쥐 척추근에서 Schwann 세포의 분리

신경근을 가져다가 작은 조각으로 자릅니다.

소화 효소 함유 튜브로 옮기고 배양합니다.

효소는 세포외 기질을 소화합니다.

소화를 멈추기 위해 혈청이 함유된 배지를 추가합니다.

내용물을 반복적으로 피펫팅한 다음 원심분리하여 상층액을 버립니다.

펠릿을 재현탁합니다.

현탁액을 스트레이너에 통과시켜 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 수집된 세포를 플레이트에 배양합니다.

섬유아세포 및 슈완 세포 또는 SC가 플레이트에 부착되어 분열합니다.

부착되지 않은 셀을 제거합니다. 부착된 세포를 인산염 완충액으로 세척합니다.

소화 효소를 첨가하여 소화에 민감한 SC를 느슨하게 합니다. 배지로 소화를 중지합니다.

미디어를 추가하여 SC를 완전히 분리합니다.

세포를 튜브로 옮기고 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포를 SC 특이적 배지에 재현탁합니다.

세포를 코팅되지 않은 플레이트로 옮기고 배양합니다.

남아 있는 섬유아세포는 부착되어 SC를 현탁 상태로 남깁니다.

현탁액을 매트릭스 코팅 플레이트로 옮깁니다.

Schwann 세포 부착 및 분열을 위해 배양합니다.

위로 신경을 3-5mm 조각으로 자릅니다. 0.25% 트립신 1밀리리터를 넣고 신경 조각을 5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 18-20분 동안 배양합니다. 다음으로, 소를 멈추기 위해 소태아 혈청 10%를 함유한 DMEM 3-4밀리리터를 첨가합니다. 혼합물을 위아래로 부드럽게 약 10회 피펫팅합니다. 800배 g에서 5분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후 상청액을 버리고 침전물을 10% FBS가 보충된 DMEM 2-3밀리리터에 재현탁합니다. 400메쉬 필터를 통해 세포 현탁액을 여과한 다음 현탁액을 사용하여 60mm 페트리 접시에 접종합니다. 페트리 접시를 5% 이산화탄소가 있는 섭씨 37도에서 4-5일 동안 배양합니다.

배양이 90% 합류에 도달하면 1X PBS를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 슈완 세포를 소화하기 위해 60mm 접시당 섭씨 37도에서 0.25% 트립신 1밀리리터를 첨가합니다. 실온에서 8-10초 후, 10% FBS가 보충된 DMEM 3밀리리터를 첨가하여 소화를 중지합니다. 슈완 세포를 분리하려면 피펫으로 세포를 부드럽게 불어냅니다.

세포가 분리되었는지 현미경으로 확인합니다. 그런 다음 Schwann 세포가 포함된 배지를 수집하고 800 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 침전물을 3밀리리터의 배지에 재현탁합니다. 현탁액을 사용하여 코딩되지 않은 60mm 페트리 접시에 접종하고 접시를 섭씨 37도에서 30-45분 동안 배양합니다. 슈완 세포를 포함할 배지를 폴리-L-라이신 코팅 배지 접시로 옮기고 접시를 섭씨 37도에서 2일 동안 배양합니다.