Name: 쥐 좌골 신경에서 Axoplasm 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: 학습하세요 쥐 좌골 신경에서 축살질을 분리하는 방법을. 저삼투액 처리와 원심분리를 통해 순수한 축살 성분을 얻어 신경생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 프로토콜은 glial 및 혈관 조직 오염의 최소화와 axoplasm 고립 수 있습니다. 방법은 하나의 80~10주 이전 위스타 랫 약 70-100 μg 총 axoplasm 단백질을 산출. 1. 좌골 신경을 해부하다 <ol><li> 자궁 경부 전위 다음 CO 2 흡입하여 두 쥐를 안락사. 처음의 해부하기 전에 심장 박동의 부족에 대한 촉진에 의해 죽음을 확인합니다. </li><li> 면봉 70 % 에탄올로 절개 지역. </li><li> 피부, 별도의 근육을 잘라 손상 혈관 않고 신중하게 가위와 집게를 사용하여 좌골 신경을 분리. 모두 좌골 신경 (약 1.5 cm 각) 각각의 동물에서 500 μL PBS 0.2X + 억제제와 eppendorf의 네 명 모두 신경을 수집, 얼음에 보관 해부하다. </li><li> PBS 0.2X + 프로 테아제 억제제의 최소한 2 ML를 포함하는 플라스틱 요리에 신경 세그먼트를 전송합니다. </li><li> 쌍안경 현미경 미세 집게를 사용하여 신경의 epineurium를 제거합니다. 그들은 흐린가 될 때까지 아주 조심스럽게 fascicles를 분리 및 솔루션의 표면에 떠을 시작합니다. 그것이 (신경 회 이상 10 분 복용하지 않음) 신속하고 정확하게 수행할 수있을 때까지이 단계는 연습을해야합니다. </li></ol> 2. 부화, 세척 및 용출 <ol><li> 전송 실온에서 2 시간을위한 인큐베이션에 대한 단백 분해 효소 억제제를 포함하는 PBS 0.2X 500 μL와 신선한 eppendorf 튜브에 fascicles 분리. </li><li> eppendorf 튜브에서 eppendorf 튜브에 fascicles을 전송 전송 후 5 분 흔들어하여 동일한 버퍼 1 ML 최소한 3 번 씻으십시오. </li><li> 유체 초과 제거하는 것은 새로운 빈 eppendorf 튜브에 fascicles를 넣고 다음 RT에서 20-30 분 배양을위한 테아제 억제제를 포함하는 PBS 1X 300 μL와 새로운 eppendorf 튜브에 fascicles을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 4 만 XG에서 10 분 원심 분리기 ° C. </li><li> 뜨는 및 측정 단백질 농도를 가져가라. 이것은 axoplasm 준비입니다. </li></ol> 3. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 이 프로토콜과 같이 절연 axoplasm 샘플과 설명서를 쥐어 짜기 방법으로 절연 서양 얼룩 비교 axoplasm. 각각 혈액 단백질과 glial 세포 contaminations를 대표하는 알부민 및 GFAP의 감소 수준을합니다. 대조적으로, axonal tubulin B3는 axonal 단백질의 높은 수준을 나타내는이 준비 풍부합니다.

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

생화학 및 proteomic 분석 기계 쥐어 짜기 1 axoplasm 절연 이전에 설명한 방법에 비해이 절차는 혈청과 glial 세포 오염 3 감소 것으로 확인되었습니다. 우리는 좌골 신경 손상이 후 dynein 기반 역행 신호를 탐험하고 축삭 - glia 상호 작용 4를 포함한 성인 말초 신경 여러 프로세스의 탐사에 유틸리티를 기대이 axoplasm 격리 프로토콜을 사용하고 있습니다.

<ul><li> 남성 위스타 쥐 (80-10주 세) </li><li> 50 ML 당 단백 분해 효소 억제제 (Roshe) 2 타블렛을 포함하는 PBS 0.2X와 PBS 1X 솔루션 </li><li> 1.5 ML에 대한 Eppendorfs </li><li> 플라스틱 접시에게 35mm를 살균 </li><li> 가위와 고급 집게 포함 해부 도구 </li><li> 쌍안경과 테이블 조명 </li></ul> 항체 마우스 방지 GFAP 클론 GA - 5 시그마 (G6171)에서했습니다. 토끼 방지 알부민은 시더 레인 (CLAG5140)에서했습니다. 마우스 방지 Tubulin의 β3와 토끼 방지 gERK은 시그마 (T2200 각각 M5670)에서 있었다.

쥐 좌골 신경에서 axoplasm 격리

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

주변 신경에서 순수 axonal 세포질 (axoplasm)의 분리는 많은 생물 학적 과정의 생화 학적 연구를 위해 매우 중요합니다. 이 문서에서는, 우리는 입증하고 다음 단계에 따라 성인 쥐의 좌골 신경에서 axoplasm 고립에 대한 프로토콜을 설명 : 신경 fascicles 및 결합 조직의 분리 (1) 절개를, hypotonic 매체 신경 fascicles의 짧은 세그먼트 (2) 인큐베이션 myelin을 릴리스 및 비 axonal 구조를 lyse을하며, (3) 남아있는 축삭 - 풍부한 자료의 추출. 이 준비 Proteomic 및 생화 학적 특성은 axonal 구성 요소에 대한 농축 높은 학위를 확인했습니다.

우리는 myelin를 공개하고 나머지 축삭 - 풍부한 자료의 추출 다음 비 axonal 구조를 lyse에 hypotonic 매체 신경 fascicles과 부화 해부에 따라 성인 쥐의 좌골 신경에서 axoplasm 절연을위한 프로토콜을 보여줍니다.

쥐 좌골 신경에서 Axoplasm 격리

말초 신경으로부터 순수한 축삭 세포질(축삭질)을 분리하는 것은 많은 생물학적 과정의 생화학적 연구에 매우 중요합니다. 본 논문에서 저희는...

이 절차의 전반적인 목표는 말초 신경에서 순수한 축삭 세포질 또는 외세포질을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 좌골 신경을 박리함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 신경에서 결합 조직을 제거하고 슬리브(sleeves)를 분리하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 저장성 배지에서 짧은 신경 섬유 절편을 배양하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 등장성 용액에서의 배양, 원심 분리 및 삼투압 평형화입니다. 최종적으로, 웨스턴 블롯 분석을 통해 축삭 성분이 고도로 농축되었음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 제 이름은 Elle Rosenbaum입니다. 저희는 Institute of Science 생물화학과의 Mike F Labor 교수님 연구실 소속입니다. 오늘은 Oxy Opat Mesylation이라는 새로운 기술을 소개해 드리겠습니다.말초 신경의 수동 압착 OIS와 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은, 이 절차가 축삭 내용물에 도달하는 혈청 및 신경초 오염을 줄여준다는 점입니다. 저희는 좌골 신경 손상 후 D 기반 역행성 신호를 탐구하기 위해 op PLAs 메틸화에 이 새로운 기술을 사용하였습니다.이제 시작해 보겠습니다. 8~10주 된 안락사시킨 Wistar 랫드 두 마리 중 한 마리를 해부 매트 위에 옆으로 눕혀 좌골 신경(sciatic nerve)의 원위부에 직접 접근할 수 있도록 합니다. 허벅지 중간 부분의 피부를 제모하고 70% ethanol로 철저히 닦아냅니다.가위를 사용하여 허벅지 피부를 절개하여 제거합니다. 대퇴이두근과 표층둔근 사이의 지방 및 결합 조직을 주의 깊게 절개합니다. 포셉을 사용하여 노출된 좌골신경 부위를 들어 올려 제거합니다.제거된 부분의 길이는 약 1.5 centimeters가 됩니다. 신경을 프로테아제 억제제가 포함된 500 microliters의 얼음처럼 차가운 2X PBS가 담긴 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.쥐의 반대편과 두 번째 쥐의 양쪽 모두에 대해 해부 절차를 반복합니다. 파스퇴르 피펫으로 페트리 접시 바닥을 긁어준 뒤, 상온의 2 mL 2X PBS(단백질 분해 효소 억제제 포함)를 채웁니다.해부 현미경 하에서 신경 한 가닥을 디쉬로 옮깁니다. 미세 핀셋을 사용하여 신경에서 신경외막을 당겨 제거하고 폐기하며, 신경다발(fascicles)만 디쉬에 남깁니다. 각 신경다발을 서로 및 디쉬 바닥으로부터 조심스럽게 분리합니다.개별 펠렛이 뿌옇게 변하며 용액 표면으로 떠오릅니다. 분리된 펠렛을 프로테아제 억제제가 포함된 500 µL의 0.2 X PBS가 담긴 마이크로 원심분리 튜브로 즉시 옮깁니다. 펠렛을 얼음 위에 보관하십시오.숙련된 솜씨로 튜브 내의 남은 좌골신경에서 sles를 분리하여 수집하십시오. 신경외막을 제거하고 sles를 분리하는 과정은 신경당 10분 이내에 완료되어야 합니다.분리된 SLES가 들어 있는 튜브를 얼음에서 꺼냅니다. 수초 및 비축삭 구조물을 제거하기 위해 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 각 세척 단계마다 sles를 세척합니다.포셉을 사용하여 sles를 조심스럽게 들어 올려 프로테아제 억제제가 포함된 2X PB s 1 mL가 들어 있는 새 튜브로 옮깁니다. 로커에서 튜브를 5분 동안 흔들어 줍니다. 세척 후 이러한 방식으로 SLES를 세 번 더 세척합니다.과잉 액체를 제거하기 위해 SLES를 새로운 빈 Eppendorf 튜브로 옮긴 후, 단백질 분해 효소 억제제가 포함된 1X PBS 300 µL가 들어 있는 튜브로 옮겨 상온에서 20~30분 동안 배양합니다. opsm을 용출할 때 높은 염 농도는 후속 프로테오믹스 절차를 방해합니다. 조직 및 세포 파편을 침전시키기 위해 4 °C에서 10,000 ×g로 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 깨끗한 Eppendorf 튜브로 파이펫팅하여 옮깁니다.얻어진 상층액은 투명해야 합니다. 분광광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하십시오.200~250 µg의 단백질 수율을 얻어야 합니다. 준비된 혈장 시료를 소분하여 -80 °C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. 해동 및 냉동의 반복을 피하십시오.수동 압착법으로 분리한 op plasm와 본 프로토콜에 따라 분리한 opsm 샘플을 비교한 웨스턴 블롯 결과입니다. 혈액 단백질과 글리아 세포 오염을 각각 나타내는 albumin 및 GFAP의 수준이 감소한 것에 주목하십시오. 이와 대조적으로, 본 조제물에서는 axonal tubulin beta three가 농축되어 있어 축삭 단백질 수준이 높음을 알 수 있습니다.이 영상을 모두 시청하신 후에는 좌골 신경을 절개하고 Paco를 적절하게 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

axoplasm-isolation-from-rat-sciatic-nerve

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

수술의 단순하고 강력한 행동 결과로 인해 좌골 신경의 만성적인 수축이 neuropathic 고통의 사전 저명한 동물 모델 중 하나입니다. 수술에 따라 24 시간 내에 통증 과민성 설립되고 양적 폰 프라이 aesthesiometer (기계적 시험)과 발바닥 진통제 측정기 (온도 시험)를 사용하여 측정할 수있다.

좌골 신경 및 쥐의 통증 과민성 시험의 만성 수축

이 비디오는 쥐의 척추 뿌리에서 슈반 세포의 격리 및 배양에 대해 설명합니다. 그런 다음 분리된 세포를 특정 배지에서 배양합니다. 슈반(Schwann) 세포는 차등 분해(differential digestion) 및 부착(adélection)을 통해 분리됩니다. 그 후 부착 및 증식을 위해 세포외 기질로 코팅된 커버슬립으로 전달됩니다.

쥐 척추근에서 Schwann 세포의 분리

이 비디오는 쥐의 좌골 신경 섬유에서 슈반 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

마우스 좌골 신경에서 슈반 세포의 자기 분리

이 비디오는 쥐의 C 섬유 신경 전도에 대한 단일 섬유 기록을 보여줍니다. 마취된 쥐는 하지에 감각 및 운동 공급을 제공하는 좌골 신경을 노출시키기 위해 절개됩니다. 그런 다음 개별 C-섬유가 노출됩니다. 발에 이식된 자극 전극을 사용하여 전기 자극이 제공되며, 단일 신경 섬유에서 반응이 기록됩니다.

쥐에서 좌골 신경 C-섬유의 생체 내 단일 섬유 기록

여기에서는 설치류 좌골 신경의 슈반 세포(SC)로 유전자를 전달하는 생체 내 기술을 제시합니다. 이 간단한 기술은 수초성 SC의 발달 및 유지와 관련된 신호 전달 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다.

Electroporation에 의해 쥐 좌골 신경의 슈반 세포로 생체 내 유전자 전달에

여기에서는 척수의 수압압출과 동일한 설치류에서 특정 등뿌리 신경절(DRG)의 식별 및 격리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 표준 척수 분리 방법과 비교하여 이 방법은 훨씬 빠르고 조직 손상 위험을 줄입니다.

설치류의 등쪽 뿌리 신경절의 척수 및 절연의 유압 압출

단일 섬유 기록은 중추 및 말초 신경계에 적용할 수 있는 효과적인 전기 생리학적 기술입니다. 부착 된 동골 신경과 함께 손상되지 않은 DRG의 준비와 함께 전도 실패의 메커니즘을 검사합니다. 두 프로토콜 모두 말초 신경계의 통증과의 관계에 대한 이해를 향상시킵니다.

전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용

이 방법은 쥐 내측 위트로테미에미근 근육의 3가지 유형의 모터 단위로 트위치 및 파탄 수축 및 작용 잠재력을 기록할 수 있게 한다. 단일 모터 장치의 기능적 절연은 축축의 전기 자극에 의해 유도된다.

쥐 내측 위트로테미즘 근육의 단일 모터 단위의 기능적 격리

이 프로토콜은 생체외 전기생리학적 자극을 위한 래트 전체 좌골 신경 조직의 제조를 기술하고, 환경적으로 조절된, 두 구획, 관류 식염수 욕조에서 기록한다.

Ex Vivo 신경 생리학을위한 쥐 좌골 신경의 제조

후근 신경절과 슈반 세포의 공동 배양 시스템에서 말초 신경계의 수초화를 연구 할 수 있습니다. 이 모델은 말초 수초화를 관찰 및 정량화하고 미엘린 외피에 대한 관심 화합물의 효과를 연구할 수 있는 실험적 기회를 제공합니다.

쥐 등쪽 뿌리 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 시험관 내 수초화

학습하세요 쥐 좌골 신경에서 축살질을 분리하는 방법을. 저삼투액 처리와 원심분리를 통해 순수한 축살 성분을 얻어 신경생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

쥐 좌골 신경에서 Axoplasm 격리

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