쥐 좌골 신경에서 Axoplasm 격리

이 절차의 전반적인 목표는 말초 신경에서 순수한 축삭 세포질 또는 외세포질을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 좌골 신경을 박리함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 신경에서 결합 조직을 제거하고 슬리브(sleeves)를 분리하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 저장성 배지에서 짧은 신경 섬유 절편을 배양하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 등장성 용액에서의 배양, 원심 분리 및 삼투압 평형화입니다. 최종적으로, 웨스턴 블롯 분석을 통해 축삭 성분이 고도로 농축되었음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Elle Rosenbaum입니다. 저희는 Institute of Science 생물화학과의 Mike F Labor 교수님 연구실 소속입니다. 오늘은 Oxy Opat Mesylation이라는 새로운 기술을 소개해 드리겠습니다.

말초 신경의 수동 압착 OIS와 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은, 이 절차가 축삭 내용물에 도달하는 혈청 및 신경초 오염을 줄여준다는 점입니다. 저희는 좌골 신경 손상 후 D 기반 역행성 신호를 탐구하기 위해 op PLAs 메틸화에 이 새로운 기술을 사용하였습니다.

이제 시작해 보겠습니다. 8~10주 된 안락사시킨 Wistar 랫드 두 마리 중 한 마리를 해부 매트 위에 옆으로 눕혀 좌골 신경(sciatic nerve)의 원위부에 직접 접근할 수 있도록 합니다. 허벅지 중간 부분의 피부를 제모하고 70% ethanol로 철저히 닦아냅니다.

가위를 사용하여 허벅지 피부를 절개하여 제거합니다. 대퇴이두근과 표층둔근 사이의 지방 및 결합 조직을 주의 깊게 절개합니다. 포셉을 사용하여 노출된 좌골신경 부위를 들어 올려 제거합니다.

제거된 부분의 길이는 약 1.5 centimeters가 됩니다. 신경을 프로테아제 억제제가 포함된 500 microliters의 얼음처럼 차가운 2X PBS가 담긴 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.

쥐의 반대편과 두 번째 쥐의 양쪽 모두에 대해 해부 절차를 반복합니다. 파스퇴르 피펫으로 페트리 접시 바닥을 긁어준 뒤, 상온의 2 mL 2X PBS(단백질 분해 효소 억제제 포함)를 채웁니다.

해부 현미경 하에서 신경 한 가닥을 디쉬로 옮깁니다. 미세 핀셋을 사용하여 신경에서 신경외막을 당겨 제거하고 폐기하며, 신경다발(fascicles)만 디쉬에 남깁니다. 각 신경다발을 서로 및 디쉬 바닥으로부터 조심스럽게 분리합니다.

개별 펠렛이 뿌옇게 변하며 용액 표면으로 떠오릅니다. 분리된 펠렛을 프로테아제 억제제가 포함된 500 µL의 0.2 X PBS가 담긴 마이크로 원심분리 튜브로 즉시 옮깁니다. 펠렛을 얼음 위에 보관하십시오.

숙련된 솜씨로 튜브 내의 남은 좌골신경에서 sles를 분리하여 수집하십시오. 신경외막을 제거하고 sles를 분리하는 과정은 신경당 10분 이내에 완료되어야 합니다.

분리된 SLES가 들어 있는 튜브를 얼음에서 꺼냅니다. 수초 및 비축삭 구조물을 제거하기 위해 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 각 세척 단계마다 sles를 세척합니다.

포셉을 사용하여 sles를 조심스럽게 들어 올려 프로테아제 억제제가 포함된 2X PB s 1 mL가 들어 있는 새 튜브로 옮깁니다. 로커에서 튜브를 5분 동안 흔들어 줍니다. 세척 후 이러한 방식으로 SLES를 세 번 더 세척합니다.

과잉 액체를 제거하기 위해 SLES를 새로운 빈 Eppendorf 튜브로 옮긴 후, 단백질 분해 효소 억제제가 포함된 1X PBS 300 µL가 들어 있는 튜브로 옮겨 상온에서 20~30분 동안 배양합니다. opsm을 용출할 때 높은 염 농도는 후속 프로테오믹스 절차를 방해합니다. 조직 및 세포 파편을 침전시키기 위해 4 °C에서 10,000 ×g로 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 깨끗한 Eppendorf 튜브로 파이펫팅하여 옮깁니다.

얻어진 상층액은 투명해야 합니다. 분광광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하십시오.

200~250 µg의 단백질 수율을 얻어야 합니다. 준비된 혈장 시료를 소분하여 -80 °C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. 해동 및 냉동의 반복을 피하십시오.

수동 압착법으로 분리한 op plasm와 본 프로토콜에 따라 분리한 opsm 샘플을 비교한 웨스턴 블롯 결과입니다. 혈액 단백질과 글리아 세포 오염을 각각 나타내는 albumin 및 GFAP의 수준이 감소한 것에 주목하십시오. 이와 대조적으로, 본 조제물에서는 axonal tubulin beta three가 농축되어 있어 축삭 단백질 수준이 높음을 알 수 있습니다.

이 영상을 모두 시청하신 후에는 좌골 신경을 절개하고 Paco를 적절하게 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.