런 다음 새로운 내보내기 디렉터리를 선택하고 분석에 포함할 이미지와 표를 선택합니다. 입력 파일 옵션에서 배치 분석에 포함할 모든 이미지를 선택하십시오. 실행 옵션을 선택하여 분석을 수행합니다.완료되면 리뷰 병합(review merge) 탭으로 이동합니다. '모두 포함(include all)'을 선택하고 '병합(merge)'을 선택하여 분석을 위한 요약 데이터가 포함된 데이터 시트를 생성합니다. 전립선 조직을 대상으로 훈련을 수행하여 이미지를 상피 및 기질 부분으로 분할하였습니다.비조직 구획과 함께 사용되었습니다. 전체 이미지 세트의 조직 유형 및 질환 상태를 나타내는 일련의 학습 이미지가 다분광 이미지 소프트웨어로 가져와졌습니다. 기질, 상피 및 비조직을 포함하는 조직 범주가 생성되었으며, 학습 이미지 위에 직접 그림을 그려 각 범주를 정의하였습니다.조직 분할을 위한 알고리즘을 생성하여 학습 이미지 세트에 적용하였습니다. 이를 통해 조직을 정확하게 분할하였습니다. 다중 면역조직화학 기법을 사용하여, 색상 및 메트릭 신호의 중첩에도 불구하고 ER-alpha의 핵 발현이 붉은색으로 나타나는 양성 세포와 AR이 갈색으로 나타나는 양성 세포를 식별하였습니다. CD-147의 세포막 특이적 발현은 검은색으로 나타나는 E-cadherin을 마커 단백질로 사용하여 정량화하였습니다.이 영상을 시청한 후에는 파라핀 매립 조직에서 단백질 발현과 공동 국소화(co-localization)를 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

quantitation-protein-expression-co-localization-using-multiplexed

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

복잡한 조직 대중은 장기에서 종양, 다양한 세포 요소로 구성되어있다. 우리는 세포의 기원뿐만 아니라 단백질 발현에 따라 세포의 특성을 해독 스펙트럼 unmixing 다음 다중 매개 면역 형광 염색과 함께 멀티 라벨 형광 형질 전환 마우스를 이용한 조직 내에서 세포의 표현형의 기여를 밝혀.

세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

여기 우리는 다중 형광 immunohistochemical 얼룩 및 여러 암 관련 항 림프 종에서의 동시 지역화에 대 한 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 섹션에서 생체의 colocalization 분석을 확장할 수 있습니다.

멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석

여기에서는, 우리는 포르말린 고정된 파라핀 내장된 종양 조직 단면도에 있는 면역 세포를 구상하고, 정량화하고, 매핑하기 위한 간단하고 접근가능한 전략을 기술합니다. 이 방법론은 기존의 이미징 및 디지털 분석 기법과 이미징 분석의 다중 분석 기능 및 다중 매개 변수 분석을 확장하는 목적으로 결합합니다.

종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

다중화 바코드 이미지 분석은 최근 종양 미세 환경의 특성을 개선하여 세포 구성, 기능 상태 및 세포-세포 상호 작용에 대한 포괄적인 연구를 가능하게 했습니다. 본 명세서에서는 올리고뉴클레오티드 접합 항체의 바코딩을 사용하는 염색 및 이미징 프로토콜과 고차원 이미지 분석 기술을 사용할 수 있는 사이클 이미징을 설명합니다.

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

이 기사에서는 이미지 분석 및 공간 분석과 결합된 수동 티라마이드 신호 증폭(TSA) 다중 면역형광(mIF)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 슬라이드 스캐너에 따라 슬라이드당 2-6개의 항원을 염색하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 섹션과 함께 사용할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

이 실험 프로토콜은 주로 단일 채널 항체 배양 조건을 최적화하고 항체 및 채널의 설정을 조정하여 임상 기원 폐암 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결함으로써 다중 면역조직화학(IHC) 염색 방법을 설명하고 최적화합니다.

파라핀 포매된 폐암 조직을 위한 다중 면역조직화학 염색

이 보고서는 자동 슬라이드 염색기에서 다중 면역형광(mIF) 분석을 위한 자동 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 표준 고처리량 조직 자동염색기 및 전체 슬라이드 형광 이미저에서 공간 단백질체학의 높은 재현성을 보여주며, 이는 중개 연구에서 많은 수의 조직 슬라이드에 걸친 맞춤형 mIF 분석에 이상적입니다.

중개 연구를 위한 High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assay

이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 절편에서 단백질 이미징 질량 세포 분석을 통한 다중 mRNA 검출 방법론을 자세히 설명합니다.

이중 양식 분자 지도 제작: 다중 mRNA 검출과 단백질 이미징 질량 세포 분석의 통합

학습하세요 멀티플렉스 면역조직화학법과 다중스펙트럼 영상을 활용하여 단백질 발현 및 공동현지화를 객관적으로 정량화하는 방법을. 이 기술은 연산자 주관성을 제거하여 재현성 있는 결과를 제공합니다.

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

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