쥐 좌골 신경에서 Axoplasm 격리

본 절차의 전체적인 목표는 말초 신경에서 순수한 축삭 세포질 또는 외세포질을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 좌골 신경을 절제하여 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 신경에서 결합 조직을 제거하고 신경절을 분리하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 신경 섬유의 짧은 분절을 저장성 배지에서 배양하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 등장성 용액에서의 배양, 원심분리 및 삼투압 평형화입니다. 최종적으로, 웨스턴 블롯 분석을 통해 축삭 성분이 고도로 농축되었음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Elle Rosenbaum입니다. 저희는 기초과학연구원 생물화학부 Mike F. Lab 교수님 연구실 소속입니다. 오늘은 Oxy Opat Mesylation의 새로운 기술을 소개해 드리겠습니다.

말초 신경의 수동 압착 OIS와 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은, 이 절차가 혈청 및 신경초(glos) 오염이 축삭 내용물에 도달하는 것을 줄여준다는 점입니다. 우리는 좌골 신경 손상 후 D 기반의 역신호 전달을 탐구하기 위해 op PLA 메틸화에 이 새로운 기술을 사용했습니다.

이제 시작해 보겠습니다. 8~10주 된 안락사시킨 Wistar 쥐 한 마리를 해부 매트 위에 옆으로 뉘어 좌골 신경의 원위부에 직접 접근할 수 있도록 합니다. 허벅지 중간 부분의 피부를 제모하고 70% ethanol로 철저히 닦아냅니다.

가위로 허벅지 부위의 피부를 절개하여 제거합니다. 대퇴 이두근과 표층 둔근 사이의 지방 및 결합 조직을 조심스럽게 절개합니다. 핀셋을 사용하여 노출된 좌골 신경 부위를 들어 올려 제거합니다.

제거된 절편의 길이는 약 1.5 centimeters가 됩니다. 신경을 프로테아제 억제제가 포함된 500 microliters의 ice cold 2X PBS가 담긴 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.

쥐의 반대편과 두 번째 쥐의 양측 모두에서 해부 절차를 반복합니다. 파스퇴르 피펫으로 페트리 접시 바닥을 긁어낸 후, 단백질 분해 효소 억제제가 포함된 실온의 2.2 X PB s 2 mL를 채웁니다.

해부 현미경 하에서 단일 신경을 디쉬로 옮깁니다. 미세 핀셋을 사용하여 신경에서 신경외막을 잡아당겨 제거하고 폐기하며, 신경다발만 디쉬에 남깁니다. 신경다발들을 서로부터, 그리고 디쉬 바닥으로부터 조심스럽게 분리합니다.

개별 펠릿이 뿌옇게 변하며 용액 표면으로 떠오를 것입니다. 분리된 펠릿을 프로테아제 억제제가 포함된 0.2 X PBS 500 microliters가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 즉시 옮기십시오. 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오.

숙련된 동작으로 튜브 내의 나머지 좌골신경에서 sles를 분리하여 수집하십시오. 신경외막을 제거하고 sles를 분리하는 과정은 신경당 10분 이내로 완료되어야 합니다.

분리된 SLES가 들어 있는 튜브를 얼음에서 꺼냅니다. 수초 및 비축삭 구조를 제거하기 위해 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 각 세척 단계마다 SLES를 세척합니다.

포셉을 사용하여 sles를 조심스럽게 들어 올려 프로테아제 억제제가 포함된 2X PB s 1 mL가 들어 있는 새 튜브로 옮깁니다. 로커(rocker)에서 튜브를 5분 동안 흔들어 줍니다. 세척 후 이러한 방식으로 SLES를 세 번 더 세척합니다.

과잉 액체를 제거하기 위해 SLES를 깨끗한 빈 einor 튜브로 옮긴 다음, 프로테아제 억제제가 포함된 1x PBS 300 µL가 들어 있는 튜브로 옮겨 상온에서 20~30분 동안 배양합니다. opsm을 용출할 때 높은 염 농도는 후속 프로테오믹스 절차를 방해합니다. 조직 및 세포 파편을 침전시키기 위해 4 °C에서 10,000 ×g로 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 깨끗한 einor 튜브로 피펫팅하여 옮깁니다.

얻어진 상층액은 투명해야 합니다. 분광광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하십시오.

200에서 250 µg의 단백질 수득량을 얻어야 합니다. 분리된 혈장 제제를 소분하여 -80 °C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. 해동 및 냉동의 반복을 피하십시오.

다음은 수동 압착법으로 분리한 op plasm와 본 프로토콜에 따라 분리한 opsm 샘플을 비교한 웨스턴 블롯 결과입니다. 각각 혈액 단백질과 글리아 세포 오염을 나타내는 albumin과 GFAP의 수치가 감소한 것을 확인할 수 있습니다. 반면, 본 조제물에서는 axonal tubulin beta three가 농축되어 있어 축삭 단백질의 수준이 높음을 나타냅니다.

이 영상을 모두 시청하신 후에는 좌골 신경을 해부하고 Paco를 적절하게 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.