Name: 그램이시딘 기반의 형광 분석, 지질 이중층의 속성을 수정하는 작은 분자 잠재 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-13T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 학습하세요 그램이시딘 채널 활성을 형광 소광률 측정으로 분석하는 방법을 통해 약물 유발 지질 이중층 특성 변화를 평가하는 기술입니다. 이 분석법은 막 단백질과 약물 상호작용 연구에 활용됩니다.

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우리는 많은 자극 토론 마이클 J. 브루노, Radda Rusinova와 존 T. 색 감사합니다. NIH, R01GM021342와 아라 보완 R01GM021342 - 35S1, 그리고 OSA에 요시야 메이시, 주니어 재단에서 재정 지원, 트라이 - I HII위한 CMB 프로그램, 그리고 아이리스 L. 및 리버렛 S. 워스 의료 과학 원정대와 NIH MSTP 부여 RK위한 GM07739.

1. 개미 채워진 Liposomes를 생성 <ol><li> 1 일에, lipids에서 용매 유기를 제거합니다. </li><li> 냉동실에서 지방질을 제거하고 실내 온도 평형하자. </li><li> 25 MG / ML의 0.6 ML (1,2 - dierucoyl - SN - glycero - 3 - phosphocholine) 25 ML 라운드 바텀 플라스크에 클로로포름 용액에 지방질을 추가합니다. </li><li> 모든 클로로포름이 증발 및 지질 코팅 술병의 전체 아래쪽의 얇은 흰색 필름 때까지, 질소 하에서 건조하는 동안 지속적으로 휴대용 술병을 돌린다. </li><li> 하룻밤 진공 아래 dessicator에서 건조. </li></ol><ol><li> 일 2, vesicles에 통합 될 형광단와 샘플을 준비합니다. </li><li> 100 MM 나노 3, 25 MM 개미 (나 소금), 10 MM HEPES에 Rehydrate. 7.0 산도를 조정하는 HNO 3 NaOH를 사용합니다. 각각의 개미 분자 150 MM 총 2 나 +를 가지고 [나 +]. 10 MM의 지질 정지를 얻을 전해액의 1.671 ML을 추가합니다. </li><li> 철저하게 Parafilm 및 와동 정지. </li><li> 호일로 빛을에서 샘플을 보호하고 하룻밤 실온에서 나이를 보자. </li></ol><ol><li> 3 일에, 대형 unilamellar vesicles를 만들어 vesicles 외부에서 모두 형광단를 제거합니다. </li><li> 저전력 sonicator 1 분 Sonicate. </li><li> 동결 - 해동 샘플 5-6 시간, 드라이 아이스에 5 분, 따뜻한 (~ 50 ° C) 물에 5 분마다. </li><li> 아반티 미니 압출기를 사용하여 지질 현탁액을 돌출. 0.1 μm의 폴리 카보 네이트 필터 및 필터 지원 (자세한 내용은 압출기 설명서를 참조) 미니 압출기를 설정합니다. 앞뒤 정지가 반대 주사기에 끝이 같은 21 번 정학을 돌출. 여러 배치가 압출 때, 항상 같은 주사기로 샘플을로드해야합니다. 압출 동안 흐린 초기 지질 서스펜션은 (아직 인해 개미의 형광단에 노란색됩니다) 거의 반투명 될 것입니다. 압출 갑자기 쉽게되고 낮은 압력이 필터를 통해 이동하는 데 필요한 경우, 필터는 파열있을 수 및 교체해야합니다. </li><li> 중력 프로토콜을 사용 PD - 10 탈염 칼럼을 통해 압출 정지를 실행하여 외부 개미를 제거합니다. 나 - 버퍼의 20-30 ML와 열 평형 (140 MM 나노 3, 10 MM HEPES, pH를 7.0, 산도를 조정하는 HNO 3 NaOH를 사용해야합니다.) 그 결과 해당 컬럼에 대한 압출 지질 정지의 1.5 ML를 추가하고 1 ML 나 버퍼를 추가하여 2.5 ML 샘플의 전체 볼륨을 가지고 인치 침투하자. 버퍼가 완전히 열에 통합되고 아무것도 밖으로 누출되지 않습니다 후에 나 - 버퍼 3 ML과 liposomes을 elute 및 결과 샘플을 수집합니다. 채워진 결과 개미 주식 솔루션 4-5 MM의 lipids에 대한 포함하고 반투명 유백 색의 흰색 나타납니다 LUV. 호일과 빛의에서 샘플을 보호합니다. </li><li> 13 주식 솔루션은 즉시 사용하지 않을 경우, 저장 ° 칠일의 최대 C. 경고 : 고정 또는 크리스탈 상 전이 온도 (~ 12 ° C),이 vesicles '무결성을 파괴하고 형광단가 누출되므로 액체 아래 지질 솔루션을 냉각하지 않습니다. </li></ol> 2. 믹스 형광 솔루션 <ol><li> 24 시간 전에 사용 liposomes를 희석하여 (13 ° C에서) 그램이시딘와 부화. 지질 vesicles '내부와 외부 monolayers 사이 그램이시딘의 평균은 긴 부화가 필요 느린 과정이다. </li><li> 철저하게 와동 LUVs가 밀도&gt; 1 G / ML이 같은 재고 솔루션을 LUV 개미 가득한 것이고, 따라서 침전 솔루션 인치 </li><li> 믹스 개미 - 채워진 나 버퍼의 재고 1시 20분를 LUV. 샘플 균일성 향상을위한 하나의 플라스크에서 함께 실험 중 하나가 하루에 사용하는 모든 liposomes를 섞습니다. </li><li> liposomes 3 / 4 밖으로 분리하고 260 nm의 그램이시딘 DMSO에 미리 희석을 (500 μg / ML)을 추가합니다. </li><li> 하기 위해 1 / 4 모든 샘플의 용매 농도가 일정하게 유지하는 DMSO의 동일한 음량을 (그램이시딘없이) 추가 남아 있습니다. </li></ol> 3. 형광 악기 설정 <ol><li> 우리는 형광 담금질의 속도를 측정하기 위해 온도 제어 응용 Photophysics SX.20 중지 흐름 spectrofluorometer를 사용합니다. </li><li> 따뜻한 최대 허용 미리 시간에 악기를 켭니다. 구성 요소는 다음과 같습니다 컴퓨터, 전자 제어 장치, 물 욕조 (쿨러 및 히터 모두), 램프 전원 공급 장치 및 질소 탱크. </li><li> 프로 데이터 SX 소프트웨어를 사용하여 녹음 조건을 설정합니다. </li><li> 여기 일분의 일 수있는 단색의 여기 파장 352 nm의 및 슬릿 폭 apertures로 설정합니다. </li><li> 방출을 기록하기 = 455 nm의 높은 패스 필터 λ를 사용하십시오. </li><li> 녹음 중에 질소 압력을 유지하기 위해 악기를 가능하게하기 때문에 처음 몇 밀리초 동안 압력 oscillations (및 녹화 유물)를 방지 "압력 대기"설정을 사용합니다. </li><li> "티 세트나에게 5000 포인트 ""1 S하고. " </li><li> 반복 상자를 사용하여 반복의 수를 조정, 일반적으로 우리가 각각 버퍼와 끄는 프로그램 실행 9 13 반복을 사용합니다. </li><li> 물 목욕 온도가 25로 설정되어야 ° C; 온도 SX 소프트웨어에서 모니터해야합니다. </li><li> 때마다 악기, 샘플을 실행 그것이 두 개의 주사기 각 60 μL를 혼합 즉, 120 μL에 드라이브 볼륨을 설정합니다. 이 기기 설치와 함께, 120 μL 볼륨 ≈ 1.2 MS의 죽은 시간을 제공합니다. </li><li> 8 시경으로 개미 - 리포좀의 출력에 대한 형광 검출기에 고전압 (게인)을 조정합니다. 표준 실험 혼합물에 대한 이득은 400-420해야 V. 마약은 형광 그들이 형광 신호를 포화 수와 같은 수 있습니다. 이러한 경우에는 게인 / 전압은 감소한다. </li><li> 항상 오른쪽 주사기의 왼쪽 주사기 및 버퍼 / 끄는에 형광 샘플을로드합니다. 철저하게 와동에 있는지 확인합니다 모든 로딩하기 전에 liposomes가 포함된 샘플, 시간과 LUVs가 주사기에 정착됩니다 점에 유의하십시오. </li></ol> 4. 실험을하는 <ol><li> 와 개미 - 로드된 LUVs의 샘플을 준비 나 버퍼 또는 TL - 끄는 (50 MM TlNO 3, 94 MM 나노 3, 산도 7.0 10 MM HEPES) 중 하나와 함께 spectrofluorometer에 용매 또는 화합물, 그리고 부하 ​​중 하나. </li><li> 1.5 ML 희석 사용 또는 그램이시딘없이 솔루션을 개미가 - LUV 전날 준비. </li><li> 원하는 농도의 화합물 또는 컨트롤에 대한 용매를 추가합니다. 모든 샘플에 걸쳐 최소 및 상수에 용매 농도를 유지. 농도 원하는 복용량 - 반응 범위를 달성하기 위해 새로운 (알 수 없음) 화합물로 조정해야합니다. 25 10 분 품어 ° C를 어둠에 약해. </li><li> 와동이 샘플을 LUV하고 왼쪽 주사기로로드합니다. 오른쪽 주사기로 나 버퍼 또는 TL - 끄는를로드합니다. </li><li> 철저하게 앞뒤로 주사기를 밀어 두 샘플에서 기포를 제거합니다. </li><li> 두 주사기가 밸브를 닫기 전에 마찬가지로로드되어 있는지 확인하십시오. 그들은 기록 챔버에 도달하기 전에 등한 로딩이 솔루션 미리 혼합 발생합니다. </li><li> 처음 샘플 들어, 나 버퍼로 형광을 기록 4 번 반복 필요한 높은 전압 (게인)을 조정하고, 5 번 반복합니다. </li><li> 나 - 버퍼 나머지 샘플, 기록 구 반복하십시오. </li><li> TL - 끄는 및 기록 13 반복과 나 버퍼를 교체하십시오. </li><li> 물로 씻어 다음 예제를 계속합니다. 용매와도 그램이시딘하고, 최대 화합물 농도와 노 그램이시딘과를 그램이시딘 및 용매 모두 : 우리가 샘플을 사용하지 컨트롤로. </li></ol> 5. 분석 데이터 <ol><li> 분석 컴퓨터에 결과를 전송합니다. 분석을위한 MATLAB으로 모든 데이터를 읽습니다. 이들은 혼합 유물을 포함하는 각 샘플의 경우, 각각의 경우에 처음 네 제외한 모든 버퍼와 끄는 반복에 참조하십시오. 그것이 완전히 정지 흐름 튜브에서 이전 혼합물을 취소하고 좀 덜보다 4 샷을 소요 120 μL의 드라이브 볼륨을 가정. </li><li> 모든 샘플에 대한 버퍼 반복은 매우 유사합니다. 화합물 농도에 따라 형광 신호에 상당한 변화가있다면 다음 화합물 자체는 형광 수 있으며 먼저 샘플을 정규화하기 전에 여분의 형광 신호를 뺄 필요가있을 수도 있습니다. </li><li> 수동으로 흔적을 통해 이동하여 "나쁜"반복 제거 : 혼합 유물 및 / 또는 거품에 의한 다중 exponentiality에서 스파이크 또는 편차를 포함하는 반복합니다. </li><li> 각 샘플에 대한 버퍼 반복의 평균 시작 값으로 끄는 반복을 정상화. 시각화를 하나의 그래프로 모든 샘플의 평균을 결합합니다. </li><li> 노 그램이시딘로 기록된 흔적은 유사하고 거의 형광 담금질을 보여주지해야한다 TL의 누출을 늦추기 위해 + vesicles 이중층 8 의한 형광 신호의 속도 감소가있을 수 있습니다. 노 그램이시딘없이 수정자와 함께 샘플 상당한 담금질가 표시되면 다음 vesicles이 악화하고 더 이상 사용할 수 없습니다. 노 그램이시딘로하지만 수정자와 샘플이 중요한 담금질을 보여주면, 수정자는 형광단이나 빛 따위를 끄는가 이중층를 건너 수 있습니다 그러한 정도로 vesicles의 이중층을 perturbs. </li><li> 화합물은 지질 이중층의 속성을 바꿀지도 모르겠어 경우로 그램이시딘 채널에 의해 감지, 형광 시간 과정은 가시 변경됩니다. </li><li> 각 샘플의 경우, 뻗어 지수 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="방정식 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식 1"> 예 4) 각 반복의 표준 형광 담금질 곡선의 첫 번째 2-100 MS와 속도에 맞는 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 4이 MS에서 계산. 평균 및 표준 편차는 모두 각각의 반복에서 주어진 시료에 대해 계산됩니다. </li><li> 마지막으로, 그램이시딘없이 수정자를 가지고 시간에 가장 가까운 제어 샘플을 정규화하여 담금질 속도의 상대적인 변화를 결정합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 형광 담금질 기반 분석의 요점은 지질 이중층 특성의 변화를 감지하기 위해 왼쪽 상단 :. 확대의 내부와 밖에서 나노 3 + TlNO 3 개미 플러스 나노 3 단일 지질 소포에. 오른쪽 상단 : 끄는 및 87, 260 및 780 나노미터 그램이시딘으로 미리 도핑된와 끄는 함께 끄는없이 (위에서 아래 양식) 개미 - 채워진 vesicles를 사용하여 기록 형광 신호. 하단 : 정지 흐름 혼합 챔버의 도식 표현. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 실험 설정의 설명에 언급된 다양한 패널을 보여주는 프로 데이터 SX 소프트웨어의 스크린 샷을. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 :.들이 혼합 유물을 포함하는 등 나 버퍼와 개미 -로드 LUVs에서 형광 신호의 여러 반복 결정은 처음 네 반복은 항상 제외됩니다. 혼합 세포에 샘플 주사기를 연결하는 튜브는 정의된 볼륨을 가지고, 따라서 처음 몇 반복은 우리에게 튜브 이전에 있었는지의 독서를 줄 것이다 : 물을 반복 1과 2를 반복합니다 3 물 샘플의 일부 조합에 대한 나머지 반복을위한 반복 4 단 샘플에 대한 대부분 샘플. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 :. 나 버퍼과 TL - 끄는와 개미 -로드 LUVs에서 형광 신호의 여러 반복 결정은 처음 네 반복이 두 조건에서 삭제되었습니다. 또한, TL - 끄는 측정, 유물, 가능성이 가장 높은 기포로 인해 제거 8 요구를 반복합니다. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> . 그림 5 : 개미 형광 담금질의 시간 코스에 capsaicin (CAP)의 효과 (1) S 이상의 표준화 형광 신호, 회색 점들은 모든 반복 (N&gt; 5 조건 당)의 결과를 나타내는, 빨간색 라인은 모두의 평균을 나타냅니다 반복합니다. (B) 처음 100 MS는 회색 점들은 각 조건에 대한 단일 반복의 결과를 나타내는, 빨간색 라인은 지수 맞는 (2-100 MS) 늘어 이들 반복을합니다. stippled 파란색 라인은 2 MS 마크 담금질의 속도가 결정됩니다되는 시간을 나타냅니다. A와 B 모두에서 최고의 추적 TL이없는 결과를 보여줍니다 +; 다음 두 자취는 TL과 함께, GA의 부재에서 결과를 표시 + ± 모자, 네 개의 낮은 흔적은 260 nm의 GA 및 TL +, 어디로 결과를 표시 번호 μm의의 [모자]를 상징. 로 늘어 지수의 속도에 의해 결정 0, 10, 30 90 μm의 모자, 위해 담금질의 가격 36아르 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 247 ± 27 (± SD, N&gt; 8을 의미) 각각.

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</ol>

원고에 설명되어있는 방법을 다루고 임시 특허 신청이 접수되었습니다. 공동 발명가는 HII 및 OSA 있습니다.

우리는 마약과 기타 소형 amphiphiles의 이중층 수정 가능성을 판단하는 빠른 형광 기반의 분석을 증명하고있다. 이중층의 속성을 수정 화합물 가능성이 &quot;오프 대상&quot;약물 효과에 기여, 간접, 특이 현상이 방식으로 막 단백질 기능을 변경할 수있다. 분석은 이중층 - 스패닝 단백질에 의해 감지 아르 이중층 등록 정보의 변경 12 프로브로 그램이시딘 채널의 전원을 이용. 형광 기반의 분석을 사용하여 얻어진 결과는이 방법이 아니라 심사 화합물 라이브러리와 같은 기계론의 연구에 사용될 수 있다고 나타내는 단일 채널 GA 실험 12 결과와 좋은 계약에 있습니다. 우리가 단일 채널 접근법을 사용 가능한 크기보다 높은 처리량의 1 - 2 주문입니다 화합물 수십 일을 테스트할 수 분석의 현재 구성을 사용합니다. 더 근본이 없습니다 속도 - 제한 그것이 진정한 높은 처리량 모드에서 실행하도록 확장될 수 있습니다 즉, 형광 기반의 분석 단계가 있습니다. 분석의 전해질 솔루션을 다양 및 ...

<table><tbody><tr><td>ANTS</td><td>Invitrogen</td><td>A-350</td><td></td></tr><tr><td>그라미시딘(gramicidin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-5002</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850398C</td><td></td></tr><tr><td>미니 압출기 키트(Mini-Extruder kit)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 탈염 컬럼(PD-10 Desalting column)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54805</td><td></td></tr></tbody></table>

그램이시딘 기반의 형광 분석, 지질 이중층의 속성을 수정하는 작은 분자 잠재 결정

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

생물 학적 기능을 조절하는 데 사용되는 많은 약물 및 다른 작은 분자는 이중층 / 솔루션 인터페이스에서, 따라서 adsorb은 지질 이중층의 속성을 변경되는 amphiphiles 있습니다. 막 단백질은 소수성 상호 작용을 정력적으로 자신의 호스트 이중층에 결합되기 때문에 이것은 중요합니다. 이중층 등록 정보에 변경 따라서 단백질 기능 및 &quot;오프 대상&quot;약물 효과에 대한 가능한 메커니즘을 조절하는 amphiphiles에 대한 간접적인 방법을 제공 막 단백질 기능을 변경할 수 있습니다. 우리는 이전에 프로브 3,12과 같은 선형 그램이시딘 채널을 사용하여 지질 이중층 등록 정보에서 변경을 검출 electrophysiological 분석을 개발했습니다. 그램이시딘 채널은 두 아닌 수행 subunits의 transbilayer dimerization에 의해 형성 미니 단백질입니다. 그들은 지질 이중층 등록 정보 모니터링 변화를위한 강력한 프로브과 같이 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지하게 자신의 멤브레인 환경의 변화에​​ 민감합니다. 우리는 지금 프로브와 같은 채널을 사용하여 이중층 속성의 변화를 검출 형광 분석을 보여줍니다. 분석은 그램이시딘 채널을 통해 끄는의 항목으로 인해 형광단 - 로드된 대형 unilamellar vesicles에서 형광의 담금질의 시간 코스를 측정을 기반으로합니다. 우리는 형광 표시 / 빛 따위를 끄는 쌍을 사용하여 8 aminonaphthalene - 1 ,3,6 - trisulfonate (개미) / TL + 성공적으로 다른 형광 담금질의 assays 5,13에서 사용되었는지. TL + 천천히 8 지질 이중층을 permeates하지만 그램이시딘 채널 1,14를 실시를 통해 쉽게 전달합니다. 방법은 기계론의 연구와 이중층 - perturbing하고, 잠재적인 &quot;오프 대상&quot;효과에 대한 작은 분자의 높은 처리량 검사를 모두 확장하고 적합합니다. 우리는이 방법을 사용하여 결과를 이전 electrophysiological 결과 12 좋은 계약에다는 것을 찾을 수 있습니다.

우리는 그램이시딘 채널 활동의 조치로 형광 담금질의 속도를 모니터링 빠른 형광 기반의 분석을 소개합니다. 그램이시딘 채널 지질 이중층 속성의 변화로 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지를 모니터링하는 분자 힘 변환기로 사용됩니다.

생물학적 기능을 조절하는 데 사용되는 많은 약물 및 기타 소분자들은 양친매성 물질로, 이들은 이중층/용액 계면에 흡착되어 ...을(를) 변화시킵니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 이중층 가로지르는 단백질(bilayer spanning proteins)에 의해 감지되는, 약물로 유도된 이중층 특성 변화를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 형광 물질이 적재된 대형 단방향 소포(large unilateral vesicles)를 제작함으로써 달성됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 소포에 gramin을 도핑하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 외부 소광제(quencher)를 첨가하고 내부 형광체의 소광 속도를 측정하는 것입니다. 넷째, 절차의 마지막 단계는 형광 시간 경과 곡선에 신축 지수 함수(stretched exponential function)를 피팅하여 gramin 활성에 따른 형광 소광의 변화를 정량화하는 것입니다. 최종적으로, amfi 파일이 지질 이중층 특성을 변화시킬 수 있는지 평가하기 위한 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 Ola Anderson입니다. 안녕하세요, 저는 Helson입니다. 안녕하세요, 저는 Richie Kapo입니다.저는 Weill Cornell Medical College 생리학 및 생물물리학과의 Olaf Anderson 박사 연구실 소속 Leah Sanford입니다. 오늘은 지질 이중층 특성의 변화를 측정하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 약물과 저분자 화합물이 지질 이중층 특성에 미치는 영향을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작해 보겠습니다. 이 절차의 첫째 날에는 냉동고에서 지질을 꺼내 실온에서 평형을 맞춥니다. 평형이 맞춰지면, 25 mL 라운드 바텀 플라스크에 25 mg/mL 농도의 지질 및 클로로포름 용액 0.6 mL를 넣습니다. 그런 다음 모든 클로로포름이 증발할 때까지 플라스크를 계속 회전시키면서 질소 가스 하에서 용액을 건조시킵니다.지질의 얇은 흰색 막이 플라스크의 하단 전체를 덮고 있으며, 진공 데시케이터에서 하룻밤 동안 지질을 추가로 건조합니다. 100 mM sodium nitrate, 25 mM ANTS 및 pH 7의 10 mM HEPES 용액을 준비합니다. 이 용액의 pH를 조절할 때 염화물을 함유한 용액은 사용하지 마십시오.탈륨 퀀처(thallium Quencher)가 이틀째 되는 날 염화물과 불용성 복합체를 형성하므로, 1.67 mL의 전해질 용액으로 지질을 재수화하여 10 mM 지질 현탁액을 만듭니다. 적정 농도에 도달하면 파라필름으로 덮고 현탁액을 충분히 볼텍싱한 후, 알루미늄 호일로 시료를 빛으로부터 보호하여 상온에서 하룻밤 동안 숙성시킵니다.3일 차에, 저출력 초음파 처리기로 혼합물을 1분 동안 초음파 처리합니다. 그 다음, 드라이아이스에서 5분, 온수에서 5분 순으로 샘플을 동결-융해시키며, 이 동결-융해 사이클을 4~5회 반복합니다. Avanti mini extruder를 사용하여 지질 현탁액을 압출합니다.0.1 micron 폴리카보네이트 필터와 필터 지지대를 장착하여 미니 압출기를 설정하고, 반투명한 현탁액이 반대편 시린지에 담길 때까지 현탁액을 21회 왕복 압출하여 대형 단일층 소포(LUV) 현탁액을 제조합니다. 나트륨 완충액으로 평형화된 PD 10 탈염 컬럼에 압출된 현탁액을 통과시켜 외부의 ANTS를 제거합니다. LUV 현탁액 1.5 mL와 나트륨 완충액 1 mL를 컬럼에 추가합니다.용액이 컬럼에 완전히 흡수되면, 3 mL의 소듐 버퍼로 리포좀을 용출시키고 용출액을 수집합니다. 생성된 A NTS 충전 LUV 스톡 용액은 약 4~5 mM의 지질을 함유해야 하며, 반투명한 우윳빛 흰색으로 보여야 합니다.용액을 알루미늄 호일로 감싸 빛을 차단하고 13 °C에서 보관하며, 사용 24시간 전에 충분히 볼텍싱하십시오. A NTS로 충전된 LUV 스톡 용액. UUV는 밀도가 1 g/mL보다 크므로 침전될 수 있습니다.그 다음, A NTS가 충전된 LUV 스톡 용액을 소듐 버퍼로 1:20으로 희석합니다. 리포좀의 4분의 3 양을 DMSO에 녹인 260 nanogram의 abidin과 함께 배양합니다. 나머지 4분의 1 양에는 gramin이 포함되지 않은 동일한 부피의 DMSO를 첨가합니다.모든 샘플의 용매 농도를 일정하게 유지하기 위해, 13 °C에서 24시간 동안 그라민(gramin)이 지질 소포의 내측 및 외측 단분자층 사이에서 평형을 이루도록 합니다. 여기서는 온도 제어 기능이 있는 Applied Photophysics SX point 20 stopped flow 분광 형광 광도계를 사용하여 형광 소광 속도를 측정합니다. 시작하기 전, 기기 예열을 위해 한 시간 전에 전원을 켭니다.들뜸을 위한 슬릿 너비는 1/1로 설정해야 하며, pro data SX 소프트웨어를 사용하여 방출을 기록할 때는 455 nm 하이패스 필터를 사용해야 합니다. 기록 조건을 먼저 설정하고, 단색화 장치의 들뜸 파장을 352 nm로 설정하십시오. 압력 유지 설정을 사용하십시오.시간을 1초로, 포인트 수를 5,000으로 설정하십시오. 반복 횟수는 버퍼 런의 경우 9회로, 퀀처 런의 경우 13회로 조정하십시오. Essex 소프트웨어의 check drive 프로파일에서 온도를 모니터링하십시오.구동 부피는 각 시린지에서 60 µL씩 혼합되는 120 µL로 설정해야 합니다. 이렇게 하면 데드 타임(dead time)은 약 1.2 ms가 됩니다. 형광 검출기의 고전압 또는 게인을 약 420 V로 조정하십시오.목표는 약 8의 형광 읽기 값을 얻는 것입니다. 이전에 준비한 NTS가 로딩된 UUV를 암조건의 25 °C에서 10분 동안 평형화합니다. 평형화가 완료되면 샘플을 볼텍싱한 후 왼쪽 시린지에 로딩합니다. 오른쪽 시린지에는 나트륨 완충액 또는 thallium Quencher를 로딩합니다.시린지를 앞뒤로 밀어 기포를 모두 제거합니다. 두 시린지에는 동일한 양이 충전되어야 합니다. 첫 번째 샘플을 위해 밸브를 닫기 전, 소듐 버퍼로 형광을 기록하십시오.네 번 반복하고 필요에 따라 게인을 조정하십시오. 그런 다음 나머지 샘플에 대해 다섯 번 더 반복하십시오. 나트륨 완충액으로 9회 반복 측정하여 기록하십시오.나트륨 완충액을 탈륨 퀀처(thallium quencher)로 교체하고 13회 반복 측정합니다. 물로 헹구고 다음 샘플 대조군 측정을 계속합니다. 그라민(gramin)과 용매가 없는 샘플, 그리고 그라민은 없으나 화합물 농도가 최대인 샘플을 포함하십시오.형광 분석 후 gramin과 용매 모두에 대해 데이터를 MATLAB 소프트웨어로 읽어 분석합니다. 읽어 들인 각 샘플의 모든 완충액 및 소광제 반복 측정값 중에서, 처음 4회의 반복 측정값은 튜브 내에 이전에 남아 있던 물질에 의해 오염될 수 있습니다. 이 경우, 신호는 나트륨 완충액 샘플이 이전 세척 단계의 물과 혼합되면서 발생합니다.5회부터 9회까지의 반복 측정값은 샘플 단독의 신호를 나타냅니다. 따라서 각 경우에서 처음 4회의 반복 측정값은 항상 제외합니다. 혼합으로 인한 인위적 오류를 방지하기 위해, 트레이스를 수동으로 검토하여 혼합 오류나 기포로 인해 스파이크 또는 편차가 발생한 빨간색 트레이스와 같이 상태가 좋지 않은 반복 측정값을 제거하십시오.그 다음, 각 실험 조건의 각 샘플에 대해 퀀처 반복 측정값을 버퍼 반복 측정값의 평균 시작 값으로 정규화하고, 모든 샘플의 평균을 하나의 그래프로 통합합니다. 그라민(gramine)이 없는 시각화 샘플들은 모두 유사해야 하며 형광 소광이 거의 나타나지 않아야 합니다. 그람시딘(gramicidin)이 포함된 샘플의 경우, 탈륨 이온이 소포 내부로 천천히 유입됨에 따라 형광 신호가 서서히 감소합니다. 화합물에 의해 형광 시간 경과 곡선이 눈에 띄게 변화했다면, 해당 화합물이 테스트 농도에서 지질 이중층의 특성을 변화시킨 것입니다. 다음으로, 정규화된 형광 소광 곡선의 초기 2~100ms 구간에 스트레치 지수 함수(stretched exponential)를 피팅합니다.개별 반복 실험에 대해 2밀리초에서의 속도를 계산하십시오. 그런 다음 개별 반복 실험 값을 바탕으로 주어진 시료의 평균과 표준 편차를 계산하십시오. 여기서 cap으로 표시된 캡사이신의 효과를 ga로 표시된 그라민의 부재 또는 존재 하에서의 형광 소광 시간 경과에 따라 관찰하였습니다. 정규화된 형광 신호가 여기의 1초 동안 나타나 있습니다. 회색 점은 모든 반복 실험의 결과를 나타내며, 빨간색 선은 평균값을 나타냅니다.정규화된 형광 신호의 처음 100 밀리초가 표시되어 있습니다. 회색 점은 각 조건에 대한 단일 반복 결과입니다. 빨간색 선은 해당 반복 횟수에 대한 신축 지수 피팅(stretched exponential fits) 결과입니다.점선으로 표시된 파란색 선은 2ms 지점을 나타내며, 이 시점에서 소광 속도를 측정합니다. 소광 속도의 상대적 변화는 gramin만 포함하고 수정제가 없는 대조군 샘플을 기준으로 데이터를 정규화하여 결정합니다.캡사이신이 지질 이중층에 흡수되면 이중층의 특성이 변화합니다. 이중층이 더 유연하게 변함에 따라, 모노머-다이머 평형(mono dimer equilibrium)의 그램 측(gram side)이 전도성 다이머 쪽으로 치우치는 변화가 나타납니다. 지금까지 소분자가 지질 이중층을 교란하는 효과를 측정하는 절차를 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때는 동일한 배치의 소포를 사용하여 각 실험에 적절한 대조군을 사용하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모두 마쳤습니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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