Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

이 실험 절차의 전반적인 목표는 살아있는 박테리아 세포 내에서 DNA 결합 단백질의 활성을 직접 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이는 관심 있는 DNA 결합 단백질에 광활성 형광 단백질을 융합하여 발현시킨 세포를 시각화함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 이미징 과정에서 개별 단백질이 광활성화되는 모습을 동영상으로 획득하는 것입니다.

그런 다음 데이터를 분석하여 단백질의 위치를 결정하고 단일 세포 내의 단백질을 추적합니다. DNA 결합 사건은 단일 단백질이 염색체와 접촉할 때 확산 계수가 변화하는 것을 통해 식별됩니다. 최종적으로, 세포당 결합된 단백질과 확산되는 단백질의 수를 계산함으로써 단일 세포 수준에서 단백질-DNA 상호작용의 정량적 측정값을 제공할 수 있습니다.

이 방법은 생체 내(in vivo) 수선 속도 및 수선 부위의 공간적 분포와 같이 DNA 수선 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이제 살아있는 e coli 세포에서 DNA polymerase one의 수선 활성을 측정하여 이 방법을 시연하겠습니다. 먼저, 500 °C의 가열로에서 1시간 동안 가열하여 배경 형광 입자가 없는 커버슬립을 제작하십시오. 두께 1.5번의 커버슬립 스톡을 준비하여 가열한 후, 알루미늄 호일에 싸서 실온에 보관하십시오.

이들은 향후 몇 주 동안 보관이 가능합니다. 다음으로, 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 AB 1157 poly a PA m cherry 균주의 초기 지수 성장기 E coli 1 mL를 넣고 농축합니다. 세포를 2,300 G에서 5분 동안 원심분리하십시오.

상층액을 제거하고 세포 펠릿을 20 µL의 잔류 배지로 재현탁한 후, 볼텍싱하여 세포를 완전히 용해시킵니다. 다음으로, 증류수를 사용하여 1.5% 저형광 aros 용액을 조제합니다. 메틸 메탄 설포네이트(MMS)를 이용한 DNA 손상 실험을 위해, 녹인 aeros 500 µL와 2x 최소 배지 500 µL를 혼합하며, 이때 주의 사항을 준수하여 피펫팅으로 몇 번 부드럽게 섞어줍니다.

혼합물이 식기 전에, 500 µL의 최소 배지에 8.3 µL의 MMS를 첨가한 후 aros와 혼합합니다. 이를 가열 소독한 커버슬립 위에 도포합니다. 기포가 생기지 않도록 중앙에 고르게 펴 바릅니다.

두 번째 소성 커버슬립으로 패드를 평평하게 누릅니다. 식은 후 패드 위의 상단 커버를 제거하고 농축된 세포 현탁액 1 µL를 추가합니다. 새 소성 커버슬립으로 패드를 덮고 매우 살짝 눌러 세포를 고정합니다.

세포가 건조되기 전인 45분 이내에 이미징을 수행해야 합니다. 이 시간을 연장하려면, DNA 손상 실험의 경우 패드를 실리콘 가스켓 내부로 밀봉할 수 있습니다. 이미징 전에 세포를 패드 위에서 20분 동안 배양하십시오.

실온의 가습 챔버 내에 위치한 이 현미경은 405 nanometer 광활성화 레이저와 561 nanometer 여기 레이저를 갖추고 있습니다. 고경사 조명을 사용하여 커버슬립 표면 위의 얇은 단면 내에 있는 형광체만을 여기시킴으로써 단일 분자 민감도를 구현하며, 형광 방출은 전자 증배 CCD 카메라로 기록됩니다. 샘플을 현미경 스테이지 위에 놓고 세포의 초점을 맞추십시오.

투과광 조명 하에서, 데이터 크기를 줄이고 카메라 판독 속도를 높이기 위해 잘라내기 영역(cropped field of view)을 설정하십시오. 주변광으로부터 샘플을 차단하고, 단일 형광 4번 검출을 위해 전자 증배 CCD 카메라의 게인을 켜십시오. 프레임 속도를 프레임당 15.26 milliseconds로 설정하십시오.

여기에는 0.26 millisecond의 카메라 판독 시간이 포함됩니다. 노출 시간은 모션 블러가 거의 없는 선명한 형광 점을 관찰할 수 있을 만큼 충분히 짧아야 합니다. 반면, 결합된 분자와 확산되는 분자를 명확하게 구분하기 위해서는 트랙을 충분히 긴 시간 간격으로 샘플링해야 합니다. 이제 카메라 데이터를 표시하여 암전 배경 신호를 확인하십시오.

561 nm 레이저를 켜고 여기 배경 신호를 확인합니다. Paul one PA M cherry 융합 단백질의 광활성화를 위해 405 nm 레이저를 켜고, 단일 분자의 형광 반점이 나타날 때까지 강도를 높입니다. 이제 여기 빔의 각도를 조절하여 시료의 얇은 단면만 조사되도록 합니다.

커버스립 표면을 덮습니다. 이 방법은 단일 형광 단백질의 검출 및 정밀한 위치 확인에 의존하므로, 데이터 품질을 위해서는 현미경의 최적 정렬과 감도가 매우 중요합니다. 이를 위해 레이저 빔을 100 x 수치구경(numerical aperture) 1.4 대물렌즈의 후초점면에 집중시키십시오.

집속 렌즈를 빔과 수직 방향으로 이동시키면 초점이 대물렌즈 중심에서 벗어나 빔이 대물렌즈를 비스듬한 각도로 통과하게 됩니다. 형광 강도는 최대화하고 배경 신호는 최소화하도록 빔을 조정하십시오. 투과광 현미경 모드에서 세포의 새로운 시야를 찾고 이미지의 초점을 맞추십시오.

카메라 스냅샷을 촬영하여 세포 윤곽을 기록합니다. 561 nanometer 레이저를 켜고 세포의 자가 형광과 커버 슬립 위의 배경 반점들을 표백합니다. 몇 초 동안 유지합니다.

데이터 획득을 시작하기 전에, 561 nm 연속 여기 조건에서 palm 영상을 획득하기 시작하십시오. 405 nm 레이저를 켜고 영상 촬영 과정 동안 강도를 점진적으로 높여 최대 1 W/cm²에 도달하게 하십시오. 세포 자가형광을 유발하는 더 높은 405 nm 강도는 피하십시오.

형광 분자의 밀도에 주의하십시오. 형광 반점들이 각 프레임에서 명확하게 분리될 수 있도록 활성화 속도를 낮게 유지하는 것이 중요합니다. 동영상 하나당 약 10,000 프레임을 기록하며, 시야(field of view)를 크롭할 경우 일반적으로 최대 3분이 소요되며 하드 디스크 공간은 최대 1GB까지 차지합니다.

한 번 이미징된 시야의 pa m cherry 형광체는 가역적으로 표백되어 더 이상 관찰할 수 없음에 유의하십시오. 다시 한번 언급하지만, 다음 절차에는 matlab의 맞춤형 소프트웨어가 사용됩니다. 단일 형광체는 점 퍼짐 함수 또는 psfs로 나타납니다.

영상에서 PSF는 먼저 직경이 7픽셀인 가우시안 커널을 사용하여 밴드패스 필터링된 이미지에서 식별됩니다. 후보 위치는 피크 픽셀 강도가 배경의 표준 편차보다 4.5배 높은 PSF에 해당합니다. 후보 PSF당 국소적으로 가장 밝은 픽셀이 타원형 가우시안 함수 피팅을 위한 초기 추정값으로 사용됩니다. 자유 피팅 매개변수는 X 위치, y 위치, X 너비, Y 너비, 회전 각도, 진폭 및 배경 오프셋입니다.

타원형 가우시안 마스크는 노출 시간 동안 분자의 이동으로 인해 PSF 플롯이 흐려지고 변형되는 현상을 보정합니다. PalM movie의 모든 프레임에서 얻은 XY 국소화 결과물을 동일 시야의 투과광 현미경 이미지 위에 겹쳐 놓았을 때, PalM-Cherry의 국소화 지점들은 E. coli 세포의 중앙 영역 내에 나타나야 합니다. 자동 추적을 통해 단백질의 이동을 측정하지만, 적절한 추적 윈도우를 선택하는 것이 매우 중요합니다.

먼저, 다양한 추적 윈도우 매개변수 범위에 대해 추적 알고리즘을 실행합니다. 셀당 측정된 트랙 수를 추적 윈도우에 대해 플롯하여, 트랙이 분리되지 않는 가장 작은 가능한 추적 윈도우를 식별하고 결과 트랙을 동일한 시야의 투과광 현미경 이미지에 표시합니다. 세포 내 분자 이동의 공간적 분포를 시각화하려면, 각 트랙이 단일 세포 내에 국한된 확산을 보여야 합니다. 만약 일부 트랙이 세포 사이를 가로지르는 것처럼 보인다면, 이는 추적 윈도우가 너무 크게 설정되었거나 광활성화 속도가 너무 높아서 서로 다른 분자들이 잘못 연결되었음을 시사합니다.

연속적인 국소화 지점들 사이의 단계 길이(step length)에 대한 누적 분포를 도식화하십시오. 추적 윈도우(tracking window)가 충분히 크면 곡선이 완만하게 상승하여 포화 상태에 도달하지만, 윈도우가 너무 작게 설정된 경우에는 컷오프 엣지(cutoff edge)가 나타납니다. 적절한 추적 윈도우가 선택되면, Paul one의 확산 특성을 분석할 수 있습니다.

각 트랙에 대해 총 n단계의 연속적인 국소화 지점들 사이의 평균 제곱 변위(mean square displacement, MSD)를 계산하십시오. MSD의 통계적 불확실성을 줄이기 위해 최소 5개 이상의 국소화 지점이 포함된 트랙만 사용하십시오. 그다음, MSD로부터 트랙당 겉보기 확산 계수를 산출하십시오. 두 번째 항은 추정된 국소화 오차를 보정하는 것입니다.

이것들은 두 번째 항에 대한 값들입니다. 이 예시에서는, 손상되지 않은 세포의 pol one과 MMS를 이용한 DNA 손상 처리 세포의 pol one에 대해 시야 내 모든 트랙에서 측정된 확산 계수 값의 히스토그램을 그립니다. 빨간색 막대는 염색체에 결합되어 0.15 square microns per second 미만으로 확산되는 개별 pol one 분자 집단을 나타냅니다. 반면, 자유롭게 확산되는 분자들은 0.9 square microns per second 주변으로 이동합니다.

결합된 Pol $\nu$ 분자가 확인된 후, 결합 부위의 위치를 손상되지 않은 세포와 MMS 손상이 있는 세포에서 시각화할 수 있습니다. 관찰된 전체 트랙 수 대비 결합된 트랙의 비율은 Pol $\nu$의 DNA 복구 활성에 대한 직접적인 정량적 척도를 제공합니다.

살아있는 E. coli 세포 내에서 Pol I-PA-mCherry 융합 단백질의 in vivo 광활성화를 수행하였습니다. 광활성화는 세포 내의 단일 PA-mCherry 형광체로 제한될 수 있었으며, 광활성화 비율을 높임으로써 더 많은 형광 분자들을 검출할 수 있었습니다. PALM 동영상 각 프레임에 대해 국소화 분석을 수행하였습니다.

고정된 세포 내의 부동 분자 또는 살아있는 세포 내의 결합된 분자를 사용하여 정밀도를 측정한 결과, 이론적 예측과 일치하는 40 nanometers로 나타났습니다. 다음으로, 위치 결정 임계값이 너무 낮을 때의 설정을 검토하였습니다. 임계값이 너무 낮으면 배경 노이즈의 무작위 피크가 후보 위치로 잘못 선택되었으며, 반대로 임계값이 너무 높으면 일부 스팟을 놓치게 되었습니다.

결과적으로 Paul one 국소화는 세포의 중앙 영역에 위치하여, e coli 뉴클레오이드의 공간적 조직을 대체적으로 재현하였습니다. 손상되지 않은 세포 내 Paul one 궤적의 대부분은 확산을 나타냅니다. 전형적인 세포는 수백 개의 Paul one 궤적을 포함하고 있으며, 이는 e coli 세포당 약 400개의 Paul one 분자라는 복제수와 일치합니다.

다양한 유형의 분자 운동은 여러 지연 시간(lag time)에 걸쳐 MSD 값을 계산함으로써 식별할 수 있으며, 지향성 운동(directed motion)은 포물선형 곡선을 나타냅니다. 브라운 운동(Brownian motion)은 직선으로 특징지어집니다. 제한된 확산(confined diffusion) 곡선은 정체기(plateau)에 도달하며, 부동 입자의 MSD 곡선 오프셋은 국소화 불확실성(localization uncertainty)을 나타냅니다.

결과적으로 Paul one의 MSD 곡선은 짧은 lag time에서는 브라운 운동을 나타내는 선형적으로 증가하는 모습을 보였으며, 더 긴 lag time에서는 세포 내 구속으로 인해 포화되었습니다. 이러한 방법들을 사용하여, 손상되지 않은 세포 내 외인성 DNA 알킬화 손상에 대한 Paul one의 DNA 복구 활성을 측정하였습니다. Paul one의 확산 계수 히스토그램은 확산되는 분자들의 지배적인 집단을 보여줍니다.

결합된 소수의 분자들은 100 millimolar MMS 손상이 지속되는 환경에서 내인성 DNA 손상의 복구 및 DNA 복제에 관여할 수 있습니다. 확산 계수가 거의 0에 가까운 트랙의 빈도가 상당히 증가합니다. 이는 돌연변이 유발 물질이 존재하는 상태에서 더 많은 Paul one 분자들이 DNA 복구에 관여해야 한다는 모델을 뒷받침하며, 이 절차를 따릅니다.

세포 내 단백질의 공간적 분포를 정량화하고 DNA 복구에 관여하는 더 큰 단백질 복합체의 존재를 조사하기 위해 로컬라이제이션(localization)이나 클러스터링(clustering)과 같은 다른 데이터 분석 방법을 수행할 수 있습니다.