Name: 쥐 좌골 신경에서 Axoplasm 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: 학습하세요 쥐 좌골 신경에서 축살질을 분리하는 방법을. 저삼투액 처리와 원심분리를 통해 순수한 축살 성분을 얻어 신경생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 프로토콜은 glial 및 혈관 조직 오염의 최소화와 axoplasm 고립 수 있습니다. 방법은 하나의 80~10주 이전 위스타 랫 약 70-100 μg 총 axoplasm 단백질을 산출. 1. 좌골 신경을 해부하다 <ol><li> 자궁 경부 전위 다음 CO 2 흡입하여 두 쥐를 안락사. 처음의 해부하기 전에 심장 박동의 부족에 대한 촉진에 의해 죽음을 확인합니다. </li><li> 면봉 70 % 에탄올로 절개 지역. </li><li> 피부, 별도의 근육을 잘라 손상 혈관 않고 신중하게 가위와 집게를 사용하여 좌골 신경을 분리. 모두 좌골 신경 (약 1.5 cm 각) 각각의 동물에서 500 μL PBS 0.2X + 억제제와 eppendorf의 네 명 모두 신경을 수집, 얼음에 보관 해부하다. </li><li> PBS 0.2X + 프로 테아제 억제제의 최소한 2 ML를 포함하는 플라스틱 요리에 신경 세그먼트를 전송합니다. </li><li> 쌍안경 현미경 미세 집게를 사용하여 신경의 epineurium를 제거합니다. 그들은 흐린가 될 때까지 아주 조심스럽게 fascicles를 분리 및 솔루션의 표면에 떠을 시작합니다. 그것이 (신경 회 이상 10 분 복용하지 않음) 신속하고 정확하게 수행할 수있을 때까지이 단계는 연습을해야합니다. </li></ol> 2. 부화, 세척 및 용출 <ol><li> 전송 실온에서 2 시간을위한 인큐베이션에 대한 단백 분해 효소 억제제를 포함하는 PBS 0.2X 500 μL와 신선한 eppendorf 튜브에 fascicles 분리. </li><li> eppendorf 튜브에서 eppendorf 튜브에 fascicles을 전송 전송 후 5 분 흔들어하여 동일한 버퍼 1 ML 최소한 3 번 씻으십시오. </li><li> 유체 초과 제거하는 것은 새로운 빈 eppendorf 튜브에 fascicles를 넣고 다음 RT에서 20-30 분 배양을위한 테아제 억제제를 포함하는 PBS 1X 300 μL와 새로운 eppendorf 튜브에 fascicles을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 4 만 XG에서 10 분 원심 분리기 ° C. </li><li> 뜨는 및 측정 단백질 농도를 가져가라. 이것은 axoplasm 준비입니다. </li></ol> 3. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 이 프로토콜과 같이 절연 axoplasm 샘플과 설명서를 쥐어 짜기 방법으로 절연 서양 얼룩 비교 axoplasm. 각각 혈액 단백질과 glial 세포 contaminations를 대표하는 알부민 및 GFAP의 감소 수준을합니다. 대조적으로, axonal tubulin B3는 axonal 단백질의 높은 수준을 나타내는이 준비 풍부합니다.

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

생화학 및 proteomic 분석 기계 쥐어 짜기 1 axoplasm 절연 이전에 설명한 방법에 비해이 절차는 혈청과 glial 세포 오염 3 감소 것으로 확인되었습니다. 우리는 좌골 신경 손상이 후 dynein 기반 역행 신호를 탐험하고 축삭 - glia 상호 작용 4를 포함한 성인 말초 신경 여러 프로세스의 탐사에 유틸리티를 기대이 axoplasm 격리 프로토콜을 사용하고 있습니다.

<ul><li> 남성 위스타 쥐 (80-10주 세) </li><li> 50 ML 당 단백 분해 효소 억제제 (Roshe) 2 타블렛을 포함하는 PBS 0.2X와 PBS 1X 솔루션 </li><li> 1.5 ML에 대한 Eppendorfs </li><li> 플라스틱 접시에게 35mm를 살균 </li><li> 가위와 고급 집게 포함 해부 도구 </li><li> 쌍안경과 테이블 조명 </li></ul> 항체 마우스 방지 GFAP 클론 GA - 5 시그마 (G6171)에서했습니다. 토끼 방지 알부민은 시더 레인 (CLAG5140)에서했습니다. 마우스 방지 Tubulin의 β3와 토끼 방지 gERK은 시그마 (T2200 각각 M5670)에서 있었다.

쥐 좌골 신경에서 axoplasm 격리

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

주변 신경에서 순수 axonal 세포질 (axoplasm)의 분리는 많은 생물 학적 과정의 생화 학적 연구를 위해 매우 중요합니다. 이 문서에서는, 우리는 입증하고 다음 단계에 따라 성인 쥐의 좌골 신경에서 axoplasm 고립에 대한 프로토콜을 설명 : 신경 fascicles 및 결합 조직의 분리 (1) 절개를, hypotonic 매체 신경 fascicles의 짧은 세그먼트 (2) 인큐베이션 myelin을 릴리스 및 비 axonal 구조를 lyse을하며, (3) 남아있는 축삭 - 풍부한 자료의 추출. 이 준비 Proteomic 및 생화 학적 특성은 axonal 구성 요소에 대한 농축 높은 학위를 확인했습니다.

우리는 myelin를 공개하고 나머지 축삭 - 풍부한 자료의 추출 다음 비 axonal 구조를 lyse에 hypotonic 매체 신경 fascicles과 부화 해부에 따라 성인 쥐의 좌골 신경에서 axoplasm 절연을위한 프로토콜을 보여줍니다.

쥐 좌골 신경에서 Axoplasm 격리

말초 신경으로부터 순수한 축삭 세포질(축삭질)을 분리하는 것은 많은 생물학적 과정의 생화학적 연구에 매우 중요합니다. 본 논문에서 저희는...

이 절차의 전반적인 목표는 말초 신경에서 순수한 축삭 세포질 또는 외세포질을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 좌골 신경을 박리함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 신경에서 결합 조직을 제거하고 슬리브(sleeves)를 분리하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 저장성 배지에서 짧은 신경 섬유 절편을 배양하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 등장성 용액에서의 배양, 원심 분리 및 삼투압 평형화입니다. 최종적으로, 웨스턴 블롯 분석을 통해 축삭 성분이 고도로 농축되었음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 제 이름은 Elle Rosenbaum입니다. 저희는 Institute of Science 생물화학과의 Mike F Labor 교수님 연구실 소속입니다. 오늘은 Oxy Opat Mesylation이라는 새로운 기술을 소개해 드리겠습니다.말초 신경의 수동 압착 OIS와 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은, 이 절차가 축삭 내용물에 도달하는 혈청 및 신경초 오염을 줄여준다는 점입니다. 저희는 좌골 신경 손상 후 D 기반 역행성 신호를 탐구하기 위해 op PLAs 메틸화에 이 새로운 기술을 사용하였습니다.이제 시작해 보겠습니다. 8~10주 된 안락사시킨 Wistar 랫드 두 마리 중 한 마리를 해부 매트 위에 옆으로 눕혀 좌골 신경(sciatic nerve)의 원위부에 직접 접근할 수 있도록 합니다. 허벅지 중간 부분의 피부를 제모하고 70% ethanol로 철저히 닦아냅니다.가위를 사용하여 허벅지 피부를 절개하여 제거합니다. 대퇴이두근과 표층둔근 사이의 지방 및 결합 조직을 주의 깊게 절개합니다. 포셉을 사용하여 노출된 좌골신경 부위를 들어 올려 제거합니다.제거된 부분의 길이는 약 1.5 centimeters가 됩니다. 신경을 프로테아제 억제제가 포함된 500 microliters의 얼음처럼 차가운 2X PBS가 담긴 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.쥐의 반대편과 두 번째 쥐의 양쪽 모두에 대해 해부 절차를 반복합니다. 파스퇴르 피펫으로 페트리 접시 바닥을 긁어준 뒤, 상온의 2 mL 2X PBS(단백질 분해 효소 억제제 포함)를 채웁니다.해부 현미경 하에서 신경 한 가닥을 디쉬로 옮깁니다. 미세 핀셋을 사용하여 신경에서 신경외막을 당겨 제거하고 폐기하며, 신경다발(fascicles)만 디쉬에 남깁니다. 각 신경다발을 서로 및 디쉬 바닥으로부터 조심스럽게 분

axoplasm-isolation-from-rat-sciatic-nerve

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

수술의 단순하고 강력한 행동 결과로 인해 좌골 신경의 만성적인 수축이 neuropathic 고통의 사전 저명한 동물 모델 중 하나입니다. 수술에 따라 24 시간 내에 통증 과민성 설립되고 양적 폰 프라이 aesthesiometer (기계적 시험)과 발바닥 진통제 측정기 (온도 시험)를 사용하여 측정할 수있다.

좌골 신경 및 쥐의 통증 과민성 시험의 만성 수축

이 비디오는 쥐의 척추 뿌리에서 슈반 세포의 격리 및 배양에 대해 설명합니다. 그런 다음 분리된 세포를 특정 배지에서 배양합니다. 슈반(Schwann) 세포는 차등 분해(differential digestion) 및 부착(adélection)을 통해 분리됩니다. 그 후 부착 및 증식을 위해 세포외 기질로 코팅된 커버슬립으로 전달됩니다.

쥐 척추근에서 Schwann 세포의 분리

이 비디오는 쥐의 좌골 신경 섬유에서 슈반 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

마우스 좌골 신경에서 슈반 세포의 자기 분리

이 비디오는 쥐의 C 섬유 신경 전도에 대한 단일 섬유 기록을 보여줍니다. 마취된 쥐는 하지에 감각 및 운동 공급을 제공하는 좌골 신경을 노출시키기 위해 절개됩니다. 그런 다음 개별 C-섬유가 노출됩니다. 발에 이식된 자극 전극을 사용하여 전기 자극이 제공되며, 단일 신경 섬유에서 반응이 기록됩니다.

쥐에서 좌골 신경 C-섬유의 생체 내 단일 섬유 기록

여기에서는 설치류 좌골 신경의 슈반 세포(SC)로 유전자를 전달하는 생체 내 기술을 제시합니다. 이 간단한 기술은 수초성 SC의 발달 및 유지와 관련된 신호 전달 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다.

Electroporation에 의해 쥐 좌골 신경의 슈반 세포로 생체 내 유전자 전달에

여기에서는 척수의 수압압출과 동일한 설치류에서 특정 등뿌리 신경절(DRG)의 식별 및 격리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 표준 척수 분리 방법과 비교하여 이 방법은 훨씬 빠르고 조직 손상 위험을 줄입니다.

설치류의 등쪽 뿌리 신경절의 척수 및 절연의 유압 압출

단일 섬유 기록은 중추 및 말초 신경계에 적용할 수 있는 효과적인 전기 생리학적 기술입니다. 부착 된 동골 신경과 함께 손상되지 않은 DRG의 준비와 함께 전도 실패의 메커니즘을 검사합니다. 두 프로토콜 모두 말초 신경계의 통증과의 관계에 대한 이해를 향상시킵니다.

전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용

이 방법은 쥐 내측 위트로테미에미근 근육의 3가지 유형의 모터 단위로 트위치 및 파탄 수축 및 작용 잠재력을 기록할 수 있게 한다. 단일 모터 장치의 기능적 절연은 축축의 전기 자극에 의해 유도된다.

쥐 내측 위트로테미즘 근육의 단일 모터 단위의 기능적 격리

이 프로토콜은 생체외 전기생리학적 자극을 위한 래트 전체 좌골 신경 조직의 제조를 기술하고, 환경적으로 조절된, 두 구획, 관류 식염수 욕조에서 기록한다.

Ex Vivo 신경 생리학을위한 쥐 좌골 신경의 제조

후근 신경절과 슈반 세포의 공동 배양 시스템에서 말초 신경계의 수초화를 연구 할 수 있습니다. 이 모델은 말초 수초화를 관찰 및 정량화하고 미엘린 외피에 대한 관심 화합물의 효과를 연구할 수 있는 실험적 기회를 제공합니다.

쥐 등쪽 뿌리 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 시험관 내 수초화

학습하세요 쥐 좌골 신경에서 축살질을 분리하는 방법을. 저삼투액 처리와 원심분리를 통해 순수한 축살 성분을 얻어 신경생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

쥐 좌골 신경에서 Axoplasm 격리

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