게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

이 절차의 전반적인 목표는 현대 게놈 편집 기술을 사용하여 인간 만능 줄기 세포를 유전적으로 조작하는 것입니다. 이 절차는 줄기세포 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 유전적으로 정의된 환경에서 인간 질병 모델링을 용이하게 하는 데에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 능숙해지기 전에 군체를 격리하는 연습을 해야 합니다.

이 방법의 시각적 시연은 식별 및 군체를 선택하는 것이 어려울 수 있으므로 필수적입니다. 먼저 미토마이신 C 비활성화 마우스 배아 섬유아세포 또는 젤라틴에서 자란 MEF 공급세포를 포함하는 6웰 플레이트에서 hESC 배지의 인간 만능 줄기세포를 배양합니다. 도금 후 매일 hPSC가 50% 포화도에 도달할 때까지 유리 피펫과 진공 청소기를 사용하여 전체 부피의 매체를 제거합니다.

웰당 3ml의 따뜻한 hESC 배지로 교체합니다. 표적화하기 하루 전에 hESC 배지를 제거하고 10마이크로몰 Y-27632가 보충된 예열된 새로운 hESC 배지를 추가합니다. 또한 DR4 마우스에서 약물 내성 MEF 공급 세포의 6웰 플레이트 1-2개를 준비합니다.

표적화 당일, 5마이크로그램의 Zinc finger nuclease 발현 플라스미드 1 및 2, TALON 1 및 2 발현 플라스미드 또는 15마이크로그램의 CRISPR cas9 px330 인코딩 플라스미드를 1포인트 5밀리리터 튜브에 피펫팅하여 transvection 용액을 준비합니다. 복구된 공여체 플라스미드 30마이크로그램을 추가한 다음 부피를 300마이크로리터로 끌어올리기 위해 충분한 1x 인산염 완충 식염수를 추가합니다. 현미경으로 세포를 검사하여 50%의 포화도를 확인합니다.

다음으로, 유리 피펫과 진공 청소기를 사용하여 hPFC 플레이트에서 배지를 제거한 다음 2ml의 따뜻한 1x PBS로 셀을 세척합니다. PBS를 흡인시킨 후 0.25% 트립신-EDTA 용액의 영점 5밀리터를 세포에 직접 첨가합니다. 조직 배양 인큐베이터에 약 10분 동안 또는 피더 층이 플레이트에서 들어 올려지기 시작할 때까지 놓습니다.

배양 후 각 웰에 2ml의 따뜻한 ES 세척 매체를 추가하여 트립신 반응을 중단합니다. 각 웰에서 세포를 수집하여 피더 세포가 시트로 분리되도록 합니다. 각 웰의 내용물을 단일 50ml 원뿔형 튜브에 피펫으로 넣고 모든 웰을 결합하고 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 세포를 분쇄합니다.

ES 세척 매체를 추가하여 세포 현탁액을 40ml로 만듭니다. 큰 피더 덩어리가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 1-2분 정도 기다린 다음 혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 새 50ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 세포 현탁액을 190배g로 5분 동안 원심분리한 후, 세포 팔레트를 방해하지 않고 상층액을 흡인합니다.

500마이크로리터의 1x pbs에 세포를 재현탁합니다. 재현탁 세포를 이전에 준비된 혈장 절편 용액과 결합합니다. 세포와 transfection 혼합물을 4mm electroporation 큐벳에 피펫으로 넣고 얼음 위에 3-5분 동안 놓습니다.

electroporation 시스템의 지수 프로그램에 대한 매개변수를 250볼트, 500마이크로패럿, 무한 저항 및 4mm 큐벳 크기로 설정합니다. 세포를 전기천공한 다음 큐벳을 다시 얼음 위에 3분 동안 놓습니다. 10마이크로몰 Y-27632를 보충한 18ml의 따뜻한 hESC 배지에 전기천공된 세포를 재현탁합니다.

현미경으로 DR4 MEF를 검사합니다. 3ml의 단일 세포 현탁액을 DR4 공급 세포를 포함하는 6웰 플레이트의 각 웰에 플레이트하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 도금 후 3일차에 Y-27632가 없는 hESC 배지 셀의 배지를 교체합니다.

4일차에는 보충되지 않은 배지를 적절한 선택 항생제가 함유된 배지로 교체합니다. 여기에는 Puromycin이 사용됩니다. 콜로니 채취 전날, 채집할 각 콜로니에 대해 MEF 공급세포의 12웰 플레이트 1개를 준비합니다.

도금 후 12일째에 해부 현미경으로 플레이트를 검사합니다. 선택할 준비가 된 직경 800-1, 200미크론의 군체를 식별합니다. 이러한 콜로니에는 여기에 표시된 것과 같이 분화를 시작하는 세포가 포함되어 있지 않은지 확인합니다.

또한 세포가 GFP를 발현하고 있는지 확인하십시오. 피킹 당일에는 현미경으로 MEF를 검사하여 건강한지 확인합니다. MEF 공급기 세포 플레이트에서 모든 배지를 제거하고 1mL의 hESC 배지로 교체합니다.

또한 피킹할 6웰 hPSC 플레이트의 hESC 매체를 변경합니다. 다음으로, 식민지를 따기 위해 유리 피펫을 당깁니다. 콜로니를 피킹하려면 먼저 플레이트 hPFC를 조직 배양 후드의 해부 현미경 스테이지에 배치하고 유리 피펫 끝을 흡입 전구에 배치하여 피킹 장치를 조립합니다.

채집할 군체를 식별하고 당긴 유리 피펫의 끝을 군집 위에 놓습니다. 그런 다음 피킹 장치의 전구를 압축하여 개별 콜로니를 10-20개의 동일한 크기의 조각으로 부드럽게 절제하고 자릅니다. 다음으로, 전구를 풀어 절제된 군체 조각을 피펫으로 끌어들입니다.

전송하는 동안 가능한 한 적은 미디어를 가져오십시오. 전구를 압축하여 현재 끊어진 콜로니를 12웰 MEF 피더 세포 플레이트의 한 웰로 직접 전달합니다. 단일 세포 유래 클론을 고유하게 식별할 수 있도록 각 웰에 라벨을 붙입니다.

유리 피펫을 교체하고 다음 콜로니에 대해 절차를 반복합니다. 플레이트를 인큐베이터로 되돌리고 플레이트를 부드럽게 흔들어 웰의 세포를 분산시킵니다. 다음 날, 전체 부피의 배지를 제거하고 1포인트 5ml의 따뜻한 hESC 배지로 교체합니다.

세포가 50% confluent가 될 때까지 10-12일 동안 반복합니다. 10일에서 12일 후에 범위 아래의 hESC를 검사합니다. 각 웰에서 1-2개의 콜로니를 선택하고 새로운 12웰 MEF 공급세포 플레이트로 이동하여 복제 플레이트를 생성합니다.

PCR 또는 서던 블롯(southern blot)으로 유전형 분석을 위해 원래 플레이트의 각 웰에 있는 나머지 콜로니에서 DNA를 추출합니다. Weber: 3개의 인간 배아 줄기세포를 부위 특이적 뉴클레아제와 복구 주형을 사용하여 AAVS1 유전자 자리에서 표적으로 삼아 EFFP 리포터와 퓨로마이신 내성 카세트를 도입했습니다. 이 대표적인 이미지는 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN 및 CRISPR/Cas9로 편집된 콜로니를 보여줍니다.

이러한 대표적인 PCR 유전형 분석 결과는 야생형 대조군과 함께 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN 및 CRISPR/Cas9를 사용하여 비표적, 이형접합 및 동형접합 표적 클론을 보여줍니다. 이 표는 이전 실험에서 Southern Blot이 확인한 적절한 단일 통합과 비교하여 이 실험에서 각 부위 특이적 뉴클레아제에 대한 AAVS1 유전자 자리에서 PCR 검증된 통합을 보여줍니다. CRISPR-Cas9는 가장 정확하게 표적화된 클론을 산출한 반면, TALEN 플랫폼은 가장 동형질하게 표적화된 클론을 가지고 있었습니다.

이 기술을 완전히 익히면 약 3-5시간의 실습 시간이 소요되며, 실험을 시작한 후 약 3주 이내에 세포를 편집할 수 있습니다. 이 기술에서는 안전하게 작업하고 항상 멸균 기술을 사용하는 것이 정말 중요합니다. 유전자 조작 후 줄기세포를 뉴런과 같은 다른 세포 유형으로 분화하여 다른 유형의 세포에 어떤 영향을 미치는지 확인할 수 있습니다.

이 프로토콜의 개발은 연구자들이 인간 만능 줄기세포에서 게놈 편집을 사용하여 체외 질환 모델을 확립할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 만능 줄기 세포의 게놈 편집 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.