Name: 에서 UV - 유도 복제 중간체의 시각화 E. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 배우세요 UV 손상 후 DNA 복제 중간체를 2차원 아가로오스 겔 전기영동과 서던 분석을 사용하여 E. coli에서 시각화하는 방법. 이 기술은 DNA 손상 반응과 복구 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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우리가 실험실에서 작업이 NIGMS - NIH의 국립 과학 재단 (National Science Foundation)와 지역 부여 R15GM86839에서 경력을 수상 MCB0551798에 의해 지원됩니다.

1. 성장과 자외선 조사. <ol><li> 0.4 % 포도당, 0.2 % casamino의 지방산 및 10 μg / ML의 thymine (DGCthy 매체) 및 100 μg / ML 암피실린와 보충 데이비스 중간 1 자란 플라스미드 pBR322를 포함하는 새로운 숙박 문화의 200μl가 pelleted입니다. 세포 펠렛은 다음 암피실린을 부족한 200μl DGCthy 매체에 resuspended 및 DGCthy 매체 20 ML을 예방하는 데 사용됩니다. </li><li> 문화는 0.5의 OD 600 (~ 5 X 10 8 셀 / ML)를 37 떨고 인큐베이터에서 암피실린 선택 ° C 않고 재배하고 있습니다. 암피실린없는 성장은 어떤 돌연변이에서 발생할 수 비정상적인 또는 비생산적인 복제 중간체에 대한 선택을 방지합니다. 손상을 유발하는 자외선을 사용하는 경우는 자외선의 효과적인 복용량을 줄이고, 이러한 파장과 보호막 세포에서 강하게 흡수하기 때문에 또한, 미디어에서 암피실린의 제거가 필요합니다. </li><li> 노란 불빛 아래에서 일하는 문화가 교반을위한 회전 플랫폼에서 15cm 직경 페트리 접시에 배치됩니다. 우리의 문화는 UVC 광도계를 사용하여 측정됩니다 ~ 1 J/m2/sec의 노출 율을 생산하는 15 와트 살균 램프에서 거리에서 배치됩니다. 문화 50 J/m2와 조사 후 다시에 즉시 배치하는 실험 기간 동안 37 ° C 배양기를 흔들어. 이 약을 평균 1 cyclobutane pyrimidine 이합체 ssDNA의 모든 4.5 킬로바이트에서 생산하고 있습니다. 노란색 조명 photolyase로 cyclobutane의 pyrimidine의 dimers의 photoreactivati​​on - 반전을 방지할 수 있습니다. </li></ol> 2. DNA 격리. <ol><li> 복제 중간체가 검사 예정이다 때때로, 문화의 0.75 ML의 나누어지는는 0.75 ML 얼음 차가운 NET30 버퍼 (100 MM NaCl, 10 MM 트리스, 산도 8.0, 30 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))로 배치하고이 끝날 때까지 얼음에 위치 시간 코스입니다. 우리는 일반적으로 0 조사 샘플, 15, 30, 45, 60, 90 분, 90 분 시간 코스를 실행합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 차가운 온도를 효과적으로 복제 및 뉴클레오 티드 절단 수리를 중지 제공하고 있습니다. </li><li> 각 예제 1.5 MG / ML 라이 소 자임하고 TE 0.2 MG / ML RNaseA (10 MM 트리스, 산도 8.0, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 150 μl에 resuspended, 20 분 ° C 37 lysed 다음 pelleted입니다. 이 시점에서, 20 % sarkosyl의 proteinase K (10mg/ml)와 10μl의 10μl가 추가되며 부화는 1 시간을 위해 계속 허용됩니다. Proteinase K와 sarkosyl는 페놀 추출이 발생하기 전에 멤브레인 또는 단백질과 관련된 수의 DNA 조각을 출시하는 데 도움이됩니다. 적극적으로 복제 DNA가 흔히 단백질이나 막 단지에 바인딩되어 있기 때문에, 이것은 회복 아르 복제 조각의 수율을 높일 수 있습니다. </li><li> 샘플은 다음 각 샘플에 페놀 2 볼륨을 추가하고 튜브가 부드럽게 5 분 거꾸로 의해 압축이 풀립니다. 다음 클로로포름 / isoamyl 알콜 (24 / 1) 2 볼륨이 추가되고 튜브가 부드럽게 5 분 다시 반전됩니다. </li><li> 샘플 5 분, 각 샘플의 맨 수성 단계에 대한 microcentrifuge에서 14,000 rpm으로 centrifuged 아르 것은 제거하고, 새로운 튜브에 배치됩니다. 다음 클로로포름 / isoamyl 알콜 (24 / 1) 4 권이 추가되는 튜브는 부드럽게 5 분 거꾸로하고 있으며, 5 분 14,000 rpm으로 다시 centrifuged. </li><li> 각 예제에서 상단, 수성 단계는 다음 비이커에 0.1X TE 250 ML에 수레 47mm 왓먼 0.025 μm의 기공 디스크에 각 시료의 100μl을 찾는하여 1 시간 동안 dialyzed입니다. 단일 스트랜드 지역 또는 지점 지점과 복제 구조 전단에 더 취약하기 때문에, 우리는 일반적으로 입을 넓게하고 전단 세력을 최소화하기 위해 면도날과 함께 피펫 팁을 잘라. DNA는 제한 효소로 소화되기 전에는 일반적으로, pipetting이 최소로 보관해야합니다. </li><li> 각 샘플은 다음 복제의 기원에서 단 하류 플라스미드를 linearizes PvuII (뉴잉글랜드 Biolabs)으로 소화됩니다. </li><li> 전에 아가로 오스 겔, 100μl 클로로포름 및 Bromophenol 블루와 크실렌 Cyanol를 포함 배의 로딩 염료 20μl에 로딩하기 위해 각 샘플에 추가 혼합하고 있습니다. 그런 다음, 로딩 염료를 포함하는 수성 단계의 40μl가 젤로로드됩니다. 구조적 편견, 구조 유물, 그리고 DNA의 전단을 최소화하기 위해,이 절연 절차는 세포 용해 다음과 같은 단일 스트랜드 지역, 침전물, 또는 DNA 샘플을 집중을위한 풍부하게 어떤 단계를 포함하지 않습니다. </li></ol> 3. 2D 젤 및 남부 분석. <ol><li> 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 3 수정됩니다. 1 차원은 제한된 DNA 샘플은 1V/cm에서 1X TBE의 0.4 % 아가로 오스 겔을 통해 실행됩니다. 10X TBE 주식 솔루션 중 하나 리터가 포함되어 있습니다 : <ul><li> 108g 트리스베이스 </li><li> 55g 붕소의 소산 </li><li> 40 ML 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0) </li></ul></li><li> 람다 힌드 III 크기 마커가 처음 차선에 로드된 다음 샘플은 다른 모든 차선에로드됩니다. 우리는 일반적으로 최초의 D를 실행imension는 12-15 시간을 ~. 차선을 건너뛰는 것은 쉽게 두 번째 차원의 캐스팅으로 차선을 슬라이스 수 있습니다. 낮은 전압과 낮은 %의 아가로 오스 겔은 주로 크기에 따라 DNA 조각을 분리하는 역할을합니다. </li><li> 두 번째 차원 들어, 겔 차선은 큰 백정의 칼을 사용하여 첫 번째 차원 젤 밖으로 슬라이스하고 있습니다. 람다 힌드 III 마커를 포함하는 첫 번째 차선은 ethidium의 브로마이드 물들일 수 있습니다. 가이드, 농작물로 람다 힌드 III 마커를 사용하여 선형 플라스미드이 실행 것으로 예상됩니다 어디 아래 젤의 영역을 폐기. 이러한 조건에서 우리는 선형의 pBR322 약간 크실렌 cyanol가 얼룩 위에 실행 찾습니다. </li><li> 두 번째 차원을 캐스팅하기 위해 각 레인은 빈 젤 캐스터의 상단에 수평으로 배치됩니다. 1X TBE의 1.0 % 아가로 오스의 솔루션은 55 ° C. 준비 및 냉각 이때 젤 솔루션은 완전히 겔 조각 커버해야하고, 두 번째 차원을 캐스팅에 부어있다. 젤 설정되면, 그것은 버퍼가 recirculate 수있는 전기 장치에 6.5V/cm에서 실행됩니다. 우리는 일반적으로 두 번째 차원 ~ 5.5-7 시간을 실행합니다. 높은 전압과 높은 %의 아가로 오스 겔 효과적으로 DNA 그들의 형태에 따라 조각뿐만 아니라 크기를 분리합니다. 비선형 모양 두 번째 차원을 통해 더 느리게 실행됩니다. </li><li> 다음 전기는 젤은 다음 H 2 O에 씻어서이며, H 2 O와 씻어서 15 분 대한 0.25M 염산 400ml에 두 번 씻어, 다음 30 분 동안 두 번 400 ML 0.4M NaOH로 세탁. 산은보다 효율적으로 전송 작은 조각으로 부분적으로 닉에 DNA 분자를 제공 씻는다. 이 단계는 인해 큰 크기와 DNA 복제 중간체의 특이한 형태가 필요합니다. </li><li> 젤의 DNA는 다음 Hybond N로 전송됩니다 + 나일론 막 4. 우리는 0.4M NaOH와 아래 알칼리성 전송 시스템을 사용합니다. 간단히, 0.4M NaOH에 배어 압지 두 개의 시트는 종이 타올의 대형 스택에 배치됩니다. 나일론 막 또한 0.4M NaOH에 배어 및 압지 위에 위치합니다. 젤 그런 다음 조심스럽게 NaOH 용액에 침수 압지의 다른 조각에 의해 다음이 위에 계층입니다. 마지막으로, 침수 압지의 긴 부분은 상단에 계층이며이 끝나는이 심지 역할을 0.4M NaOH 용액 1 L를 포함하는 요리에 게재됩니다. 우리는 일반적으로 6-12 시간의 DNA 전달하자. </li><li> 나일론 막 제거, 배 SSC 버퍼에 20-30 초 씻어하고, 10.5ml Prehybridization 솔루션을 포함하는 하이브 리다이 제이션 롤러 병에 배치. 그런 다음 막은 ° C 회전 이상 6hrs에 대한 42 incubated입니다. Prehybridization 솔루션 : <ul><li> 5.0 ML 포름 아미드 </li><li> 0.5 ML 20% SDS </li><li> 2.5 ML 20X SSC의 * </li><li> 2.0 ML 50X Denhardt의 * </li><li> 0.5 ML 살몽 정자 DNA (10mg/ml) SSC와 Denhardt의에 대한 * 조리법은 5에서 찾을 수 있습니다 </li></ul></li><li> prehybridization 기간 동안, 플라스미드 pBR322 1 μg는 [32 P] - dCTP 분류 로체 사용 알파가 제공하는 프로토콜에 따라 닉 번역하여 32P로 표시됩니다. radiolabeled 프로브 (100μl)는 98에서 잠복기에 의해 변성됩니다 ° 다음 스크류 캡 microcentrifuge 관에서 10 분 C, 그리고 얼음에 즉시 배치. </li><li> 변성 프로브가 포함된 5.9 ML의 하이브 리다이 제이션 솔루션에 추가됩니다 : <ul><li> 3.0 ML 포름 아미드 </li><li> 1.5 ML SSC </li><li> 1.0 ML H 2 O </li><li> 0.15 ML 50X Denhardt의 </li><li> 0.10 ML 20% SDS </li><li> 0.15 ML 10mg/ml 살몽 정자 DNA </li></ul></li><li> prehybridization 솔루션은 롤러 병 밖으로 부어 있으며 하이브 리다이 제이션 솔루션은 롤러 병이 다음 12hrs 이상 42 ° C 배양기와 회전에 반환됩니다 인치 부어 있습니다. </li><li> 하이브 리다이 제이션 솔루션은 롤러 병 부어있다. 그런 다음, 얼룩이 회전 0.5X SSC, 42에서 0.1 % SDS ° C를 포함하는 세차 솔루션 ~ 150 ML와 롤러 병에 20 분 4 번 씻어입니다. </li><li> 액체가 가시 사라진 때까지 마지막 세척 후, 멤브레인는 종이 타월에 배치됩니다. 막 그런 다음 폴리비닐 염화물 - 플라스틱 포장에 싸여 phosphorimager 화면에 노출됩니다. 우리는 스톰 840과 관련 ImageQuant 소프트웨어를 사용하여 방사능을 시각화하고 계량. </li></ol> 4. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 플라스미드 복제 중간체는 UV - 유도된 DNA 손상의 존재와 부재에 보여집니다. PvuII의 마이 그 레이션 패턴이 2D - 아가로 오스 겔 - ​​분석에 의해 관찰된 플라스미드 pBR322를 소화 diagrammed입니다. 비 - 복제 선형 plasmids은 선형 4.4 - KB 조각으로 실행됩니다. 복제 plasmids 그들의 큰 크기로 인해 아닌 복제 조각보다 느리게 어떠한 마이 그 레이션되지 Y 모양의 구조를 형성nlinear 모양. 이 마이 그 레이션 패턴은 잘쪽으로 선형 영역에서 밖으로 뻗어 아크를 형성한다. 다음 UV - 조사를 두 번 Y 또는 X - 모양의 분자가 Y 모양의 분자의 아크보다 느리게 마이 그 레이션 원추 지역에서 관찰됩니다. 2D 젤 남부 분석 예제 32P - 라벨 pBR322와 탐지 즉시 UV 조사 및 UV 조사 (발행인의 허가를 재현) 후 15 분 후에 세포에 대해 표시됩니다.

<ol><li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li>
<li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li>
<li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22METHODS%3A+A+Companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning - A laboratory manual</a>. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li>
<li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork%3A+a+comparison+to+UV-induced+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecBCD+and+RecJ%2FRecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li>
<li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

UV - 유도된 손상의 존재와 부재의 야생 타입 세포에서 얻은 전형적인 결과는 그림 1에 표시됩니다. 세포가 급속하게 기하 급수적으로 성장 단계에있을 때 손상이없는 경우, 전체 플라스미드 DNA의 ~ 1 %가 Y 아크에서 찾을 수 있습니다. 차단 복제 포크가 손상 사이트에서 축적으로 조사에 따라, Y 모양 분자의 일시적 증가가 관찰됩니다. X - 모양의 복제 중간체는 또한 transiently 병변이 수리하는 경우와 상호 때까지 축적과 유지. 남부 분석 장소에서 복제 중간체는 정화, 플라스틱 빨대로 젤 밖으로 천공 수 있고, 전자 현미경으로 직접 관찰했다. 우리는 DNA 손상을 발생하고 이러한 돌연변이의 축적 이상 복제 중간체를 식별하는 복제 포크를 처리하는 데 필요한 유전자 제품을 식별하는 데 성공적으로이 방법을 사용했습니다. 또한,이 방법은 쉽게 DNA 손상의 다른 형태를 조사하기 위해 수정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>프로브 처리된 2D 젤의 서던 분석 예시</td><td>GE Healthcare</td><td>G15T8</td><td>Yellow Lighting</td></tr><tr><td>15 &amp;mu;watt 살균 램프</td><td>Sylvania</td><td>F20T12/GO</td><td>UV 램프</td></tr><tr><td>Blak-Ray UV 강도계 254nm</td><td>Daigger</td><td>EF28195T</td><td>UVC 광도계</td></tr><tr><td>0.025 &amp;mu;m 공극 디스크</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>VSWP04700</td><td>부유 투석 디스크</td></tr><tr><td>PvuII</td><td>Fermentas</td><td>ER0632</td><td>제한 내핵산분해효소</td></tr><tr><td>닉-번역 키트</td><td>Roche Group</td><td>976776</td><td>32P 표지 프로브 제작용</td></tr><tr><td>블로팅 페이퍼</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-704</td><td>서던 전이용</td></tr><tr><td>나일론 막</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203S</td><td>서던 전이용</td></tr></tbody></table>

에서 uv - 유도 복제 중간체의 시각화 e. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

DNA 손상의 존재에 정확 복제는 모든 세포 유형에서 관찰 널리 바로 인간 암의 개발과 관련된 것으로 세포 rearrangements 및 돌연변이 유발의 대부분을 담당하고 있습니다. 이러한 UV 방사선에 의해 유도되는 등 DNA의 손상, 심한 정확하게 게놈 템플릿을 복제 복제의 능력을 impairs. 유전자 제품의 숫자는 복제 템플릿에 DNA의 병변 생기면 필요한 것을 발견되었습니다. 그러나, 남은 과제는 복제하는 동안 어떻게 이러한 단백질 프로세스 병변을 확인할 수있다<em&gt; 생체내에</em&gt;. 모델 시스템으로 대장균을 사용하여, 우리는 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 복제 plasmids에 발생하는 구조 중간체를 식별하는 데 사용할 수있는 절차를 설명<em&gt; 생체내에</em&gt; UV - 유도된 DNA 손상에 따라. 이 절차는 UV - 유발 손상에 의해 차단 복제 포크가 RecA와 RecF 경로와 관련된 여러 유전자 제품에 의해 안정화되는 과도 반전을 받다는 것을 입증하는 데 사용되었습니다. 기술이 복제 중간체는 뉴클레오 티드 절단 수리 및 복제 다시 시작하여 병변의 제거와 상호 때까지 유지됩니다 보여줍니다.

우리는 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 UV 방사선 다음 발생하는 복제 중간체의 구조를 식별하는 데 사용될 수있는 절차를 제시한다.

에서 UV - 유도 복제 중간체의 시각화 E. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여

DNA 손상이 존재하는 상황에서의 부정확한 복제는 모든 세포 유형에서 관찰되는 세포 재배열 및 돌연변이 유발의 주된 원인이 됩니다...

이 절차의 전반적인 목표는 2차원 젤 분석을 사용하여 복제가 DNA 손상에 부딪혔을 때 발생하는 DNA 구조 중간체를 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 복제 차단 손상이 유도된 활성 분열 세포에서 DNA를 분리함으로써 수행됩니다. 그 후, 젤 전기영동을 사용하여 회수된 DNA를 크기별로 분리합니다.다음으로, 레인을 절단하여 두 번째 젤에 수평으로 다시 굳히는데, 이는 크기와 모양 모두에 기초하여 DNA를 추가로 분리하기 위함입니다. 마지막으로, Southern 분석을 통해 UV 유도 손상 도입 전과 도입 후 다양한 시점에서 복제 중인 DNA 단편과 연관된 DNA 구조를 시각화합니다. 궁극적으로, 이 절차는 특정 돌연변이체에서 DNA 병변을 처리하지 못하는 능력이 DNA 수선 중간체의 축적으로 이어진다는 것을 보여주는 데 사용될 수 있습니다.안녕하세요, 제 이름은 Arthur Ian입니다. 저는 포틀랜드 주립대학교의 Corella 연구실 소속입니다. 안녕하세요, 제 이름은 Brand she이며, 저 또한 Corella 연구실 소속입니다.오늘은 2차원 겔 전기영동 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 DNA 복제 및 복구 중간체를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.이 절차를 시작하려면, ampicillin이 포함된 DGC thigh 배지에서 PBR 3 22 플라스미드를 포함하는 e coli를 37 °C에서 200 µL 규모로 하룻밤 동안 배양하십시오. DGC thigh 배지를 사용하면 UV 차폐를 최소화할 수 있습니다. 하룻밤 배양 후, 세포를 14,000 rpm에서 30초 동안 원심분리하여 펠렛으로 만드십시오.그런 다음 세포 펠렛을 ampicillin이 포함되지 않은 200 µL의 DG C th 배지에 다시 현탁하여 접종합니다. ampicillin 선택 압력이 없는 20 mL의 DG C thigh 배지를 사용하여, 37 °C의 진탕 배양기에서 OD 600이 0.5(mL당 약 5×10⁸ cells에 해당)가 될 때까지 배양합니다. ampicillin 없이 배양하면 일부 돌연변이체에서 발생할 수 있는 비정상적이거나 비생산적인 복제 중간체에 대한 선택적 소실을 방지할 수 있습니다.또한, UV 광선을 사용하여 손상을 유도하는 경우, ampicillin이 해당 파장에서 강하게 흡수되어 세포를 보호함으로써 UV의 유효 선량을 감소시키기 때문에 배지에서 ampicillin을 제거해야 합니다. UVC

visualization-uv-induced-replication-intermediates-e-coli-using-two

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연구

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생물학

이 프로토콜은 실시간으로 개인 replisomes하여 DNA 복제를 시각화하기위한 간단한 단일 분자 형광 현미경 기술을 보여줍니다.

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

DT40, 모델 척추 유전 시스템은 단백질 기능을 분석하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 여기서 우리는 단일 분자 수준에서 DT40 세포에있는 S - 단계에서 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정성 분석을 수있는 간단한 방법을 설명합니다.

DNA 복제의 시각화는 척추 모델 시스템 DT40의 DNA 섬유 기술을 사용하여

출처: Mettrick, K. A., Lawrence 외, 형광 억제자 조작 시스템을 이용한 대장균 에서 부위 특이적 복제 차단 유도. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 아라비노스가 유도한 노란색 형광 단백질 표지 TetR의 발현을 이용해 대 장 균에서 부위특이적 복제 포크 차단을 시연하며, 이 단백질이 염색체 tetO 배열에 결합합니다.

대장균에서 형광 태그 억제 단백질 매개 복제 차단

출처: Bratton, B. P. 외, 『박테리아 세포의 3차원 영상 정밀 세포 표현과 단백질 위치 파악』. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 박테리아 세포의 3차원 형광 이미지를 획득하고 분석하여 단일 세포 수준에서 단백질 조직을 연구하는 방법을 시연합니다.

형광 영상을 통한 3차원 박테리아 단백질 분포 시각화

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

단일 분자 추적과 함께 Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)은 허용 라이브 대장균 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접 관찰 및 정량화.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

여기서는 대장균의 복제 분기점을 멈추고 붕괴시키기 위해 부위 특이적이고 가역적인 생체 내 단백질 블록을 사용하는 시스템을 설명합니다. 복제 블록의 설정은 형광 현미경으로 평가하고 중성 2차원 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 복제 중간체를 시각화합니다.

사이트 특정 복제 막힘의 유도<i&gt; E. 대장균</i&gt; 형광 리프레 운영자 시스템을 사용하여

접합은 두 개의 서로 다른 세포에 걸쳐 플라스미드 DNA를 동원하여 유익한 유전자의 확산을 촉진함으로써 수평적 유전자 전달을 매개합니다. 이 연구는 접합 플라스미드, 공여체 및 수용자에서 차등 마커를 사용하여 형질전환을 검출하는 것을 기반으로 접합 플라스미드 전달의 효율적인 검출을 위해 널리 사용되는 방법을 설명합니다.

대장균에서 천연 접합 플라스미드에 의해 매개되는 수평 유전자 전달의 검출

이 프로토콜은 CMG helicase에 의한 DNA 풀림의 실시간 시각화를 위한 단일 분자 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. (1) DNA 기질 준비, (2) 형광 표지된 Drosophila melanogaster CMG helicase를 정제하는 방법, (3) 전반사 형광(TIRF) 현미경 검사를 위한 미세유체 플로우 셀을 준비하는 방법, (4) 단일 분자 DNA 풀기 분석에 대해 설명합니다.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

여기에서는 2차원 겔 전기영동을 사용하여 병원성, 구조가 발생하기 쉬운 반복을 통한 복제 진행을 분석하는 절차를 간략하게 설명합니다.

SV40 기반 인간 에피솜 내에서 구조가 형성되기 쉬운 DNA 반복을 통한 복제의 전기영동 분석

배우세요 UV 손상 후 DNA 복제 중간체를 2차원 아가로오스 겔 전기영동과 서던 분석을 사용하여 E. coli에서 시각화하는 방법. 이 기술은 DNA 손상 반응과 복구 메커니즘 연구에 필수적입니다.

에서 UV - 유도 복제 중간체의 시각화 E. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여

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