Name: 에서 UV - 유도 복제 중간체의 시각화 E. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 배우세요 UV 손상 후 DNA 복제 중간체를 2차원 아가로오스 겔 전기영동과 서던 분석을 사용하여 E. coli에서 시각화하는 방법. 이 기술은 DNA 손상 반응과 복구 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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우리가 실험실에서 작업이 NIGMS - NIH의 국립 과학 재단 (National Science Foundation)와 지역 부여 R15GM86839에서 경력을 수상 MCB0551798에 의해 지원됩니다.

1. 성장과 자외선 조사. <ol><li> 0.4 % 포도당, 0.2 % casamino의 지방산 및 10 μg / ML의 thymine (DGCthy 매체) 및 100 μg / ML 암피실린와 보충 데이비스 중간 1 자란 플라스미드 pBR322를 포함하는 새로운 숙박 문화의 200μl가 pelleted입니다. 세포 펠렛은 다음 암피실린을 부족한 200μl DGCthy 매체에 resuspended 및 DGCthy 매체 20 ML을 예방하는 데 사용됩니다. </li><li> 문화는 0.5의 OD 600 (~ 5 X 10 8 셀 / ML)를 37 떨고 인큐베이터에서 암피실린 선택 ° C 않고 재배하고 있습니다. 암피실린없는 성장은 어떤 돌연변이에서 발생할 수 비정상적인 또는 비생산적인 복제 중간체에 대한 선택을 방지합니다. 손상을 유발하는 자외선을 사용하는 경우는 자외선의 효과적인 복용량을 줄이고, 이러한 파장과 보호막 세포에서 강하게 흡수하기 때문에 또한, 미디어에서 암피실린의 제거가 필요합니다. </li><li> 노란 불빛 아래에서 일하는 문화가 교반을위한 회전 플랫폼에서 15cm 직경 페트리 접시에 배치됩니다. 우리의 문화는 UVC 광도계를 사용하여 측정됩니다 ~ 1 J/m2/sec의 노출 율을 생산하는 15 와트 살균 램프에서 거리에서 배치됩니다. 문화 50 J/m2와 조사 후 다시에 즉시 배치하는 실험 기간 동안 37 ° C 배양기를 흔들어. 이 약을 평균 1 cyclobutane pyrimidine 이합체 ssDNA의 모든 4.5 킬로바이트에서 생산하고 있습니다. 노란색 조명 photolyase로 cyclobutane의 pyrimidine의 dimers의 photoreactivati​​on - 반전을 방지할 수 있습니다. </li></ol> 2. DNA 격리. <ol><li> 복제 중간체가 검사 예정이다 때때로, 문화의 0.75 ML의 나누어지는는 0.75 ML 얼음 차가운 NET30 버퍼 (100 MM NaCl, 10 MM 트리스, 산도 8.0, 30 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))로 배치하고이 끝날 때까지 얼음에 위치 시간 코스입니다. 우리는 일반적으로 0 조사 샘플, 15, 30, 45, 60, 90 분, 90 분 시간 코스를 실행합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 차가운 온도를 효과적으로 복제 및 뉴클레오 티드 절단 수리를 중지 제공하고 있습니다. </li><li> 각 예제 1.5 MG / ML 라이 소 자임하고 TE 0.2 MG / ML RNaseA (10 MM 트리스, 산도 8.0, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 150 μl에 resuspended, 20 분 ° C 37 lysed 다음 pelleted입니다. 이 시점에서, 20 % sarkosyl의 proteinase K (10mg/ml)와 10μl의 10μl가 추가되며 부화는 1 시간을 위해 계속 허용됩니다. Proteinase K와 sarkosyl는 페놀 추출이 발생하기 전에 멤브레인 또는 단백질과 관련된 수의 DNA 조각을 출시하는 데 도움이됩니다. 적극적으로 복제 DNA가 흔히 단백질이나 막 단지에 바인딩되어 있기 때문에, 이것은 회복 아르 복제 조각의 수율을 높일 수 있습니다. </li><li> 샘플은 다음 각 샘플에 페놀 2 볼륨을 추가하고 튜브가 부드럽게 5 분 거꾸로 의해 압축이 풀립니다. 다음 클로로포름 / isoamyl 알콜 (24 / 1) 2 볼륨이 추가되고 튜브가 부드럽게 5 분 다시 반전됩니다. </li><li> 샘플 5 분, 각 샘플의 맨 수성 단계에 대한 microcentrifuge에서 14,000 rpm으로 centrifuged 아르 것은 제거하고, 새로운 튜브에 배치됩니다. 다음 클로로포름 / isoamyl 알콜 (24 / 1) 4 권이 추가되는 튜브는 부드럽게 5 분 거꾸로하고 있으며, 5 분 14,000 rpm으로 다시 centrifuged. </li><li> 각 예제에서 상단, 수성 단계는 다음 비이커에 0.1X TE 250 ML에 수레 47mm 왓먼 0.025 μm의 기공 디스크에 각 시료의 100μl을 찾는하여 1 시간 동안 dialyzed입니다. 단일 스트랜드 지역 또는 지점 지점과 복제 구조 전단에 더 취약하기 때문에, 우리는 일반적으로 입을 넓게하고 전단 세력을 최소화하기 위해 면도날과 함께 피펫 팁을 잘라. DNA는 제한 효소로 소화되기 전에는 일반적으로, pipetting이 최소로 보관해야합니다. </li><li> 각 샘플은 다음 복제의 기원에서 단 하류 플라스미드를 linearizes PvuII (뉴잉글랜드 Biolabs)으로 소화됩니다. </li><li> 전에 아가로 오스 겔, 100μl 클로로포름 및 Bromophenol 블루와 크실렌 Cyanol를 포함 배의 로딩 염료 20μl에 로딩하기 위해 각 샘플에 추가 혼합하고 있습니다. 그런 다음, 로딩 염료를 포함하는 수성 단계의 40μl가 젤로로드됩니다. 구조적 편견, 구조 유물, 그리고 DNA의 전단을 최소화하기 위해,이 절연 절차는 세포 용해 다음과 같은 단일 스트랜드 지역, 침전물, 또는 DNA 샘플을 집중을위한 풍부하게 어떤 단계를 포함하지 않습니다. </li></ol> 3. 2D 젤 및 남부 분석. <ol><li> 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 3 수정됩니다. 1 차원은 제한된 DNA 샘플은 1V/cm에서 1X TBE의 0.4 % 아가로 오스 겔을 통해 실행됩니다. 10X TBE 주식 솔루션 중 하나 리터가 포함되어 있습니다 : <ul><li> 108g 트리스베이스 </li><li> 55g 붕소의 소산 </li><li> 40 ML 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0) </li></ul></li><li> 람다 힌드 III 크기 마커가 처음 차선에 로드된 다음 샘플은 다른 모든 차선에로드됩니다. 우리는 일반적으로 최초의 D를 실행imension는 12-15 시간을 ~. 차선을 건너뛰는 것은 쉽게 두 번째 차원의 캐스팅으로 차선을 슬라이스 수 있습니다. 낮은 전압과 낮은 %의 아가로 오스 겔은 주로 크기에 따라 DNA 조각을 분리하는 역할을합니다. </li><li> 두 번째 차원 들어, 겔 차선은 큰 백정의 칼을 사용하여 첫 번째 차원 젤 밖으로 슬라이스하고 있습니다. 람다 힌드 III 마커를 포함하는 첫 번째 차선은 ethidium의 브로마이드 물들일 수 있습니다. 가이드, 농작물로 람다 힌드 III 마커를 사용하여 선형 플라스미드이 실행 것으로 예상됩니다 어디 아래 젤의 영역을 폐기. 이러한 조건에서 우리는 선형의 pBR322 약간 크실렌 cyanol가 얼룩 위에 실행 찾습니다. </li><li> 두 번째 차원을 캐스팅하기 위해 각 레인은 빈 젤 캐스터의 상단에 수평으로 배치됩니다. 1X TBE의 1.0 % 아가로 오스의 솔루션은 55 ° C. 준비 및 냉각 이때 젤 솔루션은 완전히 겔 조각 커버해야하고, 두 번째 차원을 캐스팅에 부어있다. 젤 설정되면, 그것은 버퍼가 recirculate 수있는 전기 장치에 6.5V/cm에서 실행됩니다. 우리는 일반적으로 두 번째 차원 ~ 5.5-7 시간을 실행합니다. 높은 전압과 높은 %의 아가로 오스 겔 효과적으로 DNA 그들의 형태에 따라 조각뿐만 아니라 크기를 분리합니다. 비선형 모양 두 번째 차원을 통해 더 느리게 실행됩니다. </li><li> 다음 전기는 젤은 다음 H 2 O에 씻어서이며, H 2 O와 씻어서 15 분 대한 0.25M 염산 400ml에 두 번 씻어, 다음 30 분 동안 두 번 400 ML 0.4M NaOH로 세탁. 산은보다 효율적으로 전송 작은 조각으로 부분적으로 닉에 DNA 분자를 제공 씻는다. 이 단계는 인해 큰 크기와 DNA 복제 중간체의 특이한 형태가 필요합니다. </li><li> 젤의 DNA는 다음 Hybond N로 전송됩니다 + 나일론 막 4. 우리는 0.4M NaOH와 아래 알칼리성 전송 시스템을 사용합니다. 간단히, 0.4M NaOH에 배어 압지 두 개의 시트는 종이 타올의 대형 스택에 배치됩니다. 나일론 막 또한 0.4M NaOH에 배어 및 압지 위에 위치합니다. 젤 그런 다음 조심스럽게 NaOH 용액에 침수 압지의 다른 조각에 의해 다음이 위에 계층입니다. 마지막으로, 침수 압지의 긴 부분은 상단에 계층이며이 끝나는이 심지 역할을 0.4M NaOH 용액 1 L를 포함하는 요리에 게재됩니다. 우리는 일반적으로 6-12 시간의 DNA 전달하자. </li><li> 나일론 막 제거, 배 SSC 버퍼에 20-30 초 씻어하고, 10.5ml Prehybridization 솔루션을 포함하는 하이브 리다이 제이션 롤러 병에 배치. 그런 다음 막은 ° C 회전 이상 6hrs에 대한 42 incubated입니다. Prehybridization 솔루션 : <ul><li> 5.0 ML 포름 아미드 </li><li> 0.5 ML 20% SDS </li><li> 2.5 ML 20X SSC의 * </li><li> 2.0 ML 50X Denhardt의 * </li><li> 0.5 ML 살몽 정자 DNA (10mg/ml) SSC와 Denhardt의에 대한 * 조리법은 5에서 찾을 수 있습니다 </li></ul></li><li> prehybridization 기간 동안, 플라스미드 pBR322 1 μg는 [32 P] - dCTP 분류 로체 사용 알파가 제공하는 프로토콜에 따라 닉 번역하여 32P로 표시됩니다. radiolabeled 프로브 (100μl)는 98에서 잠복기에 의해 변성됩니다 ° 다음 스크류 캡 microcentrifuge 관에서 10 분 C, 그리고 얼음에 즉시 배치. </li><li> 변성 프로브가 포함된 5.9 ML의 하이브 리다이 제이션 솔루션에 추가됩니다 : <ul><li> 3.0 ML 포름 아미드 </li><li> 1.5 ML SSC </li><li> 1.0 ML H 2 O </li><li> 0.15 ML 50X Denhardt의 </li><li> 0.10 ML 20% SDS </li><li> 0.15 ML 10mg/ml 살몽 정자 DNA </li></ul></li><li> prehybridization 솔루션은 롤러 병 밖으로 부어 있으며 하이브 리다이 제이션 솔루션은 롤러 병이 다음 12hrs 이상 42 ° C 배양기와 회전에 반환됩니다 인치 부어 있습니다. </li><li> 하이브 리다이 제이션 솔루션은 롤러 병 부어있다. 그런 다음, 얼룩이 회전 0.5X SSC, 42에서 0.1 % SDS ° C를 포함하는 세차 솔루션 ~ 150 ML와 롤러 병에 20 분 4 번 씻어입니다. </li><li> 액체가 가시 사라진 때까지 마지막 세척 후, 멤브레인는 종이 타월에 배치됩니다. 막 그런 다음 폴리비닐 염화물 - 플라스틱 포장에 싸여 phosphorimager 화면에 노출됩니다. 우리는 스톰 840과 관련 ImageQuant 소프트웨어를 사용하여 방사능을 시각화하고 계량. </li></ol> 4. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 플라스미드 복제 중간체는 UV - 유도된 DNA 손상의 존재와 부재에 보여집니다. PvuII의 마이 그 레이션 패턴이 2D - 아가로 오스 겔 - ​​분석에 의해 관찰된 플라스미드 pBR322를 소화 diagrammed입니다. 비 - 복제 선형 plasmids은 선형 4.4 - KB 조각으로 실행됩니다. 복제 plasmids 그들의 큰 크기로 인해 아닌 복제 조각보다 느리게 어떠한 마이 그 레이션되지 Y 모양의 구조를 형성nlinear 모양. 이 마이 그 레이션 패턴은 잘쪽으로 선형 영역에서 밖으로 뻗어 아크를 형성한다. 다음 UV - 조사를 두 번 Y 또는 X - 모양의 분자가 Y 모양의 분자의 아크보다 느리게 마이 그 레이션 원추 지역에서 관찰됩니다. 2D 젤 남부 분석 예제 32P - 라벨 pBR322와 탐지 즉시 UV 조사 및 UV 조사 (발행인의 허가를 재현) 후 15 분 후에 세포에 대해 표시됩니다.

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<li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork%3A+a+comparison+to+UV-induced+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

UV - 유도된 손상의 존재와 부재의 야생 타입 세포에서 얻은 전형적인 결과는 그림 1에 표시됩니다. 세포가 급속하게 기하 급수적으로 성장 단계에있을 때 손상이없는 경우, 전체 플라스미드 DNA의 ~ 1 %가 Y 아크에서 찾을 수 있습니다. 차단 복제 포크가 손상 사이트에서 축적으로 조사에 따라, Y 모양 분자의 일시적 증가가 관찰됩니다. X - 모양의 복제 중간체는 또한 transiently 병변이 수리하는 경우와 상호 때까지 축적과 유지. 남부 분석 장소에서 복제 중간체는 정화, 플라스틱 빨대로 젤 밖으로 천공 수 있고, 전자 현미경으로 직접 관찰했다. 우리는 DNA 손상을 발생하고 이러한 돌연변이의 축적 이상 복제 중간체를 식별하는 복제 포크를 처리하는 데 필요한 유전자 제품을 식별하는 데 성공적으로이 방법을 사용했습니다. 또한,이 방법은 쉽게 DNA 손상의 다른 형태를 조사하기 위해 수정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>프로브 처리된 2D 젤의 서던 분석 예시</td><td>GE Healthcare</td><td>G15T8</td><td>Yellow Lighting</td></tr><tr><td>15 &amp;mu;watt 살균 램프</td><td>Sylvania</td><td>F20T12/GO</td><td>UV 램프</td></tr><tr><td>Blak-Ray UV 강도계 254nm</td><td>Daigger</td><td>EF28195T</td><td>UVC 광도계</td></tr><tr><td>0.025 &amp;mu;m 공극 디스크</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>VSWP04700</td><td>부유 투석 디스크</td></tr><tr><td>PvuII</td><td>Fermentas</td><td>ER0632</td><td>제한 내핵산분해효소</td></tr><tr><td>닉-번역 키트</td><td>Roche Group</td><td>976776</td><td>32P 표지 프로브 제작용</td></tr><tr><td>블로팅 페이퍼</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-704</td><td>서던 전이용</td></tr><tr><td>나일론 막</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203S</td><td>서던 전이용</td></tr></tbody></table>

에서 uv - 유도 복제 중간체의 시각화 e. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

DNA 손상의 존재에 정확 복제는 모든 세포 유형에서 관찰 널리 바로 인간 암의 개발과 관련된 것으로 세포 rearrangements 및 돌연변이 유발의 대부분을 담당하고 있습니다. 이러한 UV 방사선에 의해 유도되는 등 DNA의 손상, 심한 정확하게 게놈 템플릿을 복제 복제의 능력을 impairs. 유전자 제품의 숫자는 복제 템플릿에 DNA의 병변 생기면 필요한 것을 발견되었습니다. 그러나, 남은 과제는 복제하는 동안 어떻게 이러한 단백질 프로세스 병변을 확인할 수있다<em&gt; 생체내에</em&gt;. 모델 시스템으로 대장균을 사용하여, 우리는 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 복제 plasmids에 발생하는 구조 중간체를 식별하는 데 사용할 수있는 절차를 설명<em&gt; 생체내에</em&gt; UV - 유도된 DNA 손상에 따라. 이 절차는 UV - 유발 손상에 의해 차단 복제 포크가 RecA와 RecF 경로와 관련된 여러 유전자 제품에 의해 안정화되는 과도 반전을 받다는 것을 입증하는 데 사용되었습니다. 기술이 복제 중간체는 뉴클레오 티드 절단 수리 및 복제 다시 시작하여 병변의 제거와 상호 때까지 유지됩니다 보여줍니다.

우리는 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 UV 방사선 다음 발생하는 복제 중간체의 구조를 식별하는 데 사용될 수있는 절차를 제시한다.

에서 UV - 유도 복제 중간체의 시각화 E. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여

DNA 손상이 존재하는 상황에서의 부정확한 복제는 모든 세포 유형에서 관찰되는 세포 재배열 및 돌연변이 유발의 주된 원인이 됩니다...

이 절차의 전반적인 목표는 2차원 젤 분석을 사용하여 복제가 DNA 손상에 부딪혔을 때 발생하는 DNA 구조 중간체를 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 복제 차단 손상이 유도된 활성 분열 세포에서 DNA를 분리함으로써 수행됩니다. 그 후, 젤 전기영동을 사용하여 회수된 DNA를 크기별로 분리합니다.다음으로, 레인을 절단하여 두 번째 젤에 수평으로 다시 굳히는데, 이는 크기와 모양 모두에 기초하여 DNA를 추가로 분리하기 위함입니다. 마지막으로, Southern 분석을 통해 UV 유도 손상 도입 전과 도입 후 다양한 시점에서 복제 중인 DNA 단편과 연관된 DNA 구조를 시각화합니다. 궁극적으로, 이 절차는 특정 돌연변이체에서 DNA 병변을 처리하지 못하는 능력이 DNA 수선 중간체의 축적으로 이어진다는 것을 보여주는 데 사용될 수 있습니다.안녕하세요, 제 이름은 Arthur Ian입니다. 저는 포틀랜드 주립대학교의 Corella 연구실 소속입니다. 안녕하세요, 제 이름은 Brand she이며, 저 또한 Corella 연구실 소속입니다.오늘은 2차원 겔 전기영동 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 DNA 복제 및 복구 중간체를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.이 절차를 시작하려면, ampicillin이 포함된 DGC thigh 배지에서 PBR 3 22 플라스미드를 포함하는 e coli를 37 °C에서 200 µL 규모로 하룻밤 동안 배양하십시오. DGC thigh 배지를 사용하면 UV 차폐를 최소화할 수 있습니다. 하룻밤 배양 후, 세포를 14,000 rpm에서 30초 동안 원심분리하여 펠렛으로 만드십시오.그런 다음 세포 펠렛을 ampicillin이 포함되지 않은 200 µL의 DG C th 배지에 다시 현탁하여 접종합니다. ampicillin 선택 압력이 없는 20 mL의 DG C thigh 배지를 사용하여, 37 °C의 진탕 배양기에서 OD 600이 0.5(mL당 약 5×10⁸ cells에 해당)가 될 때까지 배양합니다. ampicillin 없이 배양하면 일부 돌연변이체에서 발생할 수 있는 비정상적이거나 비생산적인 복제 중간체에 대한 선택적 소실을 방지할 수 있습니다.또한, UV 광선을 사용하여 손상을 유도하는 경우, ampicillin이 해당 파장에서 강하게 흡수되어 세포를 보호함으로써 UV의 유효 선량을 감소시키기 때문에 배지에서 ampicillin을 제거해야 합니다. UVC 광도계를 사용하여 m²당 초당 약 1 J/m²·s의 노출률을 생성하는 15W 살균 램프로부터의 거리를 결정하십시오.UV 조사 후 포토라이아제(photo liase)에 의한 사이클로부탄 피리미딘 이량체(cyclo butane perine dimers)의 광재활성화를 방지하기 위해, 이후 단계는 황색광 아래에서 수행해야 합니다. 원하는 세포 밀도에 도달하면, 피펫을 사용하여 배양물을 회전 플랫폼 위의 직경 15 centimeter 페트리 접시로 옮겨 전체 세포 집단에 균일하게 조사가 이루어지도록 합니다. 다음으로, 배양물에 50 joules per meter squared로 조사한 후 즉시 멸균된 예열 플라스크로 옮겨 37 degrees Celsius 진탕 배양기에 다시 넣습니다.실험 기간 동안, 이 용량은 분석 대상이 되는 각 시점마다 단일 가닥 DNA 4.5 kb당 평균적으로 하나의 사이클로부탄 피리미딘 이량체(cyclo butane pyrimidine dimer)를 생성합니다. 배양액 0.75 mL 분량을 얼음처럼 차가운 net 30 완충액 0.75 mL에 피펫으로 옮깁니다. net 30 완충액은 복제 및 뉴클레오타이드 절제 복구가 진행되는 것을 방지하는 정지 완충액 역할을 합니다.스톱 버퍼(stop buffer)를 첨가한 후, 시료는 타임 코스가 종료될 때까지 얼음 위에 보관할 수 있습니다. 타임 코스가 완료되면 각 시료를 펠렛화하고 펠렛을 재현탁합니다. 150 µL의 용해 버퍼(lysis buffer)를 사용하여 37 °C에서 20분 동안 교반 없이 세포를 용해합니다.단일 가닥 영역이나 분기점이 있는 복제 구조는 전단력에 더 취약하므로, 면도날로 피펫 팁의 끝을 잘라 입구를 넓게 만들어 전단력을 최소화하십시오. 일반적으로 제한 효소로 DNA를 소화하기 전까지는 피펫팅과 교반을 최소한으로 유지해야 합니다. 용해 후, proteinase K와 sarcas cell을 첨가하고 1시간 동안 배양을 계속하십시오. 이는 단백질과 결합된 DNA 단편을 방출시키는 역할을 합니다.활발하게 복제 중인 DNA는 종종 단백질 또는 막 복합체에 결합되어 있으므로, 이 과정은 복제 단편의 수득량을 높이는 데 도움이 됩니다. 1시간 후, 각 샘플에 2배 부피의 페놀을 첨가하고 튜브를 5분 동안 부드럽게 뒤집어 샘플을 추출하십시오. 그런 다음 2배 부피의 클로로포름, 이소아밀 알코올을 첨가하고 다시 5분 동안 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞으십시오.다음으로, 마이크로 원심분리기를 사용하여 샘플을 14,000 RPM에서 5분 동안 원심분리한 후, 각 샘플의 상층 수성층을 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 4배 부피의 클로로포름-이소아밀 알코올을 첨가하고, 다시 튜브를 5분 동안 부드럽게 전도 혼합합니다. 샘플을 14,000 RPM에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.비커에 담긴 250 milliliters의 0.1 xte 위에 투석막을 놓고, 막 위에 각 샘플 100 microliters를 점적합니다. 투석 후 1시간 동안 샘플을 투석시킵니다. 20 microliters의 효소 혼합액이 들어 있는 새로운 1.5 milliliter 튜브에 각 샘플 80 microliters를 넣습니다.시료를 37 °C에서 밤새 소화시킵니다. PV two는 복제 원점 바로 하류에서 플라스미드를 선형화합니다. 아가로스 겔에 로딩하기 전, 클로로포름 100 µL와 bromo가 포함된 6 x 로딩 다이 20 µL를 첨가합니다.각 샘플에 페놀 블루와 자일렌 시안을 첨가하고 혼합합니다. 클로로포름은 DNA 말단에 결합된 잔류 PV two를 제거합니다. 제한 효소 처리된 DNA 샘플을 1차 차원으로 전기영동하여 2차원 아가로스 겔 분석을 시작합니다. 먼저, 이전에 준비한 1x TBE 내의 0.4% 아가로스 겔의 첫 번째 레인에 Lambda hind three 크기 마커를 로딩합니다.그다음 각 샘플에 대해 로딩 다이(loading dye)가 포함된 수성 상 40 µL를 로딩하며, 겔 절단(gel slicing)을 용이하게 하기 위해 레인을 띄워줍니다. 전기영동 후, 1차원 분리를 위해 1 V/cm의 전압으로 약 12~15시간 동안 가동합니다. 낮은 전압과 낮은 농도의 AGROS 겔은 주로 크기에 따라 DNA 단편을 분리하는 역할을 합니다.1차 전기영동이 완료되면, 대형 정육 칼을 사용하여 Lambda hind three 마커가 포함된 첫 번째 레인을 잘라내고 브로모이드(atherium bromide)로 염색합니다. 2차 전기영동을 위해, Lambda Hind three 마커를 가이드로 삼아 대형 정육 칼로 겔 레인을 절단하고, 각 레인에서 선형화된 플라스미드가 나타날 것으로 예상되는 지점 아래 영역은 잘라내어 폐기합니다. 2차 전기영동용 겔을 제작하려면, 각 절단편을 빈 겔 캐스터 상단에 가로로 배치합니다.XTBE 1개에 1% AROS 용액을 조제하고 55°C까지 식힙니다. 충분히 식으면 2차원 전개용 젤을 캐스팅하기 위해 젤 용액을 붓되, 젤 슬라이스가 완전히 덮이도록 합니다. 젤을 붓기 전에 슬라이스가 균일하게 배치되었는지와 캐스터의 수평 상태를 확인하는 것이 중요합니다.겔이 굳으면, 버퍼가 재순환되는 전기영동 장치에서 6.5 vols/cm의 전압으로 5.5~7시간 동안 2차원 전기영동을 수행합니다. 고전압과 고농도 Agros 겔은 DNA 단편을 크기뿐만 아니라 형태에 따라 효과적으로 분리합니다. 비선형 형태의 단편은 전기영동 후 2차원상에서 더 느리게 이동합니다. 겔을 물로 한 번 헹군 다음, 0.25 M 염산 400 mL에서 완만하게 교반하며 15분 동안 두 번 세척합니다.산 세척은 DNA 분자를 부분적으로 닉(nick)하여 더 작은 단편으로 나누는 역할을 하며, 이는 서던 분석 시 전이 효율을 높이기 위함입니다. 또한, DNA 복제 중간체의 크기가 크고 형태가 특이하기 때문에 이 과정이 필수적입니다. 알칼리 전이를 위해 겔을 준비하려면, 겔을 물로 다시 헹군 다음 0.4 molar 수산화나트륨 400 milliliters에서 30분 동안 두 번 세척합니다. 그 후, 본 절차의 서면 부분에 기술된 대로 0.4 molar 수산화나트륨을 사용하는 하향식 알칼리 전이 시스템을 이용하여 겔 내의 DNA를 high bond n plus 나일론 막으로 전이시킵니다. DNA 전이를 6~12시간 동안 진행한 후, 서면 프로토콜에 안내된 대로 프로브 하이브리드화를 이어서 수행합니다.멤브레인의 프로빙과 세척이 완료되면, 액체가 눈에 띄게 사라질 때까지 멤브레인을 페이퍼 타월 위에 올려둡니다. 그 다음 멤브레인을 폴리염화비닐(polyvinyl chloride) 플라스틱 랩으로 감싸고 포스포이미저 스크린에 노출시킵니다. 마지막으로, storm eight 40 및 관련 image quant를 사용하여 방사능을 시각화하고 정량화할 수 있습니다.2D agarose 겔 분석으로 관찰한 PvuII로 절단된 pBR322 플라스미드의 이동 패턴을 도식화하였습니다. 비복제 선형 플라스미드는 4.4 KB의 선형 단편으로 이동하며, 복제 중인 플라스미드는 Y자형 구조를 형성하여 더 큰 크기와 비선형 모양으로 인해 비복제 단편보다 느리게 이동합니다. 이러한 이동 패턴은 UV 조사 후 선형 영역에서 웰(well) 방향으로 뻗어 나가는 호(arc) 형태를 이룹니다.원추 영역에서 이중 Y형 또는 X형 분자들이 관찰되며, 이들은 Y형 분자들의 호(arc)보다 더 느리게 이동합니다. UV 조사 직후 및 UV 조사 15분 후의 세포에 대해 P 32로 표지된 PBR 3 22로 프로빙한 2D 젤의 남쪽 분석 예시가 나타나 있습니다. 조사 후 세포가 지수 성장기에 빠르게 성장할 때, 전체 플라스미드 DNA의 약 1%가 Y 호에서 발견될 수 있습니다.손상된 부위에 차단된 복제 포크가 축적됨에 따라 Y-형 분자의 일시적인 증가가 관찰됩니다. L-형 복제 중간체 또한 일시적으로 축적되며, 병변이 복구되는 시점과 상관관계가 있을 때까지 지속됩니다. 지금까지 2차원 젤 전기영동을 사용하여 DNA 복구 중간체를 시각화하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때, 수율을 감소시킬 수 있는 전단력에 주의하고 모든 시료와 젤을 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

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DNA 복제의 시각화는 척추 모델 시스템 DT40의 DNA 섬유 기술을 사용하여

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