폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

이 절차의 전반적인 목표는 폴리디메틸실록산 박막을 사용하여 자동화된 지질 이중층 형성을 연구하는 데 사용할 수 있는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 막-단백질 상호 작용에 관한 나노 바이오센서 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 지질 이중층 형성이 자동화되고 재현 가능하다는 것입니다.

시작하려면 증류수에 염화칼륨, 트리스 하이드로클로라이드 및 EDTA를 결합하여 완충 용액을 준비합니다. 그런 다음 용액의 PH를 8.0으로 조정합니다. 그런 다음 0.2미크론 필터를 사용하여 용액을 여과하고 섭씨 121도에서 15분 동안 용액을 오토클레이브합니다.

다음으로, 2 개의 undecane 및 8 개의 헥사 데칸 부피로 구성된 혼합물에 지질의 3 %를 용해시켜 사전 페인팅을 위해 지질 용액을 준비합니다. 회전기를 사용하여 용액을 밤새 저어줍니다. 또한, 2 부 undecane과 8 부 hexadecane의 동일한 혼합물에 지질의 0.1 %를 용해시켜 막 형성을위한 지질 용액을 준비합니다.

이 용액을 로테이터에서도 밤새 저어줍니다. PDMS 박막을 준비하려면 혼합 컵에 9부의 프리폴리머와 1부의 경화제를 혼합합니다. 이 혼합물 5g을 페트리 접시에 넣고 접시를 800rpm에서 10초 동안 스핀 코팅하여 200-250미크론 두께의 필름을 형성합니다.

다음으로, 페트리 접시를 진공 데시케이터에 넣고 100밀리토르의 진공을 2시간 동안 당겨 잔여 기포를 제거합니다. 그런 다음 박막을 섭씨 70도의 오븐에서 5시간 동안 굽고 PDMS를 중합합니다. 냉각되면 중합된 박막을 2cm x 2cm 정사각형으로 자르고 직경 500미크론의 펀치를 사용하여 정사각형 중앙에 작은 구멍을 만듭니다.

그런 다음 마이크로피펫을 사용하여 1마이크로리터의 3% 지질 용액으로 조리개를 미리 칠합니다. 검은색 지질 멤브레인 챔버를 만들려면 3D 드로잉 소프트웨어를 사용하여 챔버를 위한 두 개의 대칭 블록을 설계합니다. 그런 다음 PTFE 블록과 CNC 기계를 사용하여 챔버를 제작합니다.

챔버를 조립하려면 PDMS 박막의 조리개가 챔버의 구멍의 중앙에 오도록 두 PTFE 블록 사이에 사전 도장된 PDMS 박막을 배치합니다. 커버 유리와 진공 그리스를 사용하여 챔버의 바깥쪽 가장자리를 밀봉합니다. 밀봉되면 너트와 볼트를 사용하여 조립된 챔버를 고정합니다.

액체 누출이 없도록 챔버가 잘 밀봉되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 피펫을 사용하여 0.1%지질 용액 0.5마이크로리터를 챔버와 함께 조립된 PDMS 박막의 구멍에 증착합니다. 그런 다음 챔버를 섭씨 10도 이하의 서늘한 환경에 놓고 필요할 때까지 보관하십시오.

신속한 자가 조립으로 검은색 지질막을 형성하려면 냉장고에서 챔버를 꺼내고 챔버의 각 측면에 2ml의 완충 용액을 추가합니다. 얼어붙은 멤브레인 전구체가 해동될 때까지 10분 동안 챔버를 따로 둡니다. 그런 다음 챔버를 마이크로 매니퓰레이터에 배치하여 광원과 현미경에 대한 고도를 정밀하게 제어합니다.

할로겐 광섬유 조명기를 사용하여 챔버의 한쪽 면을 조명하여 PDMS 박막의 조리개를 밝게 합니다. 반대쪽에는 조리개와 일직선상으로 20x 대물렌즈를 놓고 색상이 고리보다 더 밝아지는 중심을 관찰합니다. 전기 측정을 위해 208마이크로미터 두께의 은선을 차아염소산나트륨 용액에 최소 1분 동안 배치하여 염화은 전극을 준비합니다.

그런 다음 전극을 미세 전극 증폭기에 연결합니다. 그런 다음 염화은 전극을 챔버의 각 측면에 배치하여 완충 용액에 있도록 합니다. 전기생리학 소프트웨어를 사용하여 멤브레인 전체에 10밀리볼트 삼각형 파형을 적용하여 구형파를 획득합니다.

기록 버튼을 클릭하여 멤브레인의 전기적 특성을 기록합니다. 균일한 구형파가 관찰될 때까지 계속 기록합니다. 그런 다음 검은색 사각형 아이콘을 클릭하여 녹음을 종료합니다.

그라미시딘 A를 지질 이중층에 통합하기 위해 두 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 먼저, 그라미시딘 A를 PDMS 박막의 구멍에 지질 용액을 펴기 전에 지질 용액에 직접 첨가할 수 있습니다. 둘째, 그라미시딘 A 용액은 지질 이중층이 형성될 때 챔버에 첨가될 수 있습니다.

그라미시딘 A 채널 활성을 관찰하려면 5킬로헤르츠의 샘플 속도로 멤브레인 전체에 100밀리볼트를 가하여 멤브레인의 유지 전위를 측정합니다. 기록 버튼을 클릭하여 이전에 수행한 것처럼 전기적 특성을 기록합니다. 이온 채널 활성이 표시되면 이온 채널 통합을 확인하기 위해 다양한 전류 점프가 관찰될 때까지 계속 기록합니다.

확인되면 검은색 사각형 아이콘을 클릭하여 녹음을 종료합니다. 기록이 완료되면 전기생리학 소프트웨어를 사용하여 100Hz에서 저역 통과 베셀 필터로 데이터를 필터링합니다. 필터링된 보유 전위 데이터에서 전류 점프를 관찰합니다.

이러한 점프는 gramicidin A 이온 채널의 이합체화를 나타냅니다. 동결된 멤브레인 전구체를 실온으로 가져와 해동시켰을 때, PDMS 박막으로 소수성 용매를 추출하여 지질 이중층 형성이 촉진되었습니다. 이 일련의 이미지는 지질 이중층(lipid bilayer)의 형성을 보여주는데, 이는 얼어붙은 형태에서 데워질 때 자체적으로 조립됩니다.

여기서, 전기 전도도는 gramicidin A의 통합 및 이합체화를 보여줍니다.이량체화 시, gramicidin A는 이온 채널을 형성하고 전도도 수준은 28 피코 지멘스로 점프하며, 이는 이전 보고서의 결과와 일치하며이 항생제가 이중층에 즉시 통합되는 것을 보여줍니다. 당사의 멤브레인 형성 기술은 실제 적용 가능성이 제한된 기존 기술과 달리 세포막 및 나노 채널 연구를 위한 강력한 도구를 제공합니다. 당사의 시스템은 멤브레인 형성 또는 이온 채널링 통합에 대한 전문 지식이 필요하지 않으므로 약물 스크리닝 및 바이오 센싱 응용 분야에 매우 적합합니다.