멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

이 방법의 전반적인 목표는 다중 스펙트럼 이미징을 사용하여 단백질 발현 및 공동 국소화를 객관적으로 정량화하는 것입니다. 이 방법은 치료 후 또는 질병 진행에서 단백질이 발현 및 국소화를 어떻게 변화시키는지와 같은 기초 연구 및 진단 병리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존 정량화 방법에 내재된 연산자 주관성을 제거한다는 것입니다.

정량화 프로세스를 시작하려면 다중 스펙트럼 이미징 소프트웨어를 열어 개별 발색체로 염색된 이전에 준비된 대조군 슬라이드와 헤마톡실린 염색 슬라이드에서 스펙트럼 라이브러리를 구축합니다. 다음으로, 대조군 슬라이드에서 획득한 이미지 큐브를 열고 4-5개의 양성 염색 영역을 선택하여 발색체를 광학적으로 정의합니다. 모든 발색체를 나타내는 완전한 스펙트럼 라이브러리가 생성될 때까지 다른 제어 슬라이드의 이미지 큐브를 사용하여 단계를 반복한 다음 스펙트럼 라이브러리를 저장합니다.

영상 형식 옵션으로 Multispectral 또는 im3를 선택하고 샘플 형식으로 Brightfield를 선택하여 다중스펙트럼 이미징 소프트웨어 내에서 새 프로젝트를 시작합니다. segment tissue, find features, phenotyping, score 및 export를 선택하여 프로젝트를 구성합니다. 원하는 경우 이미지 해상도를 변경하여 해석 시간을 단축합니다.

이전에 생성된 스펙트럼 라이브러리를 가져오고 분석에 포함할 모든 발색체를 선택합니다. 이미지 큐브 열기(Open Image Cube) 옵션을 선택하여 학습 데이터 세트에 포함할 이미지 큐브를 엽니다. 교육의 정확성을 보장하기 위해 분석할 총 이미지 수의 18% 이상을 선택합니다.

다음으로, 이미지의 훈련 세트를 선택합니다. 세분화 정확도를 높이기 위해 모든 질병 상태를 나타내는 이미지. 이 단계에서 편향을 방지하기 위해 학습 세트에 풍부한 네거티브 염색 이미지를 포함합니다.

화이트 밸런스는 스포이드 도구를 선택하고 한 이미지에서 흰색인 영역을 선택하여 트레이닝 세트의 이미지 균형을 맞춥니다. 고급 단추를 선택하여 조직 분할을 이동합니다. 그런 다음 조직 범주 패널을 사용하여 보다 정확한 단백질 조직 국소화를 위해 분석할 조직 유형을 선택하고 조직 범주를 사용할 수 있습니다.

알고리즘을 만들고 펜 도구를 사용하여 조직 범주를 정의하고 훈련 이미지 내에서 세포 그룹을 그리기 시작합니다. 한 조직 범주로 작업을 마쳤으면 다른 조직 범주에 대해 단계를 반복합니다. 조직 범주 유형의 특징인 이미지 내의 세포 그룹을 선택해야 합니다.

조직 세분화자를 위한 교육에 포함할 구성 요소를 선택합니다. 조직 세분화자를 훈련시키기 위한 적절한 패턴 스케일을 선택합니다. 그런 다음 훈련된 조직 세분화 버튼을 선택합니다.

적절하게 분류된 훈련 영역 내에서 픽셀 비율의 정확도를 표시하는 팝업 상자를 관찰하십시오. 세그먼트 이미지를 클릭하여 전체 훈련 이미지 세트를 분할합니다. 완료되면 훈련 세트를 검토하여 현재 훈련 알고리즘으로 잘못 분류된 조직을 찾습니다.

조직 분할 알고리즘 결과에 확신이 들면 진행 버튼을 선택합니다. 세포질 및/또는 멤브레인을 선택하기 위해 핵이 이미 선택되어 있는지 확인합니다. 핵 탭을 선택하고 핵 분할에 적합한 설정을 선택합니다.

그런 다음 개별 또는 모든 조직 범주를 세분화에 포함할지 여부를 선택합니다. 좋은 결과를 얻기 위해 단순화된 방법을 위해 counterstain object based threshold 접근법을 선택하십시오. 다음으로, 신뢰할 수 있는 핵 카운터스테인에 대한 객체 기반 임계값 접근법을 선택합니다.

cytoplasm 탭을 선택하여 cytoplasm 모양의 파라미터를 선택합니다. 다음으로, 핵까지의 외부 거리를 선택합니다. 그런 다음 최소 크기를 선택합니다.

1차, 2차가 있는 다음 옵션 구성 요소를 선택하고 2차 옵션으로 3차 옵션을 선택합니다. 멤브레인 탭으로 이동합니다. 사용된 멤브레인 특이적 마커에 대해 먼저 선택합니다.

전체 스케일 광학 밀도 또는 OD를 조정하여 세포막의 각 마커에 대한 최소 임계값 또는 양성을 찾습니다. 계속해서 멤브레인 탭에서 최대 셀 크기를 선택합니다. 모든 옵션을 선택한 후 모두 세그먼트를 선택합니다.

이미지에 설정을 적용하고 관찰합니다. advance(고급)를 선택하여 IHC 점수 단계로 이동하고 점수를 매길 조직 범주를 선택합니다. 원하는 스코어링 유형을 선택하고 스코어링 분석에 사용할 셀 구획을 선택합니다.

다음으로, view component data(구성 요소 데이터 보기)를 선택하고 커서를 트레이닝 이미지 위로 이동하여 관심 구성 요소에 대한 양성 세포에 대한 적절한 광학 밀도 최소 염색 임계값을 찾습니다. 조직 세분화, 세포 세분화 및 점수 값을 통해 생성된 알고리즘을 테스트하기 위해 교육 세트에 대한 데이터를 내보내고, 프롬프트에 따라 내보내기 디렉토리에 대한 새 폴더를 만듭니다. 생성하고 분석에 포함할 이미지와 테이블을 선택합니다.

다음으로, Export for all(모두에 대한 내보내기)을 선택하여 분석을 수행합니다. 분석이 완료되면 염색이 높은 이미지와 낮은 염색이 모두 있는 이미지에 대한 세포 세분화 및 점수 매기기 데이터를 보고 설정의 정확도를 평가합니다. 설정이 만족스러우면 배치 분석 탭을 클릭하여 알고리즘을 활성 프로젝트에 복사합니다.

그런 다음 새 내보내기 디렉토리를 선택하고 분석에 포함할 이미지와 테이블을 선택합니다. 입력 파일 옵션에서 배치 분석에 포함할 모든 이미지를 선택합니다. 실행 옵션을 선택하여 해석을 수행합니다.

완료되면 검토 병합 탭으로 이동합니다. 모두 포함을 선택하고 병합을 선택하여 분석을 위한 요약 데이터가 있는 데이터 시트를 만듭니다. 전립선 조직에 대해 이미지를 상피 부분과 기질 부분으로 분할하기 위한 훈련을 수행했습니다.

비조직 수납공간과 함께. 일련의 훈련 이미지를 전체 이미지 세트의 조직 유형과 질병 상태를 나타내는 멀티 스펙트럼 이미징 소프트웨어로 가져왔습니다. stroma, epithelia 및 non-tissue를 포함하는 조직 범주가 생성되었으며 범주는 훈련 이미지 위에 수동으로 그려서 정의되었습니다.

조직 분할을 위한 알고리즘이 생성되어 이미지 훈련 세트에 적용되었습니다. 조직을 정확하게 분할합니다. 다중 면역조직화학 기법을 사용하여 색상 및 미터법 신호가 겹치더라도 빨간색으로 보이는 ER-알파와 갈색으로 보이는 AR의 핵 발현에 양성인 세포를 식별했으며, CD-147의 세포막 특이적 발현은 검은색으로 보이는 E-캐서린을 마커 단백질로 사용하여 정량화했습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 단백질 발현 및 공동 국소화를 정량화하고, 파라핀 내장 조직에 대한 정보를 제공하고, 수정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.