Name: 포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 배우세요 포유류 세포에서 원형질 막 재봉합 효율을 측정하는 고처리량 형광 분석법을. HeLa 세포를 이용하여 막 손상 후 세포 생존에 필수적인 재봉합 과정을 정량화하고 관련 단백질을 식별하는 방법입니다.

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우리는 친절 하 게 우리 일부 예비 실험에 대 한 그의 멀티 모드 검색 플랫폼을 사용 하 수 있도록 박사 제시 Kwiek (오하이오 주립 대학)를 인정 합니다. 이 문서에서 보고 하는 연구는 알레르기 국립 연구소와 전염병의 스테파니 Seveau에 보너스 번호 RO1AI107250에서 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

1입니다. 준비
<ol><li>셀 도금 참고: 인간 자 궁 경부 상피 세포, 헬러와 히스톤 2B-GFP (H2B-GFP), 표현 헬러가이 프로토콜에서 사용 되었다 그러나이 분석 결과 다른 포유류 세포19에 적용할 수 있습니다.<ol>
<li>0.25% Trypsin EDTA의 2 mL와 함께 셀을 세척 하 여 75 cm는2 셀은 문화 플라스 크에서 부착 세포를 분리 합니다. 사용 된 트립 신을 2 mL 신선한 트립 신-EDTA 0.25%의 바꿉니다.</li>
		<li>세포는 둥글게 하 고 플라스 크에서 분리 될 때까지 5 분 동안 37 ˚C에서 세포를 품 어.</li>
		<li>성장 매체 (DMEM 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 100 U/mL 페니실린 그리고 100 µ g/mL 스)의 8 ml 셀 resuspend</li>
		<li>hemocytometer 세포 현 탁 액의 10 µ L을 사용 하 여 셀 농도 결정 합니다.</li>
		<li>2.5 x 105 셀/mL의 농도에 성장 매체에 셀을 희석.</li>
		<li>피 펫 멸 균 분 지에 세포 현 탁 액을 부 어 하 고 철저 하 게 현 탁 액 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 혼합.</li>
		<li>12-멀티 채널 micropipette 및 200 µ L 팁 using, 96-잘 평면, 분명 바닥, 블랙 폴리스 티 렌 조직 문화 취급 접시에 3 중 (또는 quadruplicate) HeLa 세포 (2.5 x 104 셀/100 µ L/잘) 배포 합니다. 참고: 도금 배열 그림 1예제로 제공 됩니다.</li>
		<li>37 ˚C와 5% CO2습도 셀 문화 인큐베이터에서 24 h에 대 한 셀을 문화.</li>
	</ol></li>
	<li>재고 솔루션 준비
	<ol>
<li>행 크 스 균형 소금 솔루션, MgCl2 (5 m m)의 0.476 g의 95 g를 추가 하 여 버퍼 M (m 1과 m 2를 준비 하는 데 사용)의 10 배 재고의 1 리터를 준비와 HEPES (100 mM)의 23.83 g을 물 900 mL를. PH 7.4에 조정 하며 볼륨 1 L. 필터 소독을 합니다.</li>
		<li>11.26 g D-(+)를 추가 하 여 포도 당 (1.25 M) 재고 x 50의 50 mL를 준비-물 50 mL의 총 포도 당. 필터 솔루션 소독.</li>
		<li>CaCl2 0.666 g 물 50 mL의 총에 추가 하 여 칼슘의 (120mm) 재고 x 100의 50 mL를 준비 합니다. 필터 솔루션 소독.</li>
		<li>(50mm) 주식 에틸렌 글리콜-bis(2-aminoethylether)-N, N, n x 10의 50 mL를 준비 ', N', tetraacetic 산 (EGTA) EGTA 0.951 g 물 40 mL에 추가 하 여. 8 해산 EGTA, NaOH를 사용 하 여 pH를 증가 다음 볼륨 50 mL을 인상. 필터 솔루션 소독.</li>
		<li>단일 96 잘 접시 준비 중간 1의 50 mL (M1, 포함 캘리포니아2 +), 보통 2의 50 mL (M2, 캘리포니아2 +-무료), 그리고 보통 2 EGTA, 그에 따라 보충의 15 mL:<ol>
<li>M 1, 물의 43.5 ml 버퍼 M, 100 x CaCl2, 0.5 mL 및 50 x 포도의 1 mL x 10의 5 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>M 2에 대 한 물 44 mL를 버퍼 M x 10의 5 mL 및 50 x 포도의 1 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>M2/EGTA, 추가 10 버퍼 M x 10의 1.5 mL 1.5 mL 물 12 mL를 x EGTA. 참고: 모든 솔루션 propidium 요오드 화물 (PI)를 포함 하는 셀에 추가 하기 전에 직접 준비 한다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>플레이트 리더/이미징 Cytometer 설정 참고: 두 명의 감지 장치를 갖춘 멀티 모드 플레이트 리더 사용:는 spectrofluorometer 및 이미징 cytometer. Photobleaching는 fluorophores 피하기 위해 형광 노출을 제한 합니다.<ol>
<li>사전 분석 결과 수행 하기 전에 37 ° C로 플레이트 리더를 따뜻한.</li>
		<li>운동 분석 결과 대 한 매개 변수를 적절 하 게 설정 설정 모드에서:<ol>
<li>단색, FL (형광), 그리고 운동 광학 구성에 대 한, 읽기 모드, 선택한 유형, 각각 읽기.</li>
			<li>파장 설정에서 9와 15 nm 여기 및 방출 대역를 각각 선택 합니다. 분석 실험에 대 한 propidium 요오드 화물 (PI)를 사용 하 여 설정 여기 및 방출 파장 535와 617 nm, 각각.</li>
			<li>판형, 96 웰 플레이트 형식 및 블랙 벽 분명 하단 플레이트에 해당 사전 설정된 판 구성에 대 한 선택 합니다.</li>
			<li>읽기 영역에서 웰 스는 운동에 걸쳐 분석을 강조 표시 합니다.</li>
			<li>PMT와 광학에서 미리 읽기 6 깜박 하 고 아래에서읽기 확인란을 선택 합니다.</li>
			<li>타이밍에서 운동 분석 결과 30 분의 총 실행 시간 상자에서 00시 30분: 00 을 삽입 하 고 간격에 대 한 00시 05분: 00 을 삽입 합니다. 참고: 각 시간에 대 한 포인트 이며 한 파장, 전체 96 잘 접시의 독서 시간 30 s.</li>
			<li>오른쪽에 설정 정보 에 지정 된 설정을 확인 하 고 확인을 선택 합니다. 보도 자료 읽기 는 운동 시작을 실행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>이미지 매개 변수를 적절 하 게 설정 설정 모드에서:<ol>
<li>광학 구성 Minimax, 이미징, 및 끝점 을 선택 하 고 읽기 모드, 유형, 각각 읽기.</li>
			<li>파장, 선택 빛 전송, 그리고 하나 또는 둘 모두 456/541의 여기 및 방출 파장에 해당 하는 형광 상자 (GFP) 및 625/713 nm (PI).</li>
			<li>1.3.2.3 및 1.3.2.4 단계에서 정의 된 판형 및 읽기 영역 에 대 한 동일한 옵션을 사용 합니다.</li>
			<li>잘 지역 설정에서 이미지 수를 잘 내 사이트의 수를 선택 합니다. 참고: 12 사이트 전체 잘 이미지에 해당합니다.</li>
			<li>이미지 수집 설정에서 541 (GFP), 및 713 (PI) 빛, 전송에 대 한 노출 시간을 선택 합니다. GFP, 잘 20 ms/이미지의 노출 시간으로 전체 이미지. 빛 (TL)과 PI 형광, 전송에 대 한 8 및 20 ms의 노출 시간으로의 각 센터의 단일 이미지를 각각 획득.</li>
			<li>오른쪽에 설정 정보에 지정 된 설정을 확인 하 고 확인을 선택 합니다. 96 잘 접시의 각 음 (12 이미지/잘)의 표면 전체를 이미징 및 1 개의 파장에 대 한 수집 시간 ~ 15 분 언론 읽기 시작 영상 이다. 참고: 단일 이미지/96 잘 접시의 우물의 획득 시간 한 파장 ~2.5 분/접시 필요합니다. 위에서 설명한 매개 변수는 우리의 실험실에서 특정 장비에 해당 합니다. Spectrofluorometric 측정: 크 세 논 플래시 램프 1.0 nm 증가 여기 파장 (250-850 nm)는 조정 가능한 9 또는 15 nm 대역으로 표시, 광 전 증폭 관 관 탐지기 &gt; 6 로그 동적 범위와 가변 15 또는 25 nm 방출 대역 통과입니다. Cytometer 이미징:는 조명 광원 수 하얀 빛, 460 nm와 20 nm 대역, 방출 필터 가운데 541에 625 nm 여기 파장 (108 nm 대역) 및 713 nm (123 nm 대역), 각각, 그리고 4 X 목표는 1.25 메가 픽셀 12 비트 전 하 결합 소자 사진기.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2입니다. 분석 결과
참고: 분석 결과의 때에 세포는 70-90% 합칠 수 있어야 합니다. 세척 단계 동안 매체에서 제거 되며 (직접 셀) 이상 잘의 측 벽에 적용 되어야 한다. &lt; 4 단계 3.1.5까지 그것의 집계를 방지 하기 위해 ˚C에서 LLO의 온도 유지 합니다.
<ol><li>M 1에서 30 µ M PI의 재고를 준비 하 고 m 2에서 30 µ M PI의 주식 37 ˚C에서 미리 예 열.</li>
	<li>부드럽게 세척 접시 1 12-멀티 채널 micropipette 및 200 µ L 팁, 다음과 같이 사용 하 여 셀:<ol>
<li>복구 허가 조건에 대 한 성장 매체 및 세척 셀 200 µ L/잘 m 1 두 번 37 ˚C에서 미리 예 열을 제거 합니다. 100 µ L/잘 따뜻한 M1의 30 µ M PI를 포함 하는 매체를 바꿉니다.</li>
		<li>에 대 한 제한적인 조건 수리, 성장 매체를 제거 하 고 세척 셀 한번 200 µ L/잘 따뜻한 M2 5mm 킬레이트 캘리포니아2 +, 200 µ L/m 2 잘 세척 한 뒤에 EGTA를 포함 하. 30 µ M PI를 포함 100 µ L/잘 따뜻한 M2와 매체를 교체 합니다.</li>
		<li>성장 매체 세척 되 고 propidium 요오드 화물을 포함 하는 매체 대체 후 2.1.3 단계로 직접 이동 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지 플레이트 1 전송된 빛, GFP, 및 PI 1.3.3 (운동 전)에서 설명한 대로. 이 단계는 15-20 분 걸립니다.</li>
	<li>2.1.3 단계에서 15 분 동안 준비 접시 2 사용 하 여 12-멀티 채널 micropipette 200 µ L 팁 다음과 같습니다.<ol>
<li>얼음에 96-잘 둥근 바닥 폴 리 프로필 렌 microplate를 놓습니다. 접시 접시 1 (그림 1)에 해당 하는 실험 설계를 사용 하 여 구성 합니다.</li>
		<li>복구 허가 조건, 추가 100 µ L/우물의 차가운 M1 60 마이크론 PI, 100의 추가 의해 다음을 포함 포함 4 LLO x 또는 하지 컨트롤에 대 한 차가운 m1 µ L/잘.</li>
		<li>수리 제한 조건 추가 100 µ L/우물의 얼음 M2 60 마이크론 PI, 뒤에 100의 추가 포함 4 LLO x 또는 하지 컨트롤에 대 한 포함 된 차가운 M2의 µ L/잘.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플레이트 1 (2.1.3 단계)를 즉시 이미징 후 자리에 얼음, 얼음와 직접적인 접촉에서 접시를 분리를 알루미늄 호 일을 사용 하 여. 플레이트 1 5 분 동안 진정을 허용 합니다.</li>
	<li>12-멀티 채널 micropipette 및 200 µ L 팁 using, 1 접시에 해당 우물을 판 2 (단계 2.1.4)에 각 우물에서 100 µ L 전송. 격판덮개 1의 미디어에서 독 소를 제대로 배포 하는 초승달 아래 팁 넣고 부드럽게 거품 소개 없이 볼륨을 추출 합니다. 참고:이 실수로 셀 분리 수 있습니다으로 업 / 다운, 플라스틱 하지 않습니다.</li>
	<li>셀에 바인딩할 즉시 접시 1 접시 리더 spectrofluorometer 모드 (1.3.2 단계)를 사용 하 여 운동 분석 결과 대 한 전송을 독 소를 허용 하는 추가 1 분 동안 접시를 남겨 주세요.</li>
	<li>운동 분석 결과의 끝에, 즉시 접시 1 (포스트 운동) 사용 하 여 이미지 1.3.3 단계.</li>
</ol>3. 분석: 셀 열거형
<ol><li>미 판 셀 열거형 소프트웨어를 사용 하 여 핵 형광에 따라 셀 수를 결정 합니다.<ol>
<li>설정 내에서 재 분석, 선택 하 고 이미지 분석 설정 내에서 범주 섹션에서 신중 개체 분석 파장으로 541 을 사용 하 여 개체를 찾는 대 한 선택.</li>
		<li>찾을 개체 옵션을 사용 하는 이미지에 그리기 메서드를 찾는 내 설정 탭에서 핵 을 선택 하 고 적용을 누릅니다.</li>
		<li>확인 및 읽기 시작 알고리즘을 계산 하는 셀을 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>또는 이러한 도구를 사용할 수 있는 경우 셀을 열거할 ImageJ 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용 합니다.<ol>
<li>ImageJ, 스택으로 이미지 파일을 엽니다.</li>
		<li>메뉴 표시줄, 유형, 해당 이미지 를 클릭 하 여 8 비트 그레이 스케일 이미지 스택 변환 하 고 8 비트선택 합니다.</li>
		<li>배경 빼기: 메뉴 모음에서 이미지 를 클릭 조정, 위로 마우스를 이동 하 고 밝기/대비를 선택 합니다. 배경 잡음을 제거 하 고 적용을 선택 하 고 최소 값을 조정 합니다.</li>
		<li>이진 이미지를 생성 하는 임계값: 메뉴 모음에서 이미지 를 클릭 조정, 위로 마우스를 이동 하 고 임계값을 선택 합니다. 어두운 배경선택, 최소 및 최대 임계값 값을 조정 하 고 적용을 클릭 합니다.</li>
		<li>핵, 겹치는 경우 분수령 도구 세그먼트 핵을 사용할 수 있습니다. 이진 해당 메뉴에서 프로세스 를 클릭 하 고 분수령을 선택 합니다. 참고:이 자동으로 연결 된 핵 분리 됩니다.</li>
		<li>사용자가 지정한 기준 (크기와 순환)를 핵의 id를 수정 하 고 세포 파편을 제외을 적용 하 여 마스크 이미지를 분석 합니다.<ol>
<li>메뉴 그리고 분석 입자에서 분석 을 클릭 합니다. 원하는 크기를 설정 (픽셀 ^2) 및 순환 (값 1은 완벽 한 동그라미) 범위는 개별 셀/핵을 포함 하는 충분 한.</li>
			<li>표시 드롭다운 상자에서 원하는 옵션을 선택 하 고 확인 요약, 셀 카운트를 확인 을 클릭 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 분석: 키네틱 곡선
<ol><li>플레이트 리더 소프트웨어에서 분석 데이터 소프트웨어 운동 데이터를 전송.</li>
	<li>각 실험 조건에 대 한 해당 표준 편차와 표준 오차 각 실험 조건에 대 한 의미의 각 timepoint에 복제의 형광 강도 평균.</li>
	<li>각 실험 조건에 대 한 추적 해당 운동 곡선: PI 강도 (y 축) 시간 (x 축)에 대.</li>
	<li>주어진된 처리 조건의 resealing 효율을 계산 하려면의 (AUC) 곡선 아래 면적을 계산는 + m 1에서 LLO (AUC(M1)) 및 + M2에서 LLO (AUC(M2)). 아래 resealing의 효율 (E)를 평가 하기 위해 제안 하는 방법을 사용 하 여: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58351/58351eq1v2.jpg">
</li>
	<li>아래 표시 된 효율 비율 (REff)를 결정 하 여 제어 및 테스트 처리 사이 비교를 수행. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58351/58351eq2.jpg"> EFF R = 1, 테스트 처리는 복구에는 영향을 주지 않습니다 REFF &lt; 1, 테스트 처리 억제 수리 EFF R &gt; 1, 테스트 처리 개선 복구</li>
	<li>다음 수식을 사용 하 여 곡선 아래 면적을 계산: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58351/58351eq3.jpg">여기서 k는 후속의 총 수.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 분석 결과 막 셀 인구 수준 높은 처리량 용량 resealing의 효율성을 측정 합니다. 그것은 사용 될 수 있다 세포 구성 요소 또는 막 복구에 영향을 미칠 수 있는 약물 라이브러리에 대 한 화면으로. 기술된 분석 결과 96 잘 접시 형식을 사용 하지만 높은 처리량에 대 한 384-잘 접시를 적응 시킬 수 있다. 이 분석 결과의 장점은 과도 한 셀 셀 분리, 고정, 또는 형광 라벨 후 고정 등 처리에 대 한 필요 없이 실시간으로 부착 살아있는 세포 형광 측정을 얻을 하는 기능입니다. 이 프로토콜에서 사용 하는 것과 같은 다중 플레이트 독자 최저 30 시간 간격 빠른 spectrofluorometric 측정에 대 한 충분 한 감도 있다 96 잘 접시에 대 한 s. 형광 이미지 인수 셀 열거, 최종 변경 셀 형태, 그리고 뚜렷한 세포 인구의 잠재적인 id 등의 추가 정보를 제공 합니다. 현재 분석 결과 플라즈마 멤브레인 resealing 단일 세포 수준에서의 활동을 설정 하지 않습니다 하지만 영향을 미칠 수, 긍정적으로 또는 ...

포유류 세포 원형질 막 무결성의 손실의 결과로 기계, 삼 투, 및 생 화 확 적인 스트레스를 받습니다. 신속 하 고 효율적인 resealing 없이 손상 된 세포는 신속 하 게 프로그램 또는 회 저 성 죽음에 굴복 하 고. 1960 년대 이후, 노력 과정 resealing 플라즈마 멤브레인을 이해 하는 엄청난 결과 장애와 관련 된 동기가 있다. 실제로, 사지 띠 근 위축 증, 당뇨병, 및 Chediak-히가시 증후군 같은 질병 돌연변이 유전자 인코딩 dysferlin, 고급 glycation 엔드 제품의 생산에서 및 결함 결핍 플라즈마 막 복구에 연결 되었습니다. lysosomal 밀매 레 귤 레이 터 CHS1, 각각1,2,,34,,56. 그러나, 날짜, 막의 우리의 이해를 resealing은 여전히 제한7입니다. 초기 연구는 세포 외 캘리포니아2 + 원형질 막 손상 된8,,910의 유입에 의해 시작 막 resealing 증명 하고있다. 그 이후, 여러 비 배타적이 캘리포니아2 +-종속 메커니즘 셀 봉인에 제안 되었습니다. 패치 가설 상처에 근접, 세포내 소포는 패치11,12,,1314로 손상 된 원형질 막 서로와 퓨즈를 제안 합니다. 두 번째 모델 제안 그 칼슘 의존 exocytosis 상처에서 리소좀의 사이트 해제 하는 lysosomal 효소 산 sphingomyelinase, 원형질 막의 외부 전단에서 세 라마 이드 sphingomyelin 변환. 지질 구성에서이 갑자기 변경 결과 손상 된 지역15,,1617의 세 라마 이드 기반 endocytosis. 마지막으로, 세 번째 제안 된 메커니즘 endosomal 정렬 복잡 한 전송 (ESCRT) 플라즈마 막18에서 떨어져 새싹 외부와 접한 vesicles의 형성을 촉진 하는 데 필요한에 대 한 역할을 포함 한다. 단백질의 제한 된 집합에 대해서만 이러한 모델에서 확인 된 그리고 그들의 기계를 더 해명 합니다.
여기 우리가 대책 resealing 효율 부착 포유류 세포에서 원형질 막 손상 받게 재조합 listeriolysin O (LLO)19에 의해 중재 높은 처리량 분석 결과 설명 합니다. LLO facultative 세포내 병원 체 Listeria monocytogenes20,,2122 분 비는 기 공 형성 독 (PFT) 이며 MACPF/CDC에 속한다 (막 공격 복합물, perforin, 그리고 콜레스테롤-종속 cytolysin) superfamily입니다. MACPF는 포유류 기 공 형성 단백질 반면 CDCs 세균성 독 소 주로 면역 방어에 관련 된 그들의 병원 성 생활23홍보 호스트 세포 손상 그람 양성 병원 균에 의해 생산. CDCs 수용 성 단위체로 합성 됩니다 또는 콜레스테롤을 바인딩할 이합체 플라즈마 멤브레인에 최대 50 subunits의 복잡 한 prepore에 oligomerize. Prepore 복잡 한 지질 bilayer, β 배럴 공 직경24,25,,262730-50 nm에 걸쳐 형성에서 β-가닥을 삽입할 다음 재정렬 합니다.  이러한 큰 모 공 세포;와 이온 및 작은 세포 구성 성분의 용 허용 하지만, 일부 연구는 작은 크기의 숨 구멍 형성된28,,2930도 제안 했다. CDCs, 가운데 LLO 높은 처리량 분석31,32에 도움이 되는 돌이킬 수 없는 pH 및 온도 의존 집계를 포함 한 독특한 속성을 표시 합니다. LLO 4 ˚C, 셀, 있지만 복잡 한 기 공 형성 수 없습니다 그것의 바인딩을 허용 온도에서 세포 배양에 추가 될 수 있습니다. 기 공 형성의 개시 다음 허용 양식 올리고 하 막의 비행기에 있는 독 소 분자의 효율적인 확산에 대 한 구조적 리 모델링에 대 한 기 공 생성에 관여 하는 37 ˚C를 온도 올려서 동기화 수 있습니다. 따라서, 온도, 세포 손상의 운동에 스위치에 따라 원형질 막에 바인딩된 독 소의 양을에 달라 집니다. 중요 한 것은, 녹는 LLO (원형질 막에 바인딩되지 않은) 신속 하 고 irreversibly 집계 온도 37 ˚C, 언바운드 독 소 분자를 멀리 세척 하는 필요를 완화 하 고 시간이 지남에 막 손상의 범위를 제한에 도달 하면. 마지막으로, LLO 콜레스테롤에 바인딩하고 콜레스테롤이 풍부한 세포 막에 있는 숨 구멍을 형성,이 분석 결과 이므로 다양 한 포유류 세포에 순종. LLO 호스트 셀 기 공 형성을 통해 주로 신호에 영향을 주는 다는 것을 명심 하는 것이 중요 하다는 기 공-독립 셀에 몇 가지 예외 신호33,,3435,36 발생할 수 있습니다 ,,3738,39. 따라서, 그것은 수 없습니다 그 LLO 활동 막 복구의 과정에 영향을 미칠 수 있습니다 신호를 제외.
이 분석 결과 직접 셀 한 셀 impermeant 형광 색소 (예를 들어, propidium 요오드 화물) 수 동적으로 상처 입은 세포를 입력 하 고 높은 형광 일단 핵 산으로 연결 되는의 설립을 측정 하 여 상처의 정도 평가 . 따라서, 허용 셀 부상의 실시간 분석 실험에 걸쳐 세포 배양에는 형광 색소를 유지할 수 있습니다. 핵 산 바인딩 염료의 형광 강도 독 소의 농도 증가 하 고, 독 소의 특정된 농도 대 한 것입니다 시간이 지남에 모든 숨 구멍 형성 되 고 세포는 완전히 수리 될 때까지 또는 증가 채도 도달할 때까지. 세포 외 캘리포니아2 + 막 숨 구멍을 통해 유입 resealing에 대 한 사인 qua 비 이벤트입니다. 따라서, resealing 효율 명시 될 수 있다 직접 하지 셀 부상 포함 된 캘리포니아2 + (수리 허용 조건)는 캘리포니아2 +에서 부상 하는 문화 매체에 비교 하 여-자유로운 매체 (수리 제한적인 조건). 핵 산 바인딩 염료의 형광 강도 각 음에 셀 농도에 직접 비례 하기 때문에 모든 우물에 같은 농도에서 종자 세포에 중요 하다. 그것은 또한 전후에 셀 분리 발생 하지 않습니다, 부동,으로 집계 셀 데이터 해석 복잡 하 게 만들 수 있습니다 하는 형광 읽기 애매 한 수 있도록 분석 결과 셀에 각 잘 열거 하는 것이 중요. 셀, 열거할 지역화 핵 히스톤 2B-GFP (H2B-GFP)를 표현 하는 세포는이 분석 결과에서 사용 되었다. 온도 제어, 멀티 모드 microplate 리더 결합 형광 강렬의 급속 한, 높은 처리량 측정 (를 사용 하 여 96 또는 384-잘 플레이트 형식) 37 ° c.에 살아있는 세포의 현미경 이미징 후자는 휴대폰 번호를 열거 하 고 뚜렷한 세포 인구의 최종 형성 관찰을 사용할 수 있습니다.
궁극적으로,이 분석 결과 사용자 호스트 분자에 대 한 심사에 의해 막 복구 메커니즘의 복잡성의 그들의 지식을 확장 하는 기능을 제공 한다 또는 수리 하는 것 추가 화합물 멤브레인을 제어할 수 있습니다. 다음 프로토콜 LLO에 노출 하는 셀의 resealing 효율성을 측정 하는 실험 단계를 설명 하 고 특정된 약물 또는 resealing 효율성에 세포 치료의 효과 평가.

<table><tbody><tr><td>SpectraMax i3x 다중 모드 마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td>i3x</td><td></td></tr><tr><td>MiniMax 300 이미징 세포분석기</td><td>분자 장치</td><td>5024062</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL2</td><td></td></tr><tr><td>HeLa H2B-GFP</td><td>Millipore</td><td>SCC117</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plated</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4891</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ISC BioExpress</td><td>0732-100G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도당, HybriMax</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5146-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

포유류 세포에서 효율 resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

그들의 생리 적인 환경에서 포유류 세포 원형질 막 손상 기계 및 생 화 확 적인 스트레스를 자주 받게 됩니다. 이러한 손해에 대응, 복잡 한 분자 기계는 빠르게 원형질 막의 장벽 기능 복원 및 세포 생존을 유지 다시 봉인. 이 분야에 있는 연구의 60 년에 불구 하 고 우리는 여전히 기계를 resealing 셀에 대 한 철저 한 이해 부족. 세포질 구성 요소를 식별 하는 목적으로 그 제어 플라즈마 멤브레인 resealing 또는 resealing, 향상 시킬 수 있는 약물 개발 했습니다 플라즈마 멤브레인 resealing 포유류 세포에 있는 효율성을 측정 하는 형광 기반의 높은 처리량 분석 결과 microplates에서 경작. 원형질 막 손상에 대 한 모델 시스템으로 서 세포 세균 기 공 형성 독 소 listeriolysin O (LLO), 큰 30 ~ 50 nm 직경 배치할 포함 하는 콜레스테롤에 숨 구멍을 형성 하에 노출 되는 세포 막. 명시 및 살아있는 세포의 형광 현미경 이미지와 함께 신속 하 고 민감한 spectrofluorometric 측정 온도 제어 멀티 모드 microplate 리더를 사용 하 여 수 있습니다. 부상 및 효율 resealing 셀의 계산을 허용 세포 인구 수준 resealing 막의 정도 반영 하는 막 impermeant 핵 산 바인딩 형광 색소에 의해 방출 되는 형광 강도의 운동 분석 . 형광 현미경 영상 constitutively 핵 단백질 히스톤 2B 잠재적인 변화 그들의 수에 대 한 계정에 미 판의 각 우물에서의 형광 키메라를 표현 하 고 결국 세포의 열거 허용 뚜렷한 세포 인구의 식별입니다. 이 높은 처리량 분석 결과 호스트 유전자에 대 한 심사를 통해 막 복구 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 확장 하는 것으로 예상 된다 또는 것 추가 하는 강력한 도구는 제어 플라즈마 멤브레인 resealing 화합물 이다.

셀 계산 정확도: 헬러 세포 막 복구 메커니즘을 탐구 모델 포유류 세포 선으로 자주 사용 됩니다. 세포 인구 수준에서 막 복구를 평가할 때는 적절 한 데이터 해석에 대 한 모든 우물에 같은 농도에서 판 세포에 중요 하다. 그것은 또한 웰 스에서 핸드폰 번호는 해당 시험의 시간에 확인 해야 합니다. 헬러 세포 constitutively 히스톤 2B GFP (H2B-GFP) 융합을 표현 하는이 분석 결과를 자동으로 그들의 형광 핵의 탐지를 기반으로 하는 셀 열거에 도입 되었다. 셀 열거형에 정확도 확립, 헬러 H2B GFP 셀의 두 가지 직렬 희석 triplicate 96 잘 접시에서에 4 h에 대 한 교양 도금 했다. 이 정도의 시간 셀 첨부 파일에 대 한 충분 한 이며 제한 된 세포 분열을 제공 합니다. 전체 웰 스 전송된 빛 (TL) 아래 몇 군데 했다 그리고 GFP 형광 조명 및 셀 GFP 형광 (그림 2A 와<s...

여기는 살아있는 세포에서 fluorometric 및 이미징 분석 통해 효율 resealing 플라즈마 멤브레인을 측정 하는 높은 처리량 형광 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 약 또는 포유류 세포에서 원형질 막 resealing 규제 대상 유전자 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

이 분석은 플라즈마 막 생물학 분야의 주요 질문을 해결하고 얼마나 효율적으로 손상된 세포가 플라즈마 막을 재밀봉 할 수 있는지 확립하기 위해 개발되었습니다. 이 기술은 고처리량 용량에서 플라즈마 멤브레인 재밀봉의 효율성을 측정하고 플라즈마 멤브레인 재밀봉을 중재하는 특정 단백질 및 해당 경로를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 먼저 성장 중간 현탁액의 밀리리터 당 5번째 HeLa 세포에 20밀리리터를 멸균 파이펫 분지에 추가하고 10 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 세포를 철저히 혼합합니다.다음으로, 멀티채널 마이크로파이프를 사용하여 96웰의 평평한 투명한 바닥, 블랙 폴리스티렌 조직 배양판에서 트리플리케이트에서 잘 100 마이크로리터의 세포를 시드한다. 동질적인 세포 분포는 모든 실험 조건 간의 비교가 동등한 세포 수를 필요로 하기 때문에 성공적인 실험의 핵심이라는 것을 기억하십시오. 가습된 세포 배양 배양인인 배양기에서 섭씨 37도 및 CO2 5%에서 24시간 후, 플레이트 판독기를 섭씨 37도로 예열하고 광학 구성을 단색으로 조정하고, 형광에 대한 판독 모드, 및 판독형을 운동으로 설정하였다.파장 설정에서 9나노미터 발산과 15나노미터 방출 대역을 선택합니다. 오오드리움을 이용한 아세약의 경우, 각각 535나노미터 및 617나노미터로 발산 및 방출 파장을 설정한다. 플레이트 유형에서 플레이트 형식에 대해 96웰을 선택하고 검정벽 클리어 하단 플레이트에 해당하는 사전 설정 플레이트 구성을 선택합니다.읽기 영역 아래에서 운동 분석 전반에 걸쳐 분석될 우물을 강조표시합니다. PMT 및 광학 에서 읽기 당 깜박임을 6으로 미리 설정하고 아래에서 읽을 수있는 상자를 선택합니다. 타이밍에 따라 총 런타임에 30분 0초를 입력하여 30분 운동 분석서를 입력하고 간격에 대해 0시간 5분 0초를 입력합니다.설정 정보에서 지정된 설정을 확인하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 읽기를 클릭하여 운동 실행을 시작합니다. 설정 모드 내에서 이미징 매개 변수를 설정하려면 광학 구성에 대한 MiniMax, 읽기 모드 이미징 및 읽기 유형에 대한 끝점을 설정합니다. 파장 하에서, 실험 흥분 및 방출 파장에 대응하는 전송된 빛 및 적절한 형광 상자를 선택합니다.플레이트 유형과 읽기 영역을 방금 시연한 대로 설정하고 웰 영역 설정 아래에 이미지를 이미지할 웰 내의 사이트 수를 설정합니다. GFP의 이미지 수집 설정에서 이미지를 이미지당 노출 시간 당 20밀리초로 전체 이미지를 잘 이미지하도록 장치를 설정합니다. 전송된 빛의 경우 8밀리초 노출 시간으로 각 웰의 중심의 단일 이미지를 획득합니다.프로피듐 요오드의 경우 20밀리초 노출 시간으로 각 우물의 중앙에 단일 이미지를 획득하십시오. 그런 다음 설정 정보의 설정을 확인하고 확인을 클릭하고 이미징을 시작하려면 읽기를 클릭합니다. 수리 허용 조건에 대한 고처리량 형광 계 분석기를 설정하려면, 200 마이크로리터로 세포를 두 번 씻어 37도 M1 배지의 마이크로리터를 잘 세척하고 두 번째 세척후 30 마이크로 모라 프로피듐 요오디드로 보충 된 신선한 37도 M1 배지의 마이크로 리터 를 추가하십시오.수리 제한 조건의 경우, 37도 의 마이크로 리터 200 마이크로 리터로 세포를 한 번 세척하여 잘 5 밀리모어 EGTA로 보충한 다음 M2 배지의 200 마이크로 리터만 으로 한 번 세척하십시오. 두 번째 세척을 폐기한 후, 100 마이크로리터를 추가하여 37도 의 신선한 섭씨 M2 배지를 잘 30 마이크로몰라 프로피듐 요오드로 보충합니다. 그런 다음 방금 시연된 대로 전송된 빛, GFP 및 PI 아래에서 플레이트를 이미지합니다.플레이트가 이미지화되는 동안, 얼음에 96 잘 둥근 바닥 폴리 프로필렌 마이크로 플레이트를 배치하고 단지 이전 플레이트에 대해 입증 된 것처럼 플레이트를 구성. 수리 허용 조건의 경우, 잘 당 60 마이크로 몰라 프로디듐 요오드로 보충 얼음 차가운 M1 매체의 100 마이크로 리터를 추가하고 잘 당 4X 리스테리오리신 O 또는 없이 얼음 차가운 M1의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 수리 제한 조건의 경우, 잘 당 60 마이크로 몰라 프로디듐 요오드로 보충 얼음 차가운 M2 배지 의 100 마이크로 리터를 추가하고 잘 당 4X 리스테리오리신 O 또는 없이 얼음 차가운 M2의 100 마이크로 리터를 추가합니다.플레이트 1개가 얼음과 플레이트 2에 있을 때 운동 분석이 시작되기 약 5분 전에 얼음에 대한 적절한 실험 농도로 리스테리오리신 O를 준비하는 것이 필수적이다. 첫 번째 플레이트가 이미징이 완료되면 즉시 접시를 얼음 위에 알루미늄 호일 시트로 옮기습니다. 5분 후, 제1 냉각판에 해당하는 양상수로 두 번째 플레이트의 각 우물에서 100마이크로리터를 옮기고, 독소의 적절한 분포를 위해 혼합하지 않고 부피를 배출하기 전에 각각의 용액의 반월상연상 아래에 파이펫 팁을 삽입한다.독소가 1분 동안 숙주 셀에 결합하고 분광성계 모드를 사용하여 운동 후 분석법에 대한 플레이트 판독기로 즉시 이전할 수 있도록 합니다. 운동 분석의 끝에서, 즉시 사전 운동 이미징에 대해 입증 된 바와 같이 플레이트 이미지의 운동 후 이미징을 취득. 핵 형광에 기초하여 세포 수를 결정하기 위해, 마이크로 플레이트 셀 열거 소프트웨어에서 설정하에, 재분석 을 선택하고, 이미지 분석 설정에서, 개체를 찾기위한 파장으로 541을 사용하여 이산 개체 분석을 선택합니다.찾기 개체 옵션 내에서 이미지 찾기 방법에 대한 그리기를 사용하고 핵을 선택하고 적용을 클릭한 다음 확인을 클릭하고 읽기를 클릭하여 셀 계산 알고리즘을 시작합니다. GFP 발현은 리스테리오리신 O 처리의 존재 또는 부재에서 프로피듐 요오드 강도 측정을 방해하지 않는다. 프로피듐 요오드의 발현은 전운동 분석에 비해 운동 후 이미징 분석에서 HeLA H2B-GFP 세포에서 GFP 형광 강도의 증가에 의해 입증된 바와 같이 GFP 형광을 통해 출혈할 수 있다.중요한 그러나, 이러한 크로스오버는 GFP 형광의 증가에 영향을 받지 않는 핵의 열거에 관여하는 세분화 과정이 영향을 받지 않기 때문에 세포 계수에 영향을 미치지 않는다. listeriolysin O의 부재에서, 플라즈마 막 무결성은 세포외 칼슘의 존재 또는 부재에서 일정한 남아, 칼슘 보충 매체의 존재에 리스테리오리신 O 치료는 프로피듐 요오드 형광 강도의 꾸준한 증가를 초래하는 동안. 그러나 세포외 칼슘이 없는 경우, 장재밀봉의 부재를 반영하여 프로피듐 요오드 형광이 상당히 가파르게 증가합니다.대안적으로, 카보시아닌 핵산 결합염은 먼 빨간색의 형광을 함유하여 프로피듐 요오드로 대체되어 GFP와의 스펙트럼 중첩을 최소화할 수 있다. 또한, 먼 적색 염료에 대한 더 큰 흥분 계수는 소음 비율에 더 높은 신호와 수리 허용 및 수리 제한 조건 사이의 더 나은 해상도를 나타낸다. 이 절차를 시도하는 동안, 실험의 날에 시약 준비의 모든 당신을 준비하기 때문에, 실험의 하루 전에 튜브의 모든 라벨을 하는 것이 좋습니다.이 절차에 따라, 이미지 세포측정과 같은 다른 방법은 모공 형성 독소가 모든 세포를 균일하게 손상시키거나 일부 세포가 다른 세포보다 더 민감하게 손상되는 등의 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 다른 세포 모형의 수리 효율성에 공공 크기의 효력을 탐구하기 위하여 전염병 및 혈장 막 복구의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

규제 endocytosis는 막 단백질의 대부분의 세포 표면 발현 수준을 관리합니다. 여기서 우리는 도파민 전송 (DAT), polytopic 멤브레인 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 줄이할 수있는, 멤브레인 impermeant biotinylation의 시약을 사용합니다. 방법은 대부분의 플라즈마 막 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 직접적인 접근을 용이하게합니다.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

이 비디오는 포유류 세포에서 원형질막 재밀봉 효율을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. 세포는 세포막에 기공을 형성하는 박테리아 독소에 노출됩니다. 세포 외 칼슘 이온이 존재하면 기공은 칼슘 유입을 일으켜 막 재밀봉 사건을 유발합니다. 재밀봉 효율은 DNA 결합 프로피듐 요오드화물 염료를 사용하여 평가되며, 이 염료는 재밀봉된 멤브레인 없이 세포에만 들어갑니다.

원형질막 재밀봉 효율을 측정하기 위한 In vitro Fluorescence-based Assay

친 유성 염료 FM1-43에 노출 된 세포의 라이브 영상은 기공 형성 독소는 세포막에서 제거되는 반응 속도의 정밀한 결정을 허용한다. 이것은 CA에 대한 요구 사항이 +, sphingomyelinase 및 세포막 수리 및 다른 인자를 평가하는 데 사용될 수있는 민감한 분석이다.

CA의 역할을 평가하기위한 영상 분석을 라이브<sup&gt; 2 +</sup기공 형성 독소 상처의 수리에&gt;와 Sphingomyelinase

Proteoliposomes는 잘 정의된 생화학적 환경에서 재구성된 정제된 채널과 수송체를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 단백질에 의해 매개되는 유출을 측정하기 위한 실험적 절차가 설명됩니다. 프로테오리포좀을 준비하고, 기록을 수행하고, 데이터를 분석하여 재구성된 단백질의 기능적 특성을 정량적으로 결정하는 단계가 설명됩니다.

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

여기에서는 살아있는 세포에서 일체형 막 단백질의 방향과 토폴로지를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 간단한 프로토콜은 관심 단백질과 GFP 사이의 키메라의 선택적 단백질 분해 효소 민감도에 의존합니다.

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

두 광자 레이저를 통해 세포 막 부상 막 resealing 능력을 평가 하기 위한 널리 사용 되는 방법 이며, 여러 개의 셀 형식에 적용할 수 있습니다. 여기, 우리가 시험관에서 라이브 이미징 막 resealing dysferlinopathy 환자 셀 다음 2 광자 레이저 절제에에서의 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여

여기, 선물이 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 원형질 막 협회의 레벨의 정량 분석을 수행 하는 프로토콜. 방법은 막의 전산 분해와 세포 원형질 막 형광 표식으로 표시에서 관찰 된 신호의 세포질 구성 요소를 기반으로 합니다.

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

이 프로토콜은 막 전위의 변화를 측정하여 전기적 막 단백질을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 상피 세포주에서 내인성으로 발현되는 여러 이온 채널의 기능적 판독을 위한 플랫폼을 제공합니다.

두 개의 상피 세포주에서 두 개의 내인성 이온 채널에 대한 고처리량 기능 연구를 위한 막 전위의 형광 기반 분석

배우세요 포유류 세포에서 원형질 막 재봉합 효율을 측정하는 고처리량 형광 분석법을. HeLa 세포를 이용하여 막 손상 후 세포 생존에 필수적인 재봉합 과정을 정량화하고 관련 단백질을 식별하는 방법입니다.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

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