그램이시딘 기반의 형광 분석, 지질 이중층의 속성을 수정하는 작은 분자 잠재 결정

이 절차의 전반적인 목표는 이중층 확장 단백질에 의해 감지된 이중층 특성의 약물 유도 변화를 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 Fluor가 로드된 대형 편측 슬레를 만들어 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 소포에 그라민을 도핑하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 외부 담금질제를 추가하고 내부 불소의 담금질 속도를 측정하는 것입니다. 4. 절차의 마지막 단계는 형광 시간 과정에 스트레치된 지수 함수를 피팅하여 그램당 형광 담금질 활성의 변화를 정량화하는 것입니다. 궁극적으로 amfi 파일이 지질 이중층 특성을 변경할 수 있는지 여부를 평가하기 위한 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 올라 앤더슨입니다. 안녕하세요, 저는 헬슨입니다. 안녕하세요, 저는 Richie Kapo입니다.

저는 웨일 코넬 의과대학 생리학 및 생물물리학과 올라프 앤더슨 박사 연구실의 리아 샌포드입니다. 오늘은 지질 바이오 층 특성의 변화를 측정하는 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 약물 및 소분자가 지질 bilar 특성에 미치는 영향을 연구합니다.

시작하겠습니다: 이 절차의 첫날에는 냉동실에서 지질을 제거하고 실온과 평형을 이루도록 합니다. 평형이 되면 25ml의 둥근 바닥 플라스크에 0.6ml의 25mg, 지질 및 클로로포름 용액을 추가합니다. 그런 다음 모든 클로로포름이 증발할 때까지 플라스크를 계속 회전시키면서 질소 가스로 용액을 건조합니다.

그리고 얇은 흰색 지질 막이 플라스크의 하반부 전체를 코팅하고 밤새 진공 상태에서 건조제에서 지질을 더 건조시킵니다. 100 밀리몰 질산 나트륨 25 밀리 몰, NTS 및 10 밀리 몰 pH 7의 HEP 용액을 준비합니다. 이 용액의 pH를 조정할 때 염화물이 포함된 용액을 피하십시오.

탈륨 소광이 2일차에 염화물과 불용성 복합체를 형성하므로 1.67로 지질을 재수화합니다. 이 전해질 용액 1ml를 사용하면 10밀리몰의 지질 현탁액을 얻을 수 있습니다. 정확한 농도에 도달하면 파라 필름으로 덮고 현탁액을 와류로 덮고 호일로 샘플을 빛으로부터 철저히 보호하고 밤새 실온에서 숙성시킵니다.

3일째에는 저출력 초음파 처리에서 1분 동안 혼합물을 초음파 처리합니다. 그런 다음 드라이 아이스에서 5 분 동안 샘플을 동결 해동 한 다음 따뜻한 물에서 5 분 동안 동결 해동을하고 동결 해동 주기를 4-5 회 반복합니다. Avanti 미니 압출기를 사용하여 지질 현탁액을 압출합니다.

0.1 미크론 폴리카보네이트 필터로 미니 압출기를 설정하고 필터 지지대를 앞뒤로 21번 돌출시켜 거의 반투명한 현탁액이 반대쪽 주사기에서 끝나도록 하여 큰 울라성 소포 또는 LUV 현탁액을 만듭니다. 나트륨 완충액과 평형을 이룬 PD 10 duling 컬럼 위에 압출 현탁액을 실행하여 외부 A NTS를 제거합니다. 1.5ml의 LUV 현탁액과 1ml의 나트륨 완충액을 컬럼에 추가합니다.

용액이 컬럼에 완전히 통합되면 3ml의 나트륨 완충액으로 리포좀을 용리하고 용리액을 수집합니다. 생성된 A NTS 충전 LUV 원액은 약 4-5밀리몰의 지질을 함유하고 반투명하게 보여야 합니다. 유백색.

호일로 용액을 빛으로부터 보호하고 완전히 와류를 사용하기 24 시간 전에 섭씨 13도에서 보관하십시오. NTS는 LUV 스톡 솔루션을 채웠습니다. UUV는 밀리리터 및/또는 퇴적물당 1g보다 큰 밀도를 가지고 있습니다.

그런 다음 NTS로 채워진 LUV 원액을 희석합니다. 나트륨 완충액이 있는 1-20은 DMSO에서 260나노그램 아비딘으로 리포좀의 3/4을 배양합니다. 그라민이 없는 동일한 부피의 DMSO를 나머지 1/4에 추가합니다.

모든 샘플에서 용매 농도를 일정하게 유지하려면 그라민이 섭씨 13도에서 24시간 동안 지질 소포 내부 및 외부 단층 사이에서 평형을 이루도록 합니다. 여기서, 온도 제어 기능이 있는 적용된 photophysics SX point 20 정지 흐름 분광 형광계는 형광 소광 속도를 측정하는 데 사용됩니다. 시작하려면 악기 워밍업을 위해 한 시간 전에 악기를 켜십시오.

여기(excitation)를 위한 보고관이 있는 슬릿은 1개의 슬래시 1이어야 하며, 4개의 55 나노미터 고역 통과 필터는 pro data SX 소프트웨어를 사용하여 방출을 기록해야 합니다. 먼저 기록 조건을 설정하고 모노크로메이터 여기 파장을 3 52나노미터로 설정합니다. 압력 유지 설정을 사용합니다.

시간을 1초로 설정하고 5, 000을 가리킵니다. 버퍼 실행의 경우 반복 횟수를 9로, 담금질 실행의 경우 13으로 조정합니다. Essex 소프트웨어 검사 드라이브 프로필에서 온도를 모니터링합니다.

구동 볼륨은 120마이크로리터로 설정해야 하며, 각 주사기에서 60마이크로리터를 혼합해야 합니다. 이렇게 하면 약 1.2밀리초의 데드 타임이 제공됩니다. 형광 검출기의 고전압 또는 게인을 약 420볼트로 조정합니다.

목표는 이전에 준비된 A NTS가 어둠 속에서 섭씨 25도에서 10분 동안 UUV를 로드한 약 8 평형의 형광 판독값을 얻는 것입니다. 평형을 이루면 샘플을 와류로 만든 다음 왼쪽 주사기에 로드합니다. 올바른 주사기 부하에는 나트륨 완충액 또는 탈륨이 있습니다. 담금질제.

주사기를 앞뒤로 밀어 기포를 제거합니다. 두 주사기는 동일하게 적재되어야 합니다. 첫 번째 샘플에 대한 밸브를 닫기 전에 나트륨 완충액으로 형광을 기록합니다.

네 번 반복하고 필요에 따라 게인을 조정합니다. 그런 다음 나머지 샘플에 대해 5회 더 반복합니다. 나트륨 완충액으로 9회 반복을 기록합니다.

나트륨 완충액을 탈륨 소광제(thallium quencher)로 교체하고 13회 반복을 기록합니다. 물로 헹구고 다음 샘플 컨트롤을 계속합니다. 그라민이 없고 용매가 있는 샘플, 그라민이 없고 최대 화합물 농도가 있는 샘플을 포함합니다.

그리고 형광 분석 후 그라민과 용매를 모두 사용하여 분석을 위해 MATLAB 소프트웨어로 데이터를 읽어 들입니다. 모든 버퍼 및 소광제 반복에서 판독된 각 샘플에 대해 처음 4개의 반복은 이전에 튜브에 있던 것으로 오염됩니다. 이 경우, 신호는 이전 세척의 물과 혼합된 나트륨 완충액 샘플에서 나옵니다.

5에서 9까지의 반복은 샘플의 신호만을 나타냅니다. 따라서 각 경우에 처음 4개의 반복을 항상 제외합니다. 혼합 아티팩트를 방지하려면 수동으로 트레이스를 살펴보고 아티팩트 및/또는 거품 혼합으로 인한 스파이크 또는 편차가 포함된 빨간색 트레이스와 같은 잘못된 반복을 제거합니다.

그런 다음 담금질 반복을 각 실험 조건에 대한 각 샘플에 대한 버퍼 반복의 평균 시작 값으로 정규화하고, 모든 샘플의 평균을 그라민이 없는 시각화 샘플의 단일 그래프로 결합하면 모두 유사해야 하며 형광 담금질이 거의 없어야 합니다. 그램 시딘(gram sidin)이 있는 샘플에 대해 탈륨 이온이 소포로 천천히 들어가기 때문에 형광 신호가 천천히 감소합니다. 형광 시간 경과가 화합물에 의해 눈에 띄게 변경되는 경우, 화합물은 다음에 테스트된 농도에서 지질 이중층 특성을 변경하여 정규화된 형광 소광 곡선의 처음 2-100밀리초에 대한 스트레치된 지수를 맞춥니다.

개별 반복의 경우 2 밀리 초에서 속도를 계산합니다. 그런 다음 개별 샘플에서 주어진 샘플에 대한 평균 및 표준 편차를 계산하고, ga로 표시된 gramin의 부재 또는 존재 시 형광 담금질의 시간 과정에서 cap으로 표시된 capsaiçin의 효과가 관찰되었으며, 정규화된 형광 신호가 여기에 1초에 걸쳐 표시됩니다. 회색 점은 모든 반복의 결과를 나타내고 빨간색 선은 평균을 나타냅니다.

정규화된 형광 신호의 처음 100밀리초가 표시됩니다. 회색 점은 각 조건에 대한 단일 반복의 결과입니다. 빨간색 선은 이러한 반복에 맞게 늘어난 지수입니다.

답답한 파란색 선은 2밀리초 표시를 나타냅니다. 담금질 속도가 결정되는 시간입니다. 담금질 속도의 상대적 변화는 modifier 없이 gramin을 사용하여 데이터를 control sample로 정규화하여 결정됩니다.

capsaisin이 지질 이중층에 흡수되면 이중층 특성이 변경됩니다. 더 부드러운 이중층으로의 변화는 전도성 이량체에 찬성하여 모노 이량체 평형에서 그램 측의 이동으로 반영됩니다. 방금 작은 분자의 이중층 교란 효과를 측정하는 절차를 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 동일한 소포 배치를 사용하는 각 실험에 대해 적절한 대조군을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.