마우스 배아 줄기 세포 게놈에서 상동 재조합을 검출하기 위한 서던 블로팅(Southern Blotting)

각 gDNA에 대해 Dra I용 10X 버퍼 30마이크로리터, Dra I 3마이크로리터 및 샘플당 gDNA 10마이크로그램을 혼합합니다. 최종 부피가 30마이크로리터가 될 때까지 물을 넣고 하룻밤 동안 섭씨 37도에서 배양하여 gDNA를 소화합니다.

에티듐 브로마이드가 함유된 1% 아가로스 전기영동 겔을 준비합니다. 이전에 획득한 샘플을 1Kb 래더와 함께 겔에 로드하고 하룻밤 동안 30-40볼트에서 실행합니다. 다음날, 0.2 뉴턴 염산 용액이 들어있는 트레이에 젤을 담그십시오. 셰이커를 사용하여 트레이를 실온에서 20분 동안 부드럽게 흔듭니다.

겔을 DNA 변성 용액이 들어 있는 트레이로 옮깁니다. 실온에서 20분간 살짝 흔듭니다. 그런 다음 DNA 중화 용액이 들어있는 트레이에 젤을 옮기고 실온에서 20 분 동안 부드럽게 흔듭니다. 급속한 하향 이동 체계를 사용하여, 젤에서 막으로 DNAs를 옮기십시오.

다음으로, 제조업체에서 제공한 지침에 설명된 대로 TurboBlotter 및 블로팅 스택을 조립합니다. 그런 다음 멤브레인을 꺼내 2X 식염수-구연산나트륨으로 1분 동안 세척합니다. 액체를 조직으로 흡수한 다음 UV 가교제를 사용하여 DNA를 막과 가교결합합니다.

방사능으로 DNA 프로브를 라벨링하기 시작하려면 바로 사용할 수 있는 DNA 라벨링 비드가 들어 있는 튜브에 열 변성 프로브 DNA를 추가합니다. 피펫을 위아래로 섞고 방사성 표지된 디옥시토신 삼인산(deoxycytosine triphosphate) 5마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 제조업체에서 제공한 지침에 따라 G-50 마이크로컬럼을 사용하여 라벨링된 프로브를 정제합니다. 섬광 계수기를 사용하여 방사능을 측정하십시오.

표지된 프로브로 멤브레인을 혼성화를 시작하려면 멤브레인을 혼성화 튜브에 넣습니다. 혼합된 사전 혼성화 용액을 추가합니다. 튜브를 혼성화 오븐에 넣고 사전 혼성화를 섭씨 42도에서 30분 동안 진행합니다.

그런 다음 오븐에서 튜브를 제거하고 사전 혼성화 용액을 50ml 튜브에 붓습니다. 변성된 프로브를 넣고 부드럽게 섞습니다. 혼합 혼성화 용액을 혼성화 튜브에 추가하고 튜브를 혼성화 오븐에 다시 넣습니다. 그런 다음 하룻밤 사이에 혼성화를 진행하십시오.

혼성화되지 않은 프로브를 제거하려면 0.1% SDS가 함유된 1x 식염수-구연산나트륨이 들어 있는 트레이에 멤브레인을 넣고 섭씨 55-60도에서 10분 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 멤브레인을 플라스틱 랩으로 감싸고 노출 카세트에 고정합니다. 어두운 방에서 멤브레인을 X선 필름 2장에 노출시킵니다. 결과를 시각화하기 위해 필름을 현상합니다.