에서 UV - 유도 복제 중간체의 시각화 E. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 2차원 겔 분석을 사용하여 복제가 DNA 병변을 만날 때 발생하는 DNA 구조 중간체를 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 복제를 막는 병변이 유도된 활발하게 분열하는 세포로부터 DNA를 분리함으로써 달성됩니다. 그런 다음 겔 전기영동을 사용하여 크기에 따라 복구 DNA를 분리합니다.

다음으로, 레인을 잘라내고 크기와 모양에 따라 DNA를 추가로 분리하는 두 번째 겔에서 수평으로 다시 주조합니다. 마지막으로, 남부 분석은 UV 유도 손상이 도입되기 전과 후에 때때로 복제되는 DNA 단편과 관련된 DNA 구조를 시각화하는 데 사용됩니다. 궁극적으로, 이 절차는 특정 돌연변이에서 DNA 병변을 처리할 수 없는 것이 DNA 복구 중간체의 축적을 초래한다는 것을 보여주는 데 사용될 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Arthur Ian입니다. 저는 포틀랜드 주립 대학의 코렐라 연구소에서 왔습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Brand she이고 저도 Corella Lab에서 왔습니다.

오늘은 2차원 겔 전기영동 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 DNA 복제를 연구하고 중간 생성물을 복구합니다. 시작하겠습니다.

이 절차를 시작하려면 섭씨 37도에서 암피실린과 함께 DGC 허벅지 배지에서 플라스미드 PBR 3 22를 함유하는 대장균의 하룻밤 배양을 200마이크로리터의 대장균 배양액을 배양합니다. DGC 허벅지 매체를 사용하여 UV 차폐를 최소화합니다. 하룻밤 배양 후 14, 000 RRP M에서 30초 동안 세포를 펠렛화합니다.

그런 다음 암피실린이 결핍된 200마이크로리터의 DG C th 배지에 세포 펠릿을 재현탁시키고 접종합니다.20밀리리터의 DG C 허벅지 배지는 암피실린 선택 없이 배양물을 성장시킵니다. 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터에서 OD 600 0.5(약 5 곱하기 10에서 8번째 세포에 해당)암피실린이 없는 밀리리터당 성장은 일부 돌연변이에서 발생할 수 있는 비정상적이거나 비생산적인 복제 중간체에 대한 선택을 피합니다.

또한 손상을 유도하기 위해 UV 광선을 사용하는 경우 이러한 파장에서 강하게 흡수하고 차폐하기 때문에 매체에서 암피실린을 제거해야 합니다. 세포가 성장하는 동안 세포는 UV의 유효 용량을 줄입니다. UVC 광도계를 사용하여 초당 미터 제곱미터당 약 1JUUL의 노출률을 생성하는 15와트 살균 램프로부터의 거리를 확인합니다.

후속 단계는 자외선 조사 후 광 리아제에 의한 cyclo butane perine dimers의 광 재활성화 역전을 방지하므로 황색광 아래에서 수행해야 합니다. 원하는 세포 밀도에 도달하면 피펫을 사용하여 배양물을 회전 플랫폼의 15cm 직경의 페트리 접시로 옮겨 전체 세포 집단에 대한 균일한 방사선 조사를 보장합니다. 다음으로, 배양액에 제곱미터당 50줄을 조사하고 즉시 멸균 예열 플라스크에 옮기고 섭씨 37도의 진탕하는 인큐베이터에 다시 넣습니다.

실험 기간 동안 이 용량은 검사할 각 시점에 대해 단일 가닥 DNA의 4.5km 염기마다 평균 1개의 사이클로 부탄 페린 이량체를 생성합니다. 0.75 밀리리터의 배양액을 0.75 밀리리터의 얼음 차가운 그물 30으로 피펫팅합니다. 버퍼 네트(30)는 복제 및 뉴클레오티드 절제 복구가 진행되는 것을 방지하는 정지 버퍼(stop buffer) 역할을 합니다.

스톱 버퍼가 추가되면 시간 코스가 끝날 때까지 샘플을 얼음 위에 보관할 수 있습니다. 시간 경과 후 각 샘플을 펠렛하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 150 마이크로 리터의 용해 완충액에서 섭씨 37도에서 20 분 동안 교반없이 세포를 용해합니다.

단일 가닥 영역 또는 분기점이 있는 복제를 복제하면 전단에 더 취약하기 때문에 면도날로 피펫 팁을 잘라 입을 넓히고 전단력을 최소화합니다. 일반적으로 피펫팅 및 교반은 DNA가 제한 효소로 절단된 후 용해 후 proteinase K와 sarcas 세포를 추가하고 1시간 동안 배양을 계속할 때까지 최소한으로 유지해야 합니다. 이것은 단백질과 관련된 DNA 단편을 방출하는 역할을 합니다.

활발하게 복제되는 DNA는 종종 단백질이나 막 복합체에 결합되어 있기 때문에 복제 단편의 수율을 높이는 데 도움이 됩니다. 1시간 후 각 샘플에 두 부피의 페놀을 넣고 튜브를 5분 동안 부드럽게 뒤집어 샘플을 추출합니다. 그런 다음 클로로포름, 이소아밀, 알코올 두 부피를 넣고 5분 더 튜브를 부드럽게 뒤집습니다.

다음으로, 14, 5 분 동안 마이크로 분리기에 있는 000 분당 회전수에 표본을 원심 분리하고 새로운 관으로 각 표본의 최고 수성 단계를 옮기십시오. 그런 다음 클로로포름 ISO 알코올 4 권을 넣고 다시 5 분 동안 튜브를 부드럽게 뒤집습니다. 샘플을 14, 000RPM에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.

비커에 250mL의 0.1xte 위에 투석막을 놓고 각 샘플 100마이크로리터를 멤브레인에 놓습니다. 투석 후 1시간 동안 샘플을 투석합니다. 각 샘플 80마이크로리터를 20마이크로리터의 효소 혼합물이 들어 있는 새로운 1.5밀리리터 튜브에 넣습니다.

섭씨 37도에서 밤새 샘플을 소화합니다. PV 2는 복제 기원에서 바로 다운스트림으로 플라스미드를 선형화합니다. 아그로스 겔을 로드하기 전에 클로로포름 100마이크로리터와 브로모를 함유한 6x 로딩 염료 20마이크로리터를 추가합니다.

각 샘플에 페놀 블루와 자일렌 시안을 넣고 클로로포름을 혼합하면 DNA 말단에 결합된 나머지 PV 2개를 벗겨냅니다. 1차원을 통해 제한된 DNA 샘플을 실행하여 2차원 aros gel 분석을 시작합니다. 먼저 하나의 XTBE에서 이전에 준비된 0.4%agros 젤의 첫 번째 레인에 Lambda hind 3 크기 마커를 로드합니다.

그런 다음 각 샘플에 대해 로딩 염료가 포함된 수성 상 40마이크로리터를 로드하고 겔 슬라이싱을 더 쉽게 하기 위해 레인을 건너뜁니다. 전기영동 후 1차원을 센티미터당 1볼트로 약 12-15시간 동안 실행합니다. 저전압 및 낮은 퍼센트의 AGROS 겔은 주로 크기에 따라 DNA 단편을 분리하는 역할을 합니다.

첫 번째 차원이 실행된 후 큰 정육점 칼을 사용하여 람다 암사슴 3 마커가 있는 첫 번째 레인을 잘라내고 아테륨 브로마이드로 염색합니다. 2차원의 경우, Lambda Hind 3 마커를 가이드 크롭으로 사용하여 대형 정육점 나이프를 사용하여 젤 레인을 잘라내고 각 레인에서 선형화된 플라스미드가 실행될 것으로 예상되는 아래 영역을 버립니다. 두 번째 차원을 캐스팅하려면 빈 젤 캐스터 상단에 각 조각을 수평으로 놓습니다.

하나의 XTBE에 1%AROS 용액을 준비하고 섭씨 55도로 냉각합니다. 냉각되면 젤 용액을 부어 2차원을 캐스팅하고 젤 조각을 완전히 덮도록 합니다. 젤을 붓기 전에 조각의 방향이 고르고 캐스터의 높이가 맞는지 확인하는 것이 중요합니다.

일단 젤이 굳으면, 버퍼가 고전압과 높은 퍼센트의 Agros 겔을 재순환시킬 수 있도록 하는 전기영동 장치에서 센티미터당 6.5vols로 2차원을 5시간 반에서 7시간 동안 실행하고, 모양과 크기에 따라 DNA 단편을 효과적으로 분리합니다. 비선형 형상은 전기영동 후 2차원을 통해 더 느리게 실행됩니다. 젤을 물에 한 번 헹군 다음 400 밀리리터의 0.25 몰 염산으로 부드러운 교반으로 15 분 동안 두 번 씻습니다.

산 세척제는 DNA 분자를 남부 분석 중에 더 효율적으로 전달되는 더 작은 조각으로 부분적으로 흠집을 내는 역할을 하며 DNA 복제 중간체의 큰 크기와 특이한 모양으로 인해 필요합니다. 알칼리 전달을 위해 젤을 준비하려면 젤을 물로 다시 헹군 다음 400ml의 0.4 몰 수산화나트륨으로 30분 동안 두 번 세척합니다. 젤에 있는 DNA는 이 절차의 쓰여진 부분에서 기술된 것과 같이 0.4 몰 수산화나트륨을 가진 하향 알칼리 이동 체계를 사용하여 나일론 막 플러스 높은 유대 n로 그 후에 옮겨지고, DNA 이동 후에 6 12 시간 동안 DNA 이동이 쓰여진 의정서에서 선술된 것과 같이 조사 혼성으로 계속하게 하십시오.

멤브레인을 조사하고 세척한 후에는 액체가 눈에 띄게 사라질 때까지 멤브레인을 종이 타월에 올려 놓습니다. 그런 다음 멤브레인을 폴리염화비닐 플라스틱 랩으로 감싸고 인광 이미저 스크린에 노출시킵니다. 마지막으로, 방사능은 폭풍 8 40 및 관련 이미지 퀀트를 사용하여 시각화하고 정량화할 수 있습니다.

2D aros 겔 분석으로 관찰된 PV 2 분해 PBR 3 22 플라스미드의 이동 패턴을 다이어그램으로 도표화했습니다. 비복제 선형 플라스미드는 선형 4.4KB 단편 복제 플라스미드 형태로 Y자형 구조로 실행되며, 크기가 크고 비선형 모양이기 때문에 비복제 단편보다 느리게 이동합니다. 이 이동 패턴은 선형 영역에서 UV 조사에 이어 웰을 향해 확장되는 호를 형성합니다.

이중 Y 또는 X 모양의 분자는 원뿔 영역에서 관찰되며 Y 자형 분자의 호보다 더 느리게 이동합니다. P32로 표지된 PBR 3 22로 프로빙된 2D 겔의 남쪽 분석의 예는 UV 조사 직후 및 UV 조사 직후 UV 조사 직후 15분 후의 세포에 대해 표시된다. 전체 혈장 DNA의 약 1%는 세포가 방사선 후 기하급수적으로 빠르게 성장할 때 Y호에서 발견될 수 있습니다.

YS 모양 분자의 일시적인 증가는 손상된 부위에 막힌 복제 분기점이 축적됨에 따라 관찰됩니다. L자형 복제 중간체는 또한 병변이 복구되는 시점과 상관관계가 있는 시간까지 일시적으로 축적되고 지속됩니다. 방금 2차원 겔 전기영동을 사용하여 DNA 복구 중간체를 시각화하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 수율을 감소시킬 수 있는 전단력을 인식하고 모든 샘플과 젤을 부드럽게 다루는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.