Name: 의 게놈 편집 아 스티 아낙 스의 mexicanus 사용 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 학습하세요 TALEN을 이용한 Astyanax mexicanus 게놈 편집 방법으로 동굴 적응의 유전적 기초를 연구합니다. 이 기법은 진화생물학에서 특정 유전자 기능을 분석하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 유전학, 개발 및 세포 생물학 및 아이오와 주립 대학의학과 및 NIH 보조금 EY024941 (WJ) 싱거에 의해 투자되었다. 제프리 Essner는 원고에 대한 의견을 제공했다.

모든 동물의 절차는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 지침에 따라이었고, 아이오와 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 및 메릴랜드 대학에 의해 승인되었다. 1. TALEN 디자인 <ol><li> TALEN 디자인 웹 사이트에 입력 원하는 대상 시퀀스. (예 : <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). 입력 스페이서 / 반복 배열 길이를 선택. <ol><li> &quot;순서&quot;라고 표시된 상자에 게놈 시퀀스를 복사합니다. </li><li> &quot;사용자 지정 스페이서 / RVD 길이를 제공한다&quot;탭에서 스페이서 길이와 배열의 길이를 선택합니다. 참고 : 15 염기쌍의 스페이서 길이 잘 15-17 일의 배열의 길이를 반복하고 조립이 덜 복잡합니다. </li></ol></li><li> TALEN 쌍을 선택합니다. 독특한 제한 효소 부위를 중심으로 설계 TALEN 쌍은 제한 효소에 의해 소화 유전자형이 허용PCR 산물. </li><li> 디자인 된 프라이머에는 Primer3 (30-32)과 같은 웹 사이트를 이용하여 TALEN 대상 부위 주변의 게놈 영역을 증폭한다. 제한 효소 유전자형하면 설계 프라이머 번만 제한 효소 부위를 포함하는 영역을 증폭한다. 이 지역이 증폭되고 A에 존재하는 다형성을 확인하기 TALEN 건설에 앞서 염기 서열을하는 것이 좋습니다 mexicanus 실험실 인구는 미세 주입에 사용되는. </li></ol> 합니다 (TALEN 키트 프로토콜에서 수정) 2. TALEN 조립 33, 34 자세한 내용 및 문제 해결을 위해 프로토콜 34을 참조하십시오. <ol><li> 준비하고 제조업체의 지침에 따라 TALEN 키트에서 필요한 플라스미드 시퀀스. </li><li> 반응 A와 B에 대한 1 반응이 반복 변수 diresidues (RVDS) 1-10과 반응 A의 대상 벡터 pFUS_A는 RVDS를 포함를 11- 포함 # (N-1)과 일을 설정합니다N은 TALEN에 RVDS의 총 개수이다 전자 대상 벡터 pFUS_B 반응 B의 (N-1). <ol><li> 각 반응에 추가 각 RVD (100 NG / μL), 대상 벡터 (100 NG / μL), 1 ㎕의 BSA I 제한 효소 1 ㎕의 소 혈청 알부민 (BSA) (2 ㎎ / ㎖를 함유하는 각각의 플라스미드 1 μL ) 1 μL 리가 20 μl의 총 부피에 대한 물의 μL 배 리가 버퍼 (X)의 2 μL. 예를 들어, 표 1을 참조하십시오. 주 : 하프 반응이 또한 사용될 수있다. </li><li> 열 순환기의 반응을 놓고 사이클 실행 : 10 배 (37 ° C / 5 분 + 16 ° C / 10 분) + 50 ° C / 5 분 + 80 ° C / 5 분. </li></ol></li><li> 클레아 제와 반응을 품어. 각 반응에 1 ㎕의 25 mM의 ATP 1 ㎕를 클레아를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 반응을 인큐베이션. </li><li> 반응을 변환. <ol><li> 화학적으로 25 μl의 유능한 세포로 각 반응의 2.5 μl를 변환. 참고 : 제 유능한 CELL을 사용할 수있다. 그러나, 낮은 능력을 가진 세포는 식민지의 부족이 발생할 수 있습니다. <ol><li> 화학적 적격 세포를 25 ㎕의 반응물의 2.5 μl를 섞는다. 다섯 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 42 ° C에서 30 초 동안 세포를 품어. </li><li> 2 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. Catabolite 억압 (SOC) 슈퍼 최적 배지 125 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ° C에서 튜브를 흔들어. </li></ol></li><li> 접시 스펙 티노 마이신 (50 μg의 / mL)로 LB 플레이트 상에 형질 전환 된 세포를 100 μL, X-gal을 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG). 37 ° C에서 O / N를 성장. </li></ol></li><li> 각각의 반응 2-3 흰색 식민지를 선택하고 프라이머 pCR8_F1 및 pCR8_R1 (표 2)를 사용하여 식민지 PCR에 의해 확인합니다. <ol><li> 시약의 마스터 믹스를 확인합니다. 예를 들어, 표 3 참조. </li><li> 식민지를 선택하고, PCR 튜브의 바닥으로 얼룩 다음 스펙 티노 마이신과 2 ml의 LB에 식민지의 유물을 넣어(50 μg의 / ㎖). 식민지와 튜브에 마스터 믹스 15 μl를 놓습니다. </li><li> 다음 PCR 프로그램을 실행 (표 4) </li><li> 전기 영동하여 1.5 % 아가 로스 겔에 PCR을 (전체 볼륨을 실행) 확인합니다. 올바른 클론 예상 크기에 밴드뿐만 아니라 비방과 밴드의 사다리를해야합니다. 해당 스미어의 예를 들어, 34,33 참조하십시오. </li><li> 진탕 배양기에서 37 ° C에서 LB 미디어 O / N에서 올바른 클론 2 ㎖ 문화를 성장. </li></ol></li><li> 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 미니 프렙. </li><li> 순서 pCR8_F1 및 pCR8_R1과 TALEN 순서를 확인합니다. 앞에서 설명한 방법 (35)을 따릅니다. </li><li> 시퀀싱에 의해 확인 정확한 클론을 사용하여, 대상 벡터에 A 및 B 벡터를 최종 RVD에서 RVDS를 두어 반응 # 2 (TALEN 키트)를 설치했다. <ol><li> 반응 2 (표 5)에 대한 믹스를 준비합니다. 참고 : 하LF 반응이 사용될 수있다. </li><li> 열 순환기의 반응을 놓고 다음 프로그램 실행 : 37 ° C / 10 분 + 16 ° C / 15 분 + 37 ° C / 15 분 + 80 ° C / 5 분. </li></ol></li><li> 반응을 변환. <ol><li> 화학적으로 25 μl의 유능한 세포로 각 반응의 2.5 μl를 변환. <ol><li> 화학적 적격 세포를 25 ㎕의 반응물의 2.5 μl를 섞는다. 5 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 열은 42 ℃에서 30 초 동안 세포를 충격. </li><li> 얼음에 튜브를 놓습니다. SOC의 125 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 진탕 배양기에서 튜브를 놓습니다. </li></ol></li><li> 플레이트 암피실린 (100 μg의 / ㎖), X-여자와 IPTG와 LB 플레이트 상에 형질 전환 세포 100 ㎕. 37 ℃에서 O / N 성장 </li></ol></li><li> 각각의 반응 1-3 흰색 식민지를 선택하고 식민지 PCR 프라이머의 TAL_F1를 사용 TAL_R2 (표 2)에 의해 확인. <ol><li> 중합 효소 mastermix 물 및 프라이머의 용액을표 3에 설명했다. 식민지를 선택하고, PCR 튜브의 바닥으로 얼룩 다음 암피실린 (100 ㎕ / ml)이 2 ml의 LB에 식민지의 유물을 넣어. 식민지와 튜브에 용액 15 μl를 놓습니다. </li><li> PCR을 프로그램 (표 6)를 실행합니다. </li><li> 전기 영동하여 1.5 % 아가 로스 겔에 PCR을 확인합니다. 올바른 클론은 번짐 밴드의 사다리를해야합니다. 해당 스미어의 예를 들어, 34,33 참조하십시오. </li><li> 진탕 배양기에서 37 ° C에서 LB 미디어 O / N에서 올바른 클론 2 ㎖ 문화를 성장. </li></ol></li><li> 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 미니 프렙. </li><li> 순서 TAL_F1 및 TAL_R2 앞에서 설명한 방법 (35)을 다음과 같이 TALEN 순서를 확인합니다. </li></ol> TALENs의 3 mRNA의 전사 <ol><li> 37 ° C에서 2 시간 동안 2 μL 골목 I와 순서 검증 된 템플릿의 4 μg의 다이제스트. </리&gt; <li> 전기 영동에 의해 1.5 % 아가 로스 겔에서 골목 I 소화 플라스미드 2 μL를 실행. 제대로 소화 플라스미드는 하나의 밴드가 표시됩니다. </li><li> PCR을 정제 키트 프로토콜 다음 나머지 골목 I-소화 플라스미드를 정제. 용출 전에 세척 용액으로 두 번 세척 하였다. 뉴 클레아 제 무 물 30 μL로 용출. </li><li> T3 mRNA의 생산을위한 표준 프로토콜을 따르십시오. <ol><li> 선형화 된 템플릿의 0.5 μg의를 사용하여 반 반응을 설정합니다 (위의 준비). 2 시간 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> DNase의 (키트에 포함)의 0.5 μl를 추가하고 15 분 동안 37 ° C에서 품어. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침에 따라 mRNA의 정화. 30 μL 클레아없는 물에 용출. </li><li> mRNA의를 확인하기 위해 전기 영동으로 1.5 % 아가 로스 젤을 실행합니다. <ol><li> 된 RNase 오염을 제거하고 1.2 % 겔을 제조 제품 겔 청소 장치. </li><li> 믹스 1 μL mRNA의 + 4# 181; 리터 클레아없는 물 + 5 ㎕를 glyoxyl 로딩 염료. 30 분 동안 50 ℃에서 샘플을 인큐베이션. 젤을 실행하기 전에 얼음에 원심 분리기 튜브 짧게과 장소. </li></ol></li><li> 핵산 농도의 정량 방법을 사용하여 농도를 검사하고 -80 ℃에서 분취 량으로 RNA를 저장한다. RNA는 / 냉동 번 이상 해동되지 않도록 나누어지는 크기를 선택합니다. 참고 : 500 ~ 1,000 NG의 농도 / NL은 일반적으로 얻을 수있다. RNA의 무결성이 유지되는 (밴드보다는 겔상의 스미어이 정한) 저급 RNA 농도를 오랫동안 사용할 수있다. </li></ol> TALEN의 mRNA 4.를 주입 아 스티 아낙 스 mexicanus 배아 <ol><li> 주입을위한 도구를 준비합니다. <ol><li> 페트리 접시에 생선 물 (중탄산 나트륨과 바다 소금의 pH 7.4와 전도성 700 μS와 에어컨 물)을 1.2 % 아가로 오스를 부어 주사 판을 따르십시오. 물고기 우물을 만들기 위해 돌기 금형 (플라스틱 조각을 배치접시 안에 계란). 4 ° C에서 아가로 오스가 강화했다 금형 및 저장소를 제거합니다. 금형에 대한 자세한 내용은 36를 참조하십시오. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 바늘 풀러를 사용하여 주사 바늘을 빼냅니다. 참고 : 적절한 바늘 길이가 주사 중요하다. 너무 긴 바늘은 주사를 너무 유연 할 것입니다. 당기 바늘을위한 프로토콜은 바늘을 당겨하는 데 사용되는 장비에 따라 달라집니다. 적절한 바늘의 일례의 장비를 위해, 우리는 길이 5~6cm이다 바늘을 당긴다.도 1에 도시 한 고장시 약 0.011 mm의 선단부 외경을 가지고있다. 그러나 바늘은 개구 폭을 결정한다 (단계 4.3.4)를 교정해야한다. 바늘을 인상하기위한 예시적인 프로그램 표 7에서 확인할 수있다. </li><li> 달걀이 통과하는 개구부가 충분히 큰 있도록 피펫을 위반하여 배아 전송에 유리 피펫을 준비합니다. 깨진 끝날 때까지 불꽃더 이상 날카로운 없다. 참고 : A. 작업 할 때 유리 피펫과 유리 그릇을 사용하는 것이 중요합니다 mexicanus 계란과 배아는 끈적하고 플라스틱을 준수하므로. </li></ol></li><li> 1 셀 단계 계란을 수집합니다. <ol><li> 품종 A. mexicanus 표준 프로토콜 (37)을 다음과 같습니다. 참고 : 예를 들어, 물고기가 14 불을 유지하는 경우 : 10 어두운주기 및 소등로하고 ZT14 등으로 ZT0와 Zeitgerber 시간 (ZT)를 사용하여, ZT15과 ZT19 사이에 우리의 표면 물고기의 산란. 정확한 산란 시간은 각 실험실에 대해 결정해야합니다. </li><li> 이전 짝짓기 3-4 일 동안 물고기를 과식과 신선한 물에 물고기를 배치하여 산란을 유도한다. 온도 2 °의 F를 올립니다. 참고 : 우리의 초기 수온이 약 74 ° F입니다. </li><li> 1 세포 단계에서 달걀을 얻기 위해 15 분마다 확인, 어둠 속에서 표면 물고기 알을 수집합니다. 계란의 수백 표면 물고기의 한 쌍에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 수집유리 그릇에 계란 플라스틱 표면에 부착 방지하고 정렬 현미경으로 알을 관찰하고 단일 셀입니다 계란을 수집하여 사전 주입에 1 세포 단계에서 배아를 분리 할 수​​ 있습니다. (pH와 전도도 처리 된 성인 물고기가 보관되어있는 탱크의 물) 신선한 시스템 물에 계란을 유지합니다. </li></ol></li><li> TALEN의 mRNA를 주입한다. <ol><li> 독성과 효율 TALEN 쌍마다 다를으로 주입을위한 최적의 농도를 측정하는 총 mRNA를 (상기 한 쌍의 각 TALEN 동일한 양)의 상이한 양을 주입한다. 400-800 페이지입니다 전체의 mRNA의 농도를 주입하여 시작합니다. 희석하고 1.5 NL를 분사 목적의 mRNA 농도를 결합한다. </li><li> 로드 바늘의 뒷면에의 mRNA를 희석시키고 마이크로 주사기에 바늘을 연결합니다. </li><li> 집게를 사용하여 바늘 브레이크. </li><li> 바늘을 보정합니다. 예를 들어, 10 회 배출 및 마이크로 모세관의 결과 강하를 수집합니다. 10 × 100 일회용 1.081, L 32 mm 마이크로 모세관, 드롭 1.5 NL / 1 주입 0.5 mm에 마이크로 모세관을 작성해야합니다. 필요에 따라 분사 시간 및 압력을 조정한다. </li><li> 하나의 셀에 바늘을 삽입하고 mRNA를 주입. 하지 노른자로, 셀에 직접 mRNA를 주입한다. </li><li> 유리 그릇에 주입 된 배아를 수집합니다. 23 ~ 25 ℃에서 배아를 유지합니다. 죽은 태아 정기적으로 주입 다음 처음 몇 일 동안 (흐린 및 불규칙한 모양이 될 배아)를 제거합니다. 제어 (uninjected) 및 주입 판에서 죽은 변형 배아의 기록 번호. 참고 : 증가 된 mRNA의 농도가 증가 독성과 태아의 기형 / 죽음으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 효율성에 비해 독성은 주입의 mRNA의 최고 농도를 결정하기 위해 균형을 이루어야한다. </li></ol></li></ol> 5. 표현형의 설립자 물고기와 TALEN 효율성 평가 <ol><li> 기관 동물 프로토콜에 따라 배아를 희생. 참고 : 우리는 안락사빠른에 의한 배아 얼음에 냉각. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 0.8 μl의 PCR 스트립 튜브로 배아를 수집합니다. 참고 : 유전자형 개별 배아 또는 태아의 풀을 수행 할 수 있습니다. </li><li> DNA의 압축을 풉니 다. <ol><li> 100 ㎕의 50 mM의 수산화 나트륨 (NaOH)와에 장소 배아는 4 ° C까지 다음 냉각, 30 분 동안 95 ° C에서 품어. </li><li> 1 M 트리스 - 염산 pH가 8 1/10 일 볼륨 (10 μL)를 추가합니다. </li></ol></li><li> 단계 1.3에서 디자인 된 프라이머를 (샘플 프로토콜에 대한 표 8 및 9 참조)를 사용하여 영역에 PCR을 수행합니다. 개별 배아를 들어 DNA 1 μL는 PCR 반응에 충분하다. </li><li> 적절한 제한 효소로 생성 된 PCR 생성물을 소화하고 전기 영동하여 1.5 % 아가 로스 겔을 실행. <ol><li> 예를 들면, 주입 된 배아의 oculocutaneous 백색증 2 (oca2) 궤적 유전형에 0을 추가하여 제한 효소 BSR I을 사용하여 PCR 생성물을 소화2 시간 동안 65 ° C에서 배양 완성 된 PCR 반응의 12.5 μL에 BSR 직접 I의 0.5 μL. 소화되지 않은 및 겔에 소화 제품을 실행합니다. 제한 효소 저항 밴드 (즉, 소화되지 않는 밴드) TALEN에 의한 돌연변이가 존재한다 (그림 2) 있음을 나타냅니다. </li></ol></li><li> (선택적) 이전 29 바와 같이 각 밴드의 강도 값을 계산하기 위해 겔 분석 도구를 사용하여 피지 38 겔의 이미지를 분석하여 미가공 생성물의 비율을 측정하여 백분율 돌연변이 비율을 계산한다. </li><li> TA는 겔 정제 제한 효소 내성 돌연변이 밴드를 복제하고 클론을 시퀀싱하여 돌연변이 대립 유전자의 순서를 결정합니다. <ol><li> 젤은 제한이 제조업체의 지침에 따라 내성 돌연변이 밴드 효소 정화. TA는 제조업체의 지침에 따라 밴드를 복제. 식민지를 선택하고 진탕에서 37 ° C에서 1.5 ml의 LB O / N에서 성장부란기. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 미니 프렙 문화. 염기 서열의 DNA를 보냅니다. </li><li> 예컨대 APE 같은 프로그램을 이용하여 야생형 서열에 돌연변이 서열 정렬. <ol><li> 복사 및 APE 파일에 두 시퀀스를 붙여 넣습니다. &quot;도구&quot;메뉴에서 &quot;정렬 두 시퀀스&quot;도구를 선택합니다. </li><li> 드롭 다운 메뉴를 사용하여 두 개의 DNA 시퀀스를 지정합니다. 참고 : 복제 된 순서의 반대로 보완이 PCR은 클로닝 벡터에 들어갔다 방향에 따라 사용해야 할 수도 있습니다. 서열이 일치하지 않을 경우, &quot;정렬 DNA&quot;상자에서 &quot;계-COM&quot;확인란을 선택 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 적절한 단계에서 표현형 및 예상 표현형 (29)에 대한 적절한 방법 (예를 들어, 그림 3)를 사용 설립자 물고기를 평가합니다. 표현형의 방법은 protoc를 사용하여 연구원의 대상 유전자의 예상 표현형을 기반으로합니다올. </li></ol> 생식선 전송 6. 화면 참고 : A. mexicanus 4~8개월에서 성적 성숙에 도달. <ol><li> 야생형 물고기에 성적으로 성숙 설립자 물고기를 교차. </li><li> 화면 배아 또는 단계 5.1-5.7의 방법을 사용하여 성인 물고기 (그림 4). 성인 물고기 꼬리의 조각은 마취 다음 잘릴 수 있습니다. <ol><li> 핀 클리핑 동안 응력을 감소시키기 tricaine (3- 아미노 벤조산 에틸 에스테르)의 용액에 침지하여 생선 고기 마취. 핀 클리핑에 따라, 물고기가 민물에 복구 할 수 있습니다. 물고기는 빠르게 회복; 그들은 (일반적으로 수영) 회복 될 때까지 관찰합니다. </li></ol></li></ol>

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커다란 진보는 특성의 전개의 유전 적 기초를 이해 향해 최근에 이루어지고있다. 형질 다수의 진화를 기초 후보 유전자가 확인되었지만, 인해 가장 흥미로운 진화 종의 유전자 취급 용이성의 부족으로 생체 내에서 이들 유전자를 테스트 도전 남아있다. 여기에서 우리는 A의 게놈 편집하는 방법을보고 mexicanus, 종 동굴 동물의 진화를 연구하는 데 사용. 유전자지도는 1,21,23 연구와 후보 유전자 A. 동굴 형태 특성의 진화에 대한 후보 유전자의 숫자를 식별 한 19,40 접근 mexicanus. cavefish 게놈 (41)의 최근 간행물은 동굴 특성의 진화에 대한 후보 유전자를 식별하기위한 추가 강력한 도구를 제공합니다. 이들 후보 유전자의 대부분의 기능을 시험하는 유전자 발현을 감소시키는 기술이 필요하다. 연구를위한 유일한 현재 옵션A의 감소 유전자 발현을 보내고 <em...

특성 진화의 유전 적 기초를 이해하는 것은 진화 생물학의 중요한 연구 목표입니다. 상당한 진전이 특성의 진화를 기본 궤적을 확인하고 (실시 예 1-3)이 유전자좌에서의 후보 유전자를 정확히 파악을했다. 그러나, 기능적으로 이들 유전자의 역할 특성의 진화 연구에 사용 된 많은 유기체 도전 유지하고 테스트하는 것은 현재 유전자 취급 용이하지 않다. 게놈 편집 기술의 출현은 크게 유기체의 광범위한 유전 조작성 증가했다. 전사 활성화 제와 같은 이펙터 클레아 (TALENs) 및 클러스터 정기적 interspaced 짧은 반복 팔린 드롬 (CRISPRs)은 (실시 예 4-11) 유기체의 여러 유전자 ​​표적 돌연변이를 생성하기 위해 사용되어왔다. 진화론 관련 시스템에 적용이 도구는, 진화 생물 학자들이 진화의 유전 적 기초를 공부하는 방법을 혁신 할 수있는 잠재력을 가지고. 아 스티 아낙 스의 mexicanus는 두 가지 형태로 존재하는 물고기의 종입니다. 강에 사는 표면 형태 (표면 생선)과 여러 동굴 주거 형태 (cavefish) A. mexicanus의 cavefish은 (12에서 검토) 표면의 물고기 조상에서 진화. cavefish의 인구는 학교 행동의 감소, 증가 침략, 자세와 과식증 (13) 먹이의 변화로 동작 입맛과 두개골 neuromasts, 변화의 수를 증가, 감소 또는 색소 침착의 손실, 눈의 손실을 포함하여 특성의 숫자를 진화 -19. Cavefish 표면 물고기 interfertile, 그리고 유전자지도 실험은 동굴 특성 1,20-26에 대한 궤적 및 후보 유전자를 식별하기 위해 수행되었다. 일부 후보 유전자가 다른 종 (21)의 모델 생물 또는 과발현 27 또는 과도 최저 U에 의해, 세포 배양 1,19에서 동굴의 특성에 기여하는 기능 역할에 대해 테스트되었습니다A.에 morpholinos 28 노래 mexicanus. 그러나, 이러한 각각의 방법은 한계가있다. A. 이러한 유전자의 돌연변이 대립 유전자를 생성 할 수있는 능력 mexicanus는 cavefish의 발전에 그 기능을 이해하는데 중요하다. 따라서, A. mexicanus는 게놈 편집 기술의 응용 프로그램에 대한 이상적인 후보 유기체이다. 여기에서 우리는 A의 게놈 편집하는 방법을 간략하게 설명 mexicanus TALENs를 사용하여. 이 방법은 표현형에 대한 관심 (29)의 유전자 안정 돌연변이 물고기의 라인을 분리하기위한 모자이크 주입 설립자 물고기를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>주입 역</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>젤 기구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>바늘 끌어당기는 사람</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> 회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>참고: 우리가 아는 한, 달리 명시</td><td></td><td></td><td></td>되지 않는 한 다른 회사의 공급품을 사용할 수 있습니다</tr>. <tr><td>Golden Gate TALEN 및 TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents 미생물학 매체: LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 in 50% EtOH</td><td>Teknova (Fisher를 통해 주문)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>스펙티노마이신 디하이드로클로라이드, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼 암피실린(1,000x 솔루션)</td><td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Fisher를 통해 주문)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England Biolabs (Fisher를 통해 주문)</td><td>50-812-203</td><td>BsaI-HF가 아닌 BsaI를 사용하십시오(Golden Gate TALEN 및 TAL Effector Kit 프로토콜에 설명된 대로)</td></tr><tr><td>제한</td> 효소<td></td><td>가 제공되는</td><td>BSA New England Biolabs</td></tr><tr><td>10x T4 리가제 완충액</td><td>Promega(Fisher를 통해 주문)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega(Fisher를 통해 주문)</td><td>PRM7123</td><td>다른 Taq를 사용할 수 있지만 그에 따라 반응을 조정해야 합니다</td>.</tr><tr><td>퀵 ligation kit</td><td>New England Biolabs (Fisher를 통해 주문)</td><td>50-811-728</td><td>모든 TALEN 어셈블리 반응에 Quick Ligase를 사용합니다</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>기타 화학적 역량 세포 또는 수제 역량 세포를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Esp 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Fisher를 통해 주문FERER0451</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Safe ATP-dependent DNase</td><td>Epicentre (Fisher를 통해 주문)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Qiagen 키트는 초기 플라스미드 준비에 사용해야 합니다(Golden Gate TALEN 및 TAL Effector Kit 프로토콜에 설명된 대로)</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>Sac I</td><td>Promega (Fisher를 통해 주문)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 전사 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly 샘플 로딩 염료&nbsp;</td><td>앰비온 (피셔를 통해 주문)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (피셔를 통해 주문)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 일회용 소다석회 유리 파스퇴르 피펫</td><td>피셔</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>표준 유리 모세 필라리</td><td>세계 정밀 기기</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Femtojet Microinjector</td><td>Eppendorf(Fisher를 통해 주문)</td><td>용 팁E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

의 게놈 편집<em&gt; 아 스티 아낙 스의 mexicanus</em&gt; 사용 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (talens)

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

진화적 변화의 기저에 있는 유전자의 대립유전자를 식별하는 것은 진화가 어떻게 그리고 왜 일어나는지를 이해하는 데 필수적입니다. 이를 위해 최근의 많은 연구는 다양한 종에서 형질의 진화를 위한 후보 유전자를 식별하는 데 중점을 두었습니다. 그러나 최근까지만 해도 흥미로운 후보 유전자를 기능적으로 검증하는 것은 어려운 일이었습니다. 최근에 개발된 유전 공학 도구는 광범위한 유기체의 특정 유전자를 조작하는 것을 가능하게 합니다. 이 기술을 진화론적으로 관련된 유기체에 적용하면 진화에서 후보 유전자의 역할에 대한 전례 없는 통찰력을 얻을 수 있을 것입니다. Astyanax mexicanus (A. mexicanus)는 지표 거주 형태와 동굴 거주 형태를 모두 가진 물고기 종입니다. 동굴 거주 형태의 여러 독립적 인 계통은 조상 표면 물고기에서 진화했으며, 이들은 서로 간섭하고 지표 물고기와 간섭하여 동굴 특성의 유전 적 기초를 설명 할 수 있습니다. A. mexicanus는 여러 형질을 담당하는 후보 유전자를 식별하기 위한 연결 분석을 포함하여 여러 진화 연구에 사용되었습니다. 따라서 A. mexicanus는 후보 유전자의 역할을 테스트하기 위한 게놈 편집 응용 프로그램에 이상적인 시스템입니다. 여기에서는 전사 활성화제와 유사한 효과기 뉴클레아제(TALEN)를 사용하여 표면 A. mexicanus의 유전자를 돌연변이시키는 방법을 보고합니다. A. mexicanus에서 TALEN을 사용한 게놈 편집은 색소 유전자에서 돌연변이를 생성하는 데 활용되었습니다. 이 기술은 또한 A. mexicanus의 동굴 형태에서 진화한 다른 여러 형질에 대한 후보 유전자의 역할을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

TALEN 쌍 주사 (NHEJ)를 결합 비 상동 단부를 통해 복구 될 수 이중 가닥 나누기 39의 결과 FokI 따라서 도메인의 이량 체화를 특정 DNA 뉴클레오티드에 RVDS 바인딩을 초래한다. NHEJ 자주 삽입 또는 삭제 (삽입과 삭제)에서 발생하는 오류를 소개합니다. 삽입과 삭제가 TALEN 대상 부위 주변의 영역을 증폭하며 TALEN 스페이서 영역 내에서 절단하는 제한 효소로 생성 된 앰플 리콘 절단함으로써 식별 될 수있다. 대립 유전자는 제한 효소에 강한 밴드를 생성 (도 2) 소화되지 제한 효소 표적 서열을 변경 삽입과 삭제를 포함하면서 INDEL없는 대립 소화한다. TALEN 주사 가능성이 A의 biallelic 유전자 돌연변이가 발생할 수 있습니다...

유전자 돌연변이는 유전자 타겟팅 편집 기법을 사용하여 유기체의 광범위한 이제 가능하다. 여기, 우리는 아 스티 아낙 스 mexicanus, 표면 물고기와 cavefish를 포함 물고기의 종 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs) 등의 전사 활성을 이용하여 표적 유전자의 돌연변이 유발을위한 프로토콜을 보여줍니다.

의 게놈 편집<em&gt; 아 스티 아낙 스의 mexicanus</em&gt; 사용 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 동굴 물고기인 Astyanax mexicanus의 특정 유전자에 돌연변이를 도입하는 것입니다. 이 방법은 동굴 형질 진화의 유전적 기초에 관한 진화 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 유전자의 소실 효과를 Astyanax mexicanus에서 테스트할 수 있다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 전사 활성 유사 작동자 핵산가수분해효소(TALENs)를 설계 및 조립한 후, 2 µL의 Sac1을 사용하여 서열이 검증된 템플릿 4 µg을 37 °C에서 2시간 동안 제한효소 처리합니다. Sac1으로 처리된 플라스미드 2 µL를 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 단일 밴드가 나타나는지 확인함으로써 제한효소 처리가 완료되었는지 검증합니다. T3 mRNA 합성을 수행하려면, 표준 프로토콜에 따라 선형화된 템플릿 0.5 µg을 사용하여 하프 리액션(half reactions)을 준비합니다.37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 그다음 0.4 µL의 DNase를 첨가하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다. mRNA를 정제한 후, 품질을 확인하기 위해 RNase 오염을 제거하는 제품을 사용하여 겔 장치를 세척하십시오.그다음, 1.2% 겔을 준비합니다. mRNA 1 µL, nuclease-free water 4 µL, 그리고 glyoxal loading dye 5 µL를 혼합합니다. 시료를 50 °C에서 30분 동안 배양합니다.그 후 튜브를 짧게 원심 분리하고, 겔을 전기영동하기 전에 얼음에 둡니다. mRNA 농도를 확인한 후, -80 °C에서 보관하기 전에 분주하여 준비합니다. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.텍스트 프로토콜에 따라 주사 바늘과 플레이트를 준비한 후, 번식 3~4일 전부터 물고기에게 과식시켜 A.mexicanus의 산란을 유도하고 물고기를 신선한 물에 넣습니다. 수온을 2°F 높여 약 76°C로 맞춥니다. 15분마다 어두운 곳에서 수면에 알이 있는지 확인하고, 알이 수면에 달라붙는 것을 방지하기 위해 유리 볼로 옮깁니다.한 쌍의 표층어로부터 수백 개의 알을 얻을 수 있습니다. 현미경 하에서 분리된 알들을 선별하고, 1세포기 단계의 알들을 신선한 시스템수로 옮깁니다. 희석된 mRNA를 니들 후면에 로딩한 후, 니들을 마이크로인젝터에 장착합니다.그 다음, 핀셋을 사용하여 바늘을 부러뜨립니다. 바늘을 보정하기 위해

genome-editing-astyanax-mexicanus-using-transcription-activator-like

Research

연구

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Biology

생물학

이 동영상은 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 아연-핑거 뉴클레아제 기반 게놈 편집 기술을 보여줍니다. hPSC는 잠재적으로 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있기 때문에 이 기술은 환자 맞춤형 방식으로 체외 병리학 및 약리학 연구에 도움이 됩니다.

Zinc Finger Nuclease-based genome editing: double-stranded homology dependent repair mechanism에 의한 인간 만능 줄기세포의 게놈 수정 기법

아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다.

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

트랜스 제닉 조작 게놈 편집 기능적 유전자 및 시스 - 규정 요소의 역할을 테스트하기 위해 중요하다. 여기에 (TOL2 매개 형광 리포터 유전자 구조, TALENs 및 CRISPRs 포함) 유전자 변형의 발생에 대한 자세한 미세 주입 프로토콜은 긴급 모델 물고기의 큰가시 고기에 대한 표시됩니다.

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

여기, 우리가 첫 번째 코딩 exon 유전자의 전사 드라이버 대체 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 방법 제시. CRISPR/Cas9-기반 방법 대체 유전자의 생 규칙에서 transactivator 시퀀스를 장소 따라서 유전자 특정 spatiotemporal 패턴에 독점적으로 transctivator 식을 촉진 한다.

게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

진화 모델 시스템 Astyanax mexicanus유전자의 조작 방법을 설명합니다. 세 가지 다른 기술 설명: 중재 하는 Tol2 transgenesis, CRISPR/Cas9, 및 morpholinos를 사용 하 여 식의 최저 사용 하 여 게놈의 타겟된 조작. 이 도구는 기본 표면 및 동굴 주거 형태 사이의 변형 유전자의 직접 조사를 용이 해야.

멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작

여기에 제시된 프로토콜은 CAS9-gRNA 복합체를 척수 중앙 운하에 주입하고 전기 포공에 의해 액소로틀 척수에서 시간 및 공간 제한 유전자 녹아웃을 수행하는 프로토콜입니다.

CAS9 단백질-gRNA 복합체의 전기 포출을 통해 악소로틀 척수 신경 줄기 세포의 직접 유전자 녹아웃

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

난관 핵산 전달 을 통한 개선된 게놈 편집(I-GONAD) 방법의 효율성은 기증자 여성으로부터 접합체 수집을 하고 가성 임신 여성에게 이식해야 하는 기존 미세 주사와 비슷합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유도 돌연변이를 염색체 6의 ROSA26 유전자좌에 도입하여 그 효과를 입증합니다.

녹아웃 마우스 생성을 위한 난관 핵산 전달 기반 생체 내 전기천공 기술을 통한 개선된 게놈 편집

RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.

1차 포유류 세포에서 편집자 RNA의 전기천공을 통한 유전체 편집

학습하세요 TALEN을 이용한 Astyanax mexicanus 게놈 편집 방법으로 동굴 적응의 유전적 기초를 연구합니다. 이 기법은 진화생물학에서 특정 유전자 기능을 분석하는 데 활용됩니다.

의 게놈 편집

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