Name: Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T20:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 21 s
Description: 배우세요 생존 세포 내 단백질-DNA 상호작용을 PALM 단일 분자 추적으로 시각화 및 정량화하는 방법을 Escherichia coli에서. 이 기법은 DNA 복구 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 지역화 소프트웨어에 대한 맞춤 현미경과 시머 홀든의 건설에 대한 도움말 저스틴 Pinkney 요하네스 홀바인을 인정합니다. 로드리고 레예스 - Lamothe는 E.를 제공하기위한 감사합니다 대장균 균주. 연구는 유럽위원회 (European Commission) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 그랜트 FP7/2007-2013의 건강 F4-2008-201418, 영국 생물 공학 및 생물 과학 연구 협의회 부여 BB/H01795X/1 및 ANK에 유럽 연구위원회 그랜트 261227에 의해 투자되었다. DJS는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 프로그램 그랜트 WT083469에 의해 투자되었다. SU는 매스 웍스의 박사 친교에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양 무균 배양 튜브 및 피펫 팁을 사용합니다. E. 대장균 균주 AB1157 폴라 - PAmCherry는 POL1의 C-말단 PAmCherry 융합을 수행한다. 융합 등 Datsenko에서 설명한 람다 - 레드 재조합을 이용하여 야생형 유전자를 대체하여 네이티브 염색체 위치에 삽입 하였다. 세포 성장 속도와 DNA 손상 제 메틸에 대한 민감도에 의해 판단으로 융합 단백질의 팔 기능이 확인되었다 메탄 (MMS). 세포주의 구조에 대한 자세한 내용은 Uphoff 등. 7에서 찾을 수 있습니다, Datsenko 등. 8 및 레예스-Lamothe 외. 구 세포 배양은 형광도를 감소시키고 현미경 슬라이드에 배경 입자를 피하기 위해 M9 최소 배지에서 성장된다. 또한, 영양이 풍부한 정의 매체는 10을 사용할 수 있습니다. <ol><li> 행진 E. 대장균 균주 AB1157 선택적 항생제 (여기에서, 25 ㎍ / ㎖의 카나마이신)과 루리아 국물 (LB) 아가로 오스 접시에 냉동 글리세롤 재고 폴라 - PAmCherry와 하룻밤 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 하나의 세포 식민지에서 5 ㎖ LB 문화를 접종하고 3 시간 동안 220 rpm으로 흔들어 37 ° C에서 성장한다. </li><li> 5 ㎖의 문화 1:10,000 희석 최소 배지 (M9 배지, MEM의 아미노산 + 프롤린, MEM 비타민, 0.2 % 글리세롤), 37 ° C 하룻밤 220 rpm으로 흔들면서 품어. </li><li> 다음날 아침, 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도 (OD)를 측정하고 OD 0.025에 5 ㎖에 신선한 최소한의 매체 문화를 희석. 초기 지수 단계 (OD 0.1)에 220 rpm으로 흔들어 37 ° C에서 2 시간 동안 성장. </li><li> 5 분 2,300 XG에서 원심 분리하여 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 세포를 1 ml의 농축. 상층 액을 제거하고 20 ㎕의 잔류 매체와 소용돌이에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li></ol> 2. 현미경 슬라이드 프레파라트이온 <ol><li> dH보다 2 O.에서 1.5 %의 낮은 형광 아가로 오스 솔루션을 준비합니다 솔루션이 선명해질 때까지 아가로 오스를 용융 전자 레인지를 사용합니다. 부드럽게 피펫 팅에 의해 몇 번 아래로 2 배 최소 배지 500 μL로 용융 아가로 오스 솔루션 500 μl를 섞는다. </li><li> 현미경 커버 슬립 (없음 1.5 두께)의 중심에 균등하게 아가로 오스 솔루션을 확산. 이 아가 로스가 냉각되기 전에 기포를 피하는 빠르게 수행되어야한다. </li><li> 두 번째 커버 슬립 (없음 1.5 두께)와 패드를 평평하게. 배경 형광 입자를 제거하기 위해, 커버 슬립은 이전에 1 시간 동안 500 ° C에서 가열로에서 연소되었다. 구운 커버 슬립은 알루미늄 호일에 덮여 실온에서 주 동안 저장 될 수있다. </li><li> DNA 손상 실험을 위해, 100 mM의 MMS를 포함하는 아가로 오스 패드를 준비한다. 단계 2.1-2.3의 절차를 따라하지만, 100 ㎜ M의 최종 농도를 들어, 용융 1.5 % 아가로 오스의 500 μL와 혼합하기 전에 M9 배지 500 ㎕를 8.3 ㎕의 MMS를 추가MS. (주의 MMS는 독성과 돌연변이 유발과 장갑, 마스크, 고글, 실험실 코트로 처리해야합니다.) </li><li> 패드에서 상단 슬라이드를 제거하고 패드에 집중 세포 현탁액 1 μl를 추가합니다. 사용하지 않는 불에 커버 슬립 (없음 1.5 두께, 현미경 목표 명세서와 일치)와 함께 패드를 덮어 슬라이드에 매우 부드럽게 눌러 세포를 고정시킨다. 세포는 아가로 오스 패드가 마르기 전에 고정 45 분 이내에 몇 군데해야합니다. 더 이상 실험 중 건조를 방지하기 위해, 아가로 오스 패드는 실리콘 가스켓을 사용하여 밀봉 할 수있다. </li><li> DNA-손상 실험을 위해, 촬상 전에 실온에서 가습 된 용기에 20 분 동안 100 ㎜ MMS를 포함하는 아가로 오스 패드에 고정화 세포를 배양한다. </li></ol> 3. 현미경 데이터 수집 준비 PALM은 탐지 및 하나의 형광 단백질의 정확한 현지화에 의존합니다. 감도와 최적의 맞춤현미경은 데이터 품질에 중요하다. 단일 분자 형광 현미경은 전형적으로 커버 슬립의 표면 위의 얇은 섹션 내의 흥미로운만을 형광체에 의해 신호 대 잡음비를 향상시키기 위해 전체 내부 반사 (TIR)​​ 조명을 사용한다. E. 내부 여기 영상 대장균은 매우 경미 여기 광의 각도를 감소시킴으로써 TIRF 현미경에 달성 될 수 경사 조명 (11)을 필요로한다. PAmCherry 영상이 추가로 405 nm의 photoactivati​​on 레이저와 561 nm의 여기 레이저가 필요합니다. 형광 방출은 114.5 ㎚ / 화소의 화소 길이 초래 배율에서 CCD (EMCCD) 카메라를 승산 전자에 기록된다. 최적의 현지화 정밀도를 들어, 픽셀 크기가 약 너무 많은 화소에 신호를 확산하지 않고 충분한 샘플링을 보장하기 위해 PSF의 표준 편차의 폭과 일치해야합니다. 그림 3 최소한의 PALM 설정의 개략도를 보여줍니다. 영화 1맞춤 현미경 구축 과정의 인상을 준다;. 장비에 대한 자세한 설명은 Uphoff 등 7을 참조하십시오. <ol><li> 일상 현미경 정렬을 수행. 405 nm의 목적 앞에 561 nm의 연속파 레이저의 강도를 측정한다. 3.5 mW의 (~ 400 W / cm 2) 10 μW (~ 1 W / ㎠)에 405 nm의 강도에 561 nm의 강도를 조절합니다. 0 ~ 10 μW에서 405 nm의 강도의 점진적인 조정을 허용하는 연속 가변 감광 필터 휠을 사용합니다. 실험 시작 때까지 레이저 조명을 끕니다. </li><li> 현미경 무대에 샘플을 놓고 투과광 현미경 모드 (그림 4A)에 초점 세포를 가져옵니다. EMCCD 카메라 이득은 노출 과다에 의해 카메라의 손상을 방지하기 위해 스위치 오프되어야한다. </li><li> 데이터 크기를 줄이고 카메라 판독 속도를 증가시키기 자른 FOV를 정의. </li><li> 주변 광 및 SWIT에서 샘플을 커버EMCCD 카메라 이득에 채널. </li><li> (0.26 밀리 카메라 판독 시간 포함) 15.26 밀리 초 / 프레임으로 프레임 속도를 설정합니다. 토론 섹션에서 &quot;노출 시간과 여기 강도&quot;를 참조하십시오. </li><li> 어두운 배경 신호 (그림 4B)을 확인하기 위해 카메라 데이터를 표시합니다. </li><li> 561 nm의 레이저에 전환하고 여기 배경 신호 (그림 4C)을 확인. </li><li> POL1-PAmCherry 융합 단백질의 photoactivati​​on의 405 nm의 레이저에 스위치 및 형광 PSFS가 나타날 때까지 강도를 증가시킨다. </li><li> 커버 슬립의 표면 부근에 시료만을 얇은 부분을 조명하기 위하여 여기 빔의 각도를 조정한다. <ol><li> 이를 위해, 레이저 빔은 100X NA 1.4의 대물 초점면 (도 3)에 집중된다. 빔에 수직 인 포커싱 렌즈를 변환하는 것은 멀리 아래 각도 대물를 종료 빔을 일으키는 목적의 중심으로부터의 포커스를 이동시킨다. </li><li> 아이형광 강도를 최대화하고 백그라운드 신호를 최소화하기 m. 엄격한 TIR 여기가 커버 슬립 표면의 100 nm의 내 이미지 형광에 최적합니다, 그러나, 영상 DNA-결합 단백질은 E.와 관련된 대장균 핵 양체 0.8 μm의 깊이 조명까지 필요합니다. </li></ol></li></ol> 4. 데이터 수집 여기에서, 우리는 PALM 영화의 취득 일반 프로토콜을 설명합니다. 동일한 절차에 피해 E. POL1-PAmCherry 융합 단백질을 영상화 적용 대장균 세포와 MMS 연속 DNA 손상 치료 중. 셀 당 다른 분자량 또는 복사 수의 융합 단백질에 대한 방법의 응용 프로그램 (토론 섹션을 참조) 다른 인수 설정이 필요합니다. <ol><li> 투과광 현미경 모드에서 세포의보기의 새로운 필드 (FOV)를 찾아 이미지의 초점을 맞 춥니 다. 셀 외곽선 (그림 4A)를 기록하는 카메라 스냅 샷을 가져 가라.</li><li> 주변 광에서 샘플을 커버하고 EMCCD 카메라 이득에 전환합니다. </li><li> 561 nm의 레이저에 스위치 및 데이터 수집을 시작하기 전에 몇 초 동안의 coverslip에 대한 세포 형광도 및 배경 반점을 표백. 세포에 대한 성장과 M9 매체에 몇 군데 아주 작은 형광 배경이 보통이 커버 슬립을 불에 사용하지만, prebleaching하는 등 LB 등 풍부한 성장 매체에있는 세포 이미징을위한 도움이 될 수 있습니다. 강렬한 조명이 너무 prebleaching는 최소한으로 유지해야 세포에 독성이 있습니다. </li><li> 15.26 밀리 초 / 프레임에서 연속 561 nm의 여기에서 PALM 영화의 인수를 시작합니다. </li><li> 405 nm의 레이저를 켜고 서서히 / ㎠ 1 W까지 도달하는 영화의 과정을 통해 강도를 증가시킨다. 세포의 형광도의 원인이 높은 405 nm의 강도를하지 마십시오. 형광 분자의 밀도에주의 - 그것은 낮은 작동 속도를 유지하는 것이 중요합니다 PSFS 분명히이되도록각 프레임 (그림 4D-F)에 격리입니다. </li><li> 10,000 프레임 / 동영상 (셀당 묘화되는 분자의 수에 따라)를 기록; 한 영화는 대개 2-3 분 걸리며 FOV의 크기에 따라서 하드 디스크 공간이 0.5 GB를 필요로한다. </li><li> 여러 FOV의 취득 절차를 반복합니다. 각 FOV가 PAmCherry의 형광이 photoactivated 얻을 수 있기 때문에 한 번 몇 군데와 비가 역적으로 표백 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 자동화 및 강력한 데이터 분석 프레임 워크는 방법의 성능과 효율성을 위해 필수적입니다. 우리는 MATLAB로 작성된 사용자 지정 소프트웨어를 사용합니다. <ol><li> 크로커 외. 12에 기재된 알고리즘을 이용하여 지역화 분석을 수행 홀든 외. 13 HoldenI 외. 14 및 Wieser의 외. 15 PSFS는 제 7 화소로 가우시안 커널을 사용하여 대역 통과 필터링 된 이미지에서 식별된다의 직경 (그림 5A). 후보 위치는 백그라운드 신호 (도 5b)의 4.5 배의 표준 편차를 상기 피크 픽셀 강도로 PSFS에 대응한다. 후보 PSF 당 로컬 밝은 픽셀은 타원형 가우스 함수 (그림 5C)를 피팅에 대한 초기 추측 역할을합니다. 무료 맞는 매개 변수는 다음과 같습니다 : X 위치, Y 위치, X 폭, Y, 폭, 회전 각도, 진폭 및 배경 오프셋 (offset). 타원형 가우시안 마스크는 PSF를 흐리게하고 변형 노출 시간 동안 분자를 차지한다. </li><li> 같은 FOV의 투과광 현미경 이미지 상에 PALM 영화의 모든 프레임에서 결과 (X, Y) 버전을 그린다. POL1-PAmCherry의 지역화는 E.의 중심 영역에 나타납니다 대장균 세포 (그림 6A). 많은 현지화 세포의 바깥에 표시하는 경우, 현지화 임계 값을 너무 낮게 설정하거나 샘플 배경 형광 입자를 포함했다. </li><li> 자동화 추적 분석을 위해, 외 보군에서 설명한 알고리즘의 MATLAB 구현 AL. 12 (토론 섹션의 &quot;확산 분석&quot;참조)이 사용될 수있다. 사용자 정의 된 추적 창 내에서 후속 프레임으로 나타나는 위치가 궤적을 형성하기 위해 연결된다. 체류 현지화 동일 창에서 발생하는 경우에, 트랙은 고유 스텝 길이의 합을 최소화하여 할당된다. 단일 입자 추적 데이터로부터 확산 계수를 계산할 때 다양한 고려 사항에 대한 상세한 설명은, Wieser의 외. 15 참조 <ol><li> 이 알고리즘은 추적 기간 동안 과도 점멸 또는 누락 현지화을 고려하여 메모리 매개 변수를 사용합니다. 여기, 우리는 1 프레임 메모리 매개 변수를 설정, 높은 값은 수명이 긴 어두운 상태로 형광을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 다음 교정 단계에 따라 적절한 추적 창을 선택합니다. POL1 위해, 우리는 0.57 μm의 (5 픽셀)를 사용합니다.</li><li> 윈도우 파라미터를 추적의 범위에 대한 추적 알고리즘을 실행. 트랙 (도 6b)을 분할하지 않는 작은 가능한 추적 창을 식별하는 추적 창 함수로서 셀 당 측정 된 트랙의 개수를 계산한다. </li><li> 세포 내 분자 운동의 공간적 분포를 시각화 동일한 FOV의 투과광 현미경 이미지에서 얻어진 트랙 플롯. POL1 트랙은 하나의 세포 (그림 6C-D)에 의해 누출 확산을 표시해야합니다. </li><li> 트랙의 일부가 세포 사이에 십자가에 나타나는 경우이 추적 창이 너무 큰 및 / 또는 photoactivation 속도는 (그림 6E)도 높았다 선택했기 때문에 별도의 분자가 잘못 연결되었습니다 것을 제안합니다. </li><li> 연속 현지화 (도 6F) 사이의 단계 길이의 누적 분포를 플롯. 곡선은 상승하고 충분히 큰 추적 창 원활 포화창을 너무 작게 선정 된 경우 만 차단 가장자리를 보여줍니다. </li></ol></li><li> POL1의 확산 특성을 분석하기 위해, N 단계의 합계와 각 트랙 연속 현지화 간의 평균 제곱 변위 (MSD))를 계산한다 : MSD = 1 / (N-1) Σ I = 1 N-1 (x +1 - X I) 2 + (Y +1 - y를 I) 2. 만 MSD 값의 통계적 불확실성을 줄이기 위해 최소 4 단계 (N ≥ 5 현지화)과 추적 (가) 있습니다. </li><li> 여러 프레임 (그림 6G)에 변위를 계산하여 지연 시간의 범위에서 MSD 값의 곡선을 그린다. MSD 곡선의 형태는 관찰 된 분자 운동 (그림 6H)을 분류하는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> MSD에서 트랙 당 겉보기 확산 계수 D의 *를 계산 D * = MSD / (4의 Δt) - LOC 2 /의 Δt σ. 두 번째 tERM은 (Wieser의 등. 15 참조, 여기 σ의 LOC = 40 nm의의 Δt = 15.26 밀리 초)을 추정 현지화 에러를 수정합니다. </li><li> FOV (그림 7A)에있는 모든 트랙에서 측정 된 D의 * 값의 히스토그램을 그린다. </li><li> 트랙 당 측정 D * 값을 기반으로 염색체에 결합 나타나는 개별적인 POL1 분자를 식별한다. 바인딩의 인구 분리 (중심 날카로운 분포를 D * 0 ~ 2 ㎛ / 초)와 D * &lt;0.15 μm의 2 / 초 임계 값을 설정하여 자유롭게 확산 분자 (넓은 분포가 D를 중심으로 * ~ 0.9 μm의 2 / 초) ( 도 7a 및 7D)의 빨간색 막대. </li><li> 손상되지 않은 세포 (도 7a-C) 및 MMS (그림 7D-E)와 DNA-손상의 치료에서 세포의 현지화, 추적 및 POL1에 대한 확산 분석을 수행. 바운드 트랙의 비율은 DN의 직접적인 양적 측정을 제공합니다생체 내에서 POL1의 복구 활동. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해가없는 선언합니다.

우리는 실험의 성공을 위해 몇 가지 주요 고려 사항에 대해 설명합니다. 어워드 및 형광 융합 단백질의 발현 : 광활성 및 광전 환성 형광 단백질 (17)의 큰 팔레트가있다. 특정 선택은 현미경의 특성, 사용 가능한 특히 레이저와 필터에 따라 달라집니다. 405 ㎚, 561 ㎚의 조합은 일반적인 광활성 형광 단백질에 이상적입니다. 우리는 단량체 때문에 PAmCherry 6을 선택하고 셀의 집계를 보여 주었다. 또한, 비가역 photoactivati​​on는 셀 당 단백질의 카피 수를 측정 할 수있는 활성화 된 형광체의 수를 카운트한다. 대신 플라스미드에서 융합 단백질을 발현 제외한 야생형 유전자좌 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 염색체 삽입을 선호한다. 이 형광을했습니다와 관심의 단백질의 완전한 교체를 보장합니다rsion 및 야생형 발현 수준을 유지. Photoactivation 레이트 : 이것은 평균적으로 셀 당보다 작은 분자는 동영상의 모든 프레임에서 형광 상태로되도록 photoactivation 속도를 조절하는 것이 중요하다. 이것은 405 nm의 강도에 의존하고 분자수가 활성화하는 왼쪽. 매우 낮은 영상 밀도에서, 그러나, 모든 분자는 영화가 끝나기 전에 이미지를 만들거나 매우 긴 영화를 취득해야합니다. 영화 당 기록 된 프레임의 수는 융합 세포 당 단백질과 사용 여기 조건에서 PAmCherry의 평균 photobleaching에 일생 일대의 카피 수에 따라 달라집니다. POL1의 카피 수는 ~ 400 분자 / 셀 1과 지수 광표백 수명 분포의 평균값은 1 ~ 4의 범위였다. 점차적으로 405 nm의 강도를 증가시킴으로써, 활성화 균등 영화의 10,000 프레임을 통해 배포됩니다. 따라서 각 셀은 occup이다PSFS 10,000 프레임의 동영상에서 추적 합병증이 거의 중복을 보장합니다 ~ 1,600 프레임의 총에 형광 분자에 의해 IED. 노출 시간과 여기 강도는 : 제일 중요 한건, 노출 시간은 약간의 모션 블러와 함께 날카로운 PSFS을 관찰하기에 충분히 짧게 할 필요가있다. 그러나, 프레임 레이트가 지역화 불확도 넘어 연속 프레임 간의 관찰 분자 운동을 수득하도록 선택되어야하고, 그렇지 않으면 결정적인 광자 트랙 오버 샘플링에 의해 낭비된다. 언 바운드 분자의 운동은 현지화 불확실성으로 인해 결합 분자의 겉보기 운동에서 명확히 구별로 충분히 긴 시간 간격으로 샘플링해야합니다. 노출 시간이 설정되면, PSF 강도가 조정되어야한다. PSF의 국산화 정도는 프레임의 지속 기간 동안 검출 된 광자의 수에 따라 증가한다. 고등 여진 강도는 광자 방출 속도를 증가 BU또한 t 광표백 레이트 및 백그라운드 신호. 원하는 현지화 정밀도를 제공하는 가장 자극 강도를 사용합니다. POL1-PAmCherry 위해 우리는 15.26 밀리 초 / 프레임과 3.5 mW의 561 nm의 여기 (400 W / cm 2)를 선택했다. 그것은 (Uphoff 외. 7에서 부가 정보를 참조) 데이터 수집 전후 세포 성장 및 형태를 모니터링하여 특정 촬상 조건 세포 생존을 확인하는 것이 중요하다. POL1 생체 7 갭 DNA 기판에 1 ~ 2 초 바인딩 시간을 나타내고, 따라서 우리는 분자의 대부분은 트랙의 전체 기간 동안 바운드 또는 언 바운드 상태가 될 것으로 예상된다. 염색체 사이트는 세포질에있는 POL1 확산 (1 ~ 2 ㎛보다 확산 계수에게 크기 이하의 몇 배 (~ 10 -5 ~ 2 ㎛ / 초, 엘모어 등. 18)이 있기 때문에 바인딩 분자는 기본적으로 고정되어 나타납니다 </s위로&gt; / 초). 확산 분석 : 명백한 확산 계수 D의 *는 개별 트랙의 MSD로부터 계산되어, 통계적 에러를 줄이기 위해 4 단계 (5 프레임)의 최소 이상의 평균. 그 ~ 분자의 75 %가 설명하는 영상 조건보다 5 프레임 내에서 표백합니다. 이러한 짧은 트랙은 바운드 및 언 바운드 분자를 구별 할 수있는 충분한 통계적 확실성을 제공하지 않습니다. 그러나, 단백질의 활성을보고 바운드 및 언 바운드 분자의 상대적인 분획 분석 트랙들의 총 수와 무관하다. 불확실성이 분자 (15)의 각 현지화 명백한 임의의 단계를 추가하기 때문에 그것은 D의 *의 계산에서 PSF 현지화 오류 (σ의 LOC)을 설명하는 데 유용합니다. 바인딩 및 확산 분자의 분류를 개선하기 위해, 우리는 D의 * 봇을 계산하는 것이 좋습니다두 프레임의 시간 동안 단일 단계 변위 및 변위로부터 H. 그것은 두 개의 D * 임계 값을 설정하는 것이 가능합니다 : D의 * (15 밀리 초) &lt;0.15 μm의 2 / 초와 D의 * (30 밀리 초) &lt;0.075 μm의 2 / 초. D의 *가 노출 시간 동안 인해 확산에 치우침 트랙과 운동의 휴대 제한에 의해 영향을받는 겉보기 확산 계수합니다. 정확한 공정한 확산 계수를 추출하기 위해서는, 스토캐스틱 브라운 운동 모델 5,7에 근거 시뮬레이션 데이터에 관찰 동작과 비교하는 것이 유용 입증되었다. 시뮬레이션 된 데이터는 데이터 분석 절차를 테스트하는데 사용될 수있다. 이 방법의 응용 가능성 : 우리는 염색체에 결합시 단백질의 이동성의 변화에 의해 생체 내에서 단백질-DNA 상호 작용을 시각화하고 정량화하기위한 일반적인 방법을 설명했다. DNA 또는의 활동수리에 관련된 RNA 결합 단백질은, 복제, 전사, 염색체의 유지 보수, 따라서 광학 회절 한계 이하의 공간 해상도를 가진 단일 세포 수준에서 실시간으로 따라 할 수 있습니다. Photoactivated 단일 분자 추적 셀 당 몇 표지 분자로 제한하는 종래의 추적 방법을 확장합니다. 생체 분자의 확산을 측정하는 다른 방법은 (FRAP)를 광표백 후 형광 복구합니다. FRAP 큰 세포에서 해외 확산 특성을 측정하는데 매우 유용하지만, 특히 작은 박테리아 세포에 대해, 공간적으로 서로 다른 환경에서 서로 다른 이동성을 가진 여러 분자 종을 해결하는 능력이 제한된다. 우리는 DNA 결합 활동과 E. 다른 단백질의 범위의 세포 내 현지화를 측정하기 위해 추적 photoactivated 단일 분자를 적용한 콜라이 POL1, DNA 리가 아제, FIS 단백질, DNA 등중합 효소 III 7뿐만 아니라 염색체 단백질 MukB, E, 및 F (19)의 구조 유지. 우리는 방법은 또한 다른 세포 유형에 적용 할 수 예상된다.

이 프로토콜은 대장균 살아있는 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접적인 측정을 설명한다. 그것은 염색체 (도 1)로 결합 기술은 단일 형광 표지 된 단백질의 확산 계수의 변화를 이용한다. 우리는 DNA 중합 효소 지체 가닥 복제 및 절단 수리 경로 1의 DNA 갭을 채우는 I (POL1), 원형 DNA 결합 단백질을 사용하는 방법을 보여주기 위해. 슈퍼 해상도의 형광 현미경의 출현은 나노 미터 해상도의 세포에서 분자 구조의 시각화를 가능하게한다. Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)는 형광 상태 (그림 2)에 초기 암 상태에서 활성화 할 수있는 형광 단백질을 사용합니다. 남은 모든 표지 분자의 서브 세트를 독립적으로 t, 순차적 인 방식으로 자신의 위치를​​ 결정하기 위하여 임의의 시간에 활성화 될그는 샘플 2에 표시된 분자의 농도를 총. 분자 당 국산화 정도는 주로 형광 포인트 확산 함수 (PSF)의 크기에 따라, 수집 된 광자의 수 및 배경 신호 3. 이 방법의 대부분의 응용 프로그램은 세포 구조의 개선 된 시각화에 초점을 맞 춥니 다. 추적 PALM은 단일 분자와 결합 할 수있는 실현 4 직접 살아있는 세포의 표지 단백질의 임의의 숫자의 움직임에 따라 새로운 길을 열었습니다. 향상된 감도와 형광 현미경의 시간 해상도는 이제 세균 세포질 5에서 하나의 확산 형광 단백질의 추적을 할 수 있습니다. 여기, 우리는 PAmCherry, 비가 역적으로 405 nm의 빛 6 조사에 형광 상태로 초기 비 형광 상태에서 변환하는 설계 형광 단백질을 사용합니다. 활성화 PAmCherry의 형광 이미지 될 수 있습니다561 nm의 여기 및 photobleaching에까지 여러 프레임에 대해 추적에 의해 개발. 우리는 POL1 및 PAmCherry의 융합 단백질을 사용하여 단일의 과도 DNA-결합 이벤트를 식별하는 방법의 능력을 보여준다. 메틸 메탄 (MMS)와 세포 치료는베이스 절단 수리 효소에 의해 갭 DNA 기판으로 설정되어 DNA 메틸화 파손의 원인이됩니다. 우리의 방법은 MMS 손상 7에 대한 응답으로 단일 POL1 분자의 결합 분명히 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>람다-적색 재조합 MEM 아미노산에 의해 생성된</td> <td>PAmCherry DNA 결합 융합 단백질에 대한 염색체 삽입을 운반하는 E. coli 균주</td> Invitrogen 11130-051 최소 배지 보충제 MEM 비타민 Invitrogen 11120-052 최소 배지 보충제 Agarose BioRad 161-3100 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>인증된 분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>현미경 커버슬립 No 1.5 두께</td><td>Menzel</td><td>BB024060SC</td><td>500°C에서 가열로 슬라이드를 가열하여 배경 입자를 제거합니다. C 1</td></tr>시간 <tr><td>메틸 메탄설포네이트(MMS)</td> <td>시그마-알드리치</td><td>129925</td><td>주의:</td></tr><tr><td>Uphoff et al.7</td><td></td>MATLAB MathWorks<td></td>에 설명되어 있는 독성 <td></td> PALM 설정</tr> <tr><td></td><td></td><td>데이터 분석 및 시각화를 위한</td>현지화 소프트웨어 맞춤 작성, 온라인 사용 가능 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html</td><td>위치추정 분석에 적용할 수 있는 MATLAB 및 C++ 소프트웨어 패키지입니다. 출판물에 사용된 경우 Holden et al.13를 인용하십시오.</td></tr><tr><td>온라인에서 사용 가능한</td> <td>추적 소프트웨어</td><td><a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a></td><td>Blair와 Dufresne의 MATLAB 구현. 인용 Crocker & Grier12(출판물에 사용된 경우).</td></tr></tbody></table>

photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-dna 상호 작용을 시각화

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

단백질-DNA 상호 작용은 많은 기본적인 세포 과정의 핵심이다. 예를 들어, DNA 복제, 전사, 보수, 및 염색체 조직 체외 실험은 DNA-결합 단백질의 여러 유형의 기능에 대한 상세한 모델을 생성하도록 도왔다. 특정 DNA 구조 나 서열을 인식하는 DNA-결합 단백질에 의해 규율, 아직 , 살아있는 세포의 복잡한 환경에서 이러한 프로세스와 조직의 정확한 메커니즘은 훨씬 덜 이해 남아있다. 우리는 최근에 Photoactivated 현지화 현미경 단일 분자 추적과 결합 (PALM)를 사용하여 라이브 대장균 세포에서 DNA 수리 활동을 정량화하는 방법을 소개했다. 우리의 일반적인 방법은 염색체와 연결시 하나의 단백질의 이동성의 변화에​​ 의해 개인의 DNA 결합 이벤트를 식별합니다. 결합 된 분자의 일부는 단백질 행위에 대해 직접 정량적 측정을 제공합니다단일 세포 수준에서의 ivity 및 기판 또는 결합 부위의 풍요 로움. 여기서는 방법의 개념을 설명하고, 샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 분석 절차를 보여준다.

생체 내에서 단백질-DNA 상호 작용을 연구하기 위하여 추적 photoactivated 단일 분자의 개념은도 1에 도시되어있다. PAmCherry 융합 단백질은 살아있는 E.에서 감지 시 셀당 미만 분자의 주파수에서 405 nm의 광으로 확률 적으로 단일 분자 photoactivating 의해 순차적으로 대장균 세포. 활성화 된 분자가 연속 561 nm의 여기에서 몇 군데 있습니다. 세포의 분자 운동은 돌이킬 수없는 광표백 때까지 일련의 프레임에 가까운 현지화를 연결하여 추적 할 수 있습니다. DNA-결합 단백질의 확산이 염색체를 바인딩시 감속되어 있으므로, D * 트랙 당 수득 명백한 확산 계수를 직접 개별 단백질-DNA 상호 작용에보고한다. 그림 2는 라이브 E.에 POL1-PAmCherry 융합 단백질의 photoactivation을 보여줍니다 대장균 세포. O 405 nm의 강도의 영향N 형광 분자의 농도는도 4에서 볼 수있다. 밀도가 단독으로 405 nm의 강도에 의해서가 아니라 추가로 정품 인증에 사용할 수있는 분자의 수에 의해 결정되지 않습니다, 나머지 분자의 풀은 PALM 영화의 과정을 통해 고갈된다. 지역화 분석은도 5에 도시 된 바와 같이 PALM 동영상의 각 프레임에 대해 수행된다. 우리는 살아있는 세포에서 수정 된 세포 또는 결합 분자의 움직 분자를 사용하여 현지화 정도를 측정 하였다. 우리의 인수 설정은 이론적 인 예측 3 계약, σ의 LOC = 40 nm의 현지화 정밀도를했다. 얻어진 POL1 현지화 광범위 E.의 공간적 조직 recapitulating, 셀의 중앙 영역 (도 6a)을 점유 대장균은 7 핵 양체. POL1의 대다수는 DIF 디스플레이가 손상되지 않은 세포에서 트랙도 6c에 도시 된 바와 같이 융합. 일반적인 세포는 E. 당 약 400 POL1 분자의 카피 수와 일치 수백 POL1 트랙 (그림 6D)를 포함 . 대장균 전지 (1)는도 6b 및도 6E-F는 적합한 추적 윈도우 파라미터 선택에 대한 지침을 제공한다 - 트래킹 윈도우가 너무 크면, 다른 분자가 잘못 트랙에 링크 될 가능성이 있으며 트래킹 윈도우가 너무 작은 경우, 트랙 더 이상 단계를 분할됩니다. POL1에 대한 MSD 곡선은 셀 감금 (그림 6 세대)로 인해 더 이상 지연 시간에 짧은 지연 시간과 포화에 선형 적으로 상승한다. 분자 운동의 종류 MSD 분석에 의해 식별 될 수있다. 감독 운동은 포물선을 제공, 브라운 운동은 직선 특징, 제한 확산 곡선은 고원에 도달, 움직 입자 MSD 곡선의 오프셋 (offset)는 L를 나타냅니다ocalization 불확실성 (그림 6H). 단일 입자 추적 및 문제 해결 팁에 대한 자세한 정보는 Arnauld 등. 16에서 찾을 수 있습니다 우리는 이전에 외인성 DNA 알킬화 손상 7에 응답 POL1의 DNA 수리 활동을 측정하는 방법을 적용했다. POL1의 D * 히스토그램 분자 (도 7a-C)을 확산의 지배적 인 인구를 보여줍니다 손상되지 않은 세포에서 추적합니다. 2.7 % 바운드 POL1 분자의 작은 부분은 가능성이 지체 가닥 복제 및 내인성 DNA 손상의 복구에 참여하고있다. 연속 100 ㎜ MMS 손상에서, 13.8 % (그림 7D)에 D * 0 ~ 2 ㎛ / 초 증가와 트랙의 인구. 이러한 트랙은 염기 절제 복구 통로의 일부로서 단일 뉴클레오티드 차이를 보충하는 DNA 수리 및 합성을 수행 개별 POL1 분자를 나타낸다. 바운드 트랙의 위치는 개개의 위치를​​ 표시DNA 손상과 복구 사이트 (그림 7E-F). <img alt="그림 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" width="300" /> 그림 1. 방법의 그래픽 표현. (A)의 형광 단백질 PAmCherry는 405 nm의 광 조사에 의해 초기 상태로부터 비 형광 photoactivated 수있다. 밝은 상태는 561 nm에서 흥분과 비가 역적으로 형광 표백제까지 600 nm의 주위에 형광을 방출한다. (B) photoactivation 속도를 제어하는 것은 허용 영상 만 언제든지 셀 당 하나의 확률 적으로 활성화 PAmCherry 융합 단백질 어두운 상태로 남아 아직 활성화되지 않았거나 이미 표백 된 분자의 임의의 큰 수영장이있다. (C) 형광성 분자의 위치는 절연 PSF과 TR의 중심으로부터 판단photobleaching에까지 몇 프레임에 acked. 많은 분자의 (D)는 트랙 순차적으로 기록된다. (EF)은 염색체 표적 서열 또는 구조를 DNA-결합 단백질의 상호 작용은 랜덤 확산 움직임을 정지. 바운드 및 언 바운드 분자는 D * 하나의 트랙에서 추출 겉보기 확산 계수에 의해 구별된다. 결합 된 분자의 결과로 일부는 생체 내에서 DNA-결합 단백질의 활동에 대한 정량적 인 측정을 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" width="600" /> 그림 2. 라이브 E.의 POL1-PAmCherry의 Photoactivation 대장균 세포. 스케일 바 : 1 μm의. 회로도는 각 패널 아래에 표시됩니다. (<html> A) 아가로 오스 패드에 고정 된 세포의 광학 현미경 이미지를 전송된다. (B) 하나의 셀에 하나의 PAmCherry의 형광을 Phototactivating. (C) 높은 photoactivation 속도는 형광 분자의 수를 증가시킨다. (D) PALM 영화에서 통합 PAmCherry 형광. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig3highres.jpg" width="400" /> 그림 3. photoactivating 및 이미징 PAmCherry 융합 단백질에 대한 최소한의 PALM 설정의 도식 D1 :. 다이크로 익 미러 (예를 들어 550 nm의 긴 패스). D2 : 다이크로 익 미러 (예를 들어 570 nm의 긴 패스). L1 : 시준 렌즈. L2 : TIR 렌즈. L3 : 튜브 렌즈.1177/51177fig3highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4. . 15.26 밀리 초 / 프레임 스케일 바있는 PALM 영화 대표 이미지 : 1 μm의. (A) 아가로 오스 패드에 고정 된 세포의 가벼운 이미지를 전송된다. (B) 레이저와 EMCCD 카메라에서 측정 어두운 배경 이미지가 꺼져. photoactivation 전에 연속 561 nm의 여기에서 (C) 흥분 배경 이미지입니다. (DF) 증가 405 nm의 강도는 지속적으로 561 nm의 여기에서 몇 군데 PAmCherry 높은 photoactivation 환율로 연결됩니다. 박스 영역은 다음과 확대 표시됩니다. (D) 낮은 405 nm의 강도 (&lt;1 μW) 활성 FOV 당 거의 형광 분자를. (E) 중간 (405)현지화 및 추적 분석을위한 좋은 PSF 밀도 nm의 강도 (~ 2 μW) photoactivati​​on 결과. (F) 높은 405 nm의 강도 (~ 10 μW)는 현지화 및 추적 분석을 가린다 일부 셀에 하나 이상의 형광 분자를 활성화합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" width="500" /> 그림 5. 지역화 분석의 그림입니다. 스케일 바 : 1 μm의 (A) 밴드 패스 필터링이 가짜 픽셀 노이즈를 제거하고 FOV에 걸쳐 강도 그라데이션을 평면화합니다.. (B) 후보 PSFS는 위양성 및 위음성 탐지를 최소화하도록 선택된다 사용자 정의 임계 값에 기초하여 상기 필터링 된 이미지에서 식별된다. threshoLD는 배경 표준 편차 (신호 대 잡음비, SNR)에 의해 분할 후보 화소의 최소 강도에 대응한다. (C)가 임계치 이차원 타원형 가우시안 적합을 위해 초기 위치 파악 추측 (오렌지 크로스) 역할을 전달 로컬 밝은 화소. 스케일 바 : 0.5 μm의. 그 결과 최고 해상도의 현지화 (블루 크로스) σ의 LOC의 평균 밀도가 = 40 nm의은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" width="500" /> .. 추적 분석 그림 6 그림 스케일 바 : 1 μm의. (A) 예를 들어 셀에 POL1-PAmCherry의 모든 감지 현지화. (B) 트랙 번호 감지트래킹 윈도우의 함수로서 예시적인 셀 ED. 작은 추적 창은 트랙의 높은 숫자를 인공적에 이르게 분자 궤도를 분할. 점선은 추적 창 매개 변수 (0.57 μM, 5 픽셀)에 대한 우리의 선택을 나타냅니다 -이 단계의 전체 분포를 감지하고 그대로 다른 분자의 궤적을 유지하는 사이 좋은 타협을 제공합니다. 단일 POL1-PAmCherry 분자의 (C) 예 트랙. (D) 임의의 색상으로 표시된 모든 측정 트랙. 추적 창을 선택하면 (E) 추적 아티팩트 (여기서는 0.8 μM, 12 픽셀) 또는 프레임 당 PSFS의 밀도가 너무 높은 너무 크다. 추적 창에 대한 단계의 길이 (F) 누적 분포 : 0.34 μM (3 픽셀, 빨간 선), 0.57 μM (5 픽셀, 파란 선), 0.80 μm의 (7 픽셀, 녹색 선). 0.34 μm의 추적 창을 0.34 μm의 이상 단계를 차단합니다 어느 명확하게단계의 전체 분포를 자릅니다. 0.80 μm의 추적 창처럼 0.57 μm의 추적 창 단계의 거의 같은 분포를 감지합니다. (G) MSD 곡선은 POL1의 제한 확산을 보여줍니다. 감독 운동, 브라운 운동, 제한된 확산 및 부동 입자 (H) 도식 MSD 곡선. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" width="500" /> 그림 7. 라이브 E.에 POL1의 DNA 수리 활동의 직접 측정 . 대장균 세포 스케일 바 : 1 μm의. (A) 손상되지 않은 세포의 FOV (N = 4,162 트랙)의 4 이상의 단계의 모든 트랙에 대한 명백한 확산 계수 D의 *의 히스토그램. B로 분류 분자의 인구<html> ound 빨간색으로 강조 표시됩니다. POL1-PAmCherry의 (BC) 트랙은 투과광 현미경 이미지에 표시됩니다. 자신의 확산 계수에 따라 결합으로 분류 된 트랙이 빨간색으로 표시됩니다. (D) * D (N = 2,128 트랙)을 묘화 전에 100 ㎜ MMS로 아가로 오스 패드에 고정하고 20 분 동안 배양 한 세포에서 측정 POL1 트랙위한 히스토그램. DNA 수리에 종사하는 결합 분자의 인구는 빨간색으로 표시됩니다. (EF) POL1-PAmCherry 빨간색 단일 POL1의 DNA 수리 이벤트의 흔적을 보여주는 투과광 현미경 이미지를 추적합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="비디오 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/video.jpg" width="400" /> 영화 1. 맞춤 PALM 설정을 구축.JoVE_Uphoff_Movie1.avi &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.

단일 분자 추적과 함께 Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)은 허용 라이브 대장균 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접 관찰 및 정량화.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 살아있는 박테리아 세포 내에서 DNA 결합 단백질의 활성을 직접 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이는 관심 있는 DNA 결합 단백질에 광활성 형광 단백질을 융합하여 발현시킨 세포를 시각화함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 이미징 과정에서 개별 단백질이 광활성화되는 모습을 동영상으로 획득하는 것입니다.그런 다음 데이터를 분석하여 단백질의 위치를 결정하고 단일 세포 내의 단백질을 추적합니다. DNA 결합 사건은 단일 단백질이 염색체와 접촉할 때 확산 계수가 변화하는 것을 통해 식별됩니다. 최종적으로, 세포당 결합된 단백질과 확산되는 단백질의 수를 계산함으로써 단일 세포 수준에서 단백질-DNA 상호작용의 정량적 측정값을 제공할 수 있습니다.이 방법은 생체 내(in vivo) 수선 속도 및 수선 부위의 공간적 분포와 같이 DNA 수선 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이제 살아있는 e coli 세포에서 DNA polymerase one의 수선 활성을 측정하여 이 방법을 시연하겠습니다. 먼저, 500 °C의 가열로에서 1시간 동안 가열하여 배경 형광 입자가 없는 커버슬립을 제작하십시오. 두께 1.5번의 커버슬립 스톡을 준비하여 가열한 후, 알루미늄 호일에 싸서 실온에 보관하십시오.이들은 향후 몇 주 동안 보관이 가능합니다. 다음으로, 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 AB 1157 poly a PA m cherry 균주의 초기 지수 성장기 E coli 1 mL를 넣고 농축합니다. 세포를 2,300 G에서 5분 동안 원심분리하십시오.상층액을 제거하고 세포 펠릿을 20 µL의 잔류 배지로 재현탁한 후, 볼텍싱하여 세포를 완전히 용해시킵니다. 다음으로, 증류수를 사용하여 1.5% 저형광 aros 용액을 조제합니다. 메틸 메탄 설포네이트(MMS)를 이용한 DNA 손상 실험을 위해, 녹인 aeros 500 µL와 2x 최소 배지 500 µL를 혼합하며, 이때 주의 사항을 준수하여 피펫팅으로 몇 번 부드럽게 섞어줍니다.혼합물이 식기 전에, 500 µL의 최소 배지에 8.3 µL의 MMS를 첨가한 후 aros와 혼합합니다. 이를 가열 소독한 커버슬립 위에 도포합니다. 기포가 생기지 않도록 중앙에 고르게 펴 바릅니다.두 번째 소성 커버슬립으로 패드를 평평하게 누릅니다. 식은 후 패드 위의 상단 커버를 제거하고 농축된 세포 현탁액 1 µL를 추가합니다. 새 소성 커버슬립으로 패드를 덮고 매우 살짝 눌러 세포를 고정합니다.세포가 건조되기 전인 45분 이내에 이미징을 수행해야 합니다. 이 시간을 연장하려면, DNA 손상 실험의 경우 패드를 실리콘 가스켓 내부로 밀봉할 수 있습니다. 이미징 전에 세포를 패드 위에서 20분 동안 배양하십시오.실온의 가습 챔버 내에 위치한 이 현미경은 405 nanometer 광활성화 레이저와 561 nanometer 여기 레이저를 갖추고 있습니다. 고경사 조명을 사용하여 커버슬립 표면 위의 얇은 단면 내에 있는 형광체만을 여기시킴으로써 단일 분자 민감도를 구현하며, 형광 방출은 전자 증배 CCD 카메라로 기록됩니다. 샘플을 현미경 스테이지 위에 놓고 세포의 초점을 맞추십시오.투과광 조명 하에서, 데이터 크기를 줄이고 카메라 판독 속도를 높이기 위해 잘라내기 영역(cropped field of view)을 설정하십시오. 주변광으로부터 샘플을 차단하고, 단일 형광 4번 검출을 위해 전자 증배 CCD 카메라의 게인을 켜십시오. 프레임 속도를 프레임당 15.26 milliseconds로 설정하십시오.여기에는 0.26 millisecond의 카메라 판독 시간이 포함됩니다. 노출 시간은 모션 블러가 거의 없는 선명한 형광 점을 관찰할 수 있을 만큼 충분히 짧아야 합니다. 반면, 결합된 분자와 확산되는 분자를 명확하게 구분하기 위해서는 트랙을 충분히 긴 시간 간격으로 샘플링해야 합니다. 이제 카메라 데이터를 표시하여 암전 배경 신호를 확인하십시오.561 nm 레이저를 켜고 여기 배경 신호를 확인합니다. Paul one PA M cherry 융합 단백질의 광활성화를 위해 405 nm 레이저를 켜고, 단일 분자의 형광 반점이 나타날 때까지 강도를 높입니다. 이제 여기 빔의 각도를 조절하여 시료의 얇은 단면만 조사되도록 합니다.커버스립 표면을 덮습니다. 이 방법은 단일 형광 단백질의 검출 및 정밀한 위치 확인에 의존하므로, 데이터 품질을 위해서는 현미경의 최적 정렬과 감도가 매우 중요합니다. 이를 위해 레이저 빔을 100 x 수치구경(numerical aperture) 1.4 대물렌즈의 후초점면에 집중시키십시오.집속 렌즈를 빔과 수직 방향으로 이동시키면 초점이 대물렌즈 중심에서 벗어나 빔이 대물렌즈를 비스듬한 각도로 통과하게 됩니다. 형광 강도는 최대화하고 배경 신호는 최소화하도록 빔을 조정하십시오. 투과광 현미경 모드에서 세포의 새로운 시야를 찾고 이미지의 초점을 맞추십시오.카메라 스냅샷을 촬영하여 세포 윤곽을 기록합니다. 561 nanometer 레이저를 켜고 세포의 자가 형광과 커버 슬립 위의 배경 반점들을 표백합니다. 몇 초 동안 유지합니다.데이터 획득을 시작하기 전에, 561 nm 연속 여기 조건에서 palm 영상을 획득하기 시작하십시오. 405 nm 레이저를 켜고 영상 촬영 과정 동안 강도를 점진적으로 높여 최대 1 W/cm²에 도달하게 하십시오. 세포 자가형광을 유발하는 더 높은 405 nm 강도는 피하십시오.형광 분자의 밀도에 주의하십시오. 형광 반점들이 각 프레임에서 명확하게 분리될 수 있도록 활성화 속도를 낮게 유지하는 것이 중요합니다. 동영상 하나당 약 10,000 프레임을 기록하며, 시야(field of view)를 크롭할 경우 일반적으로 최대 3분이 소요되며 하드 디스크 공간은 최대 1GB까지 차지합니다.한 번 이미징된 시야의 pa m cherry 형광체는 가역적으로 표백되어 더 이상 관찰할 수 없음에 유의하십시오. 다시 한번 언급하지만, 다음 절차에는 matlab의 맞춤형 소프트웨어가 사용됩니다. 단일 형광체는 점 퍼짐 함수 또는 psfs로 나타납니다.영상에서 PSF는 먼저 직경이 7픽셀인 가우시안 커널을 사용하여 밴드패스 필터링된 이미지에서 식별됩니다. 후보 위치는 피크 픽셀 강도가 배경의 표준 편차보다 4.5배 높은 PSF에 해당합니다. 후보 PSF당 국소적으로 가장 밝은 픽셀이 타원형 가우시안 함수 피팅을 위한 초기 추정값으로 사용됩니다. 자유 피팅 매개변수는 X 위치, y 위치, X 너비, Y 너비, 회전 각도, 진폭 및 배경 오프셋입니다.타원형 가우시안 마스크는 노출 시간 동안 분자의 이동으로 인해 PSF 플롯이 흐려지고 변형되는 현상을 보정합니다. PalM movie의 모든 프레임에서 얻은 XY 국소화 결과물을 동일 시야의 투과광 현미경 이미지 위에 겹쳐 놓았을 때, PalM-Cherry의 국소화 지점들은 E. coli 세포의 중앙 영역 내에 나타나야 합니다. 자동 추적을 통해 단백질의 이동을 측정하지만, 적절한 추적 윈도우를 선택하는 것이 매우 중요합니다.먼저, 다양한 추적 윈도우 매개변수 범위에 대해 추적 알고리즘을 실행합니다. 셀당 측정된 트랙 수를 추적 윈도우에 대해 플롯하여, 트랙이 분리되지 않는 가장 작은 가능한 추적 윈도우를 식별하고 결과 트랙을 동일한 시야의 투과광 현미경 이미지에 표시합니다. 세포 내 분자 이동의 공간적 분포를 시각화하려면, 각 트랙이 단일 세포 내에 국한된 확산을 보여야 합니다. 만약 일부 트랙이 세포 사이를 가로지르는 것처럼 보인다면, 이는 추적 윈도우가 너무 크게 설정되었거나 광활성화 속도가 너무 높아서 서로 다른 분자들이 잘못 연결되었음을 시사합니다.연속적인 국소화 지점들 사이의 단계 길이(step length)에 대한 누적 분포를 도식화하십시오. 추적 윈도우(tracking window)가 충분히 크면 곡선이 완만하게 상승하여 포화 상태에 도달하지만, 윈도우가 너무 작게 설정된 경우에는 컷오프 엣지(cutoff edge)가 나타납니다. 적절한 추적 윈도우가 선택되면, Paul one의 확산 특성을 분석할 수 있습니다.각 트랙에 대해 총 n단계의 연속적인 국소화 지점들 사이의 평균 제곱 변위(mean square displacement, MSD)를 계산하십시오. MSD의 통계적 불확실성을 줄이기 위해 최소 5개 이상의 국소화 지점이 포함된 트랙만 사용하십시오. 그다음, MSD로부터 트랙당 겉보기 확산 계수를 산출하십시오. 두 번째 항은 추정된 국소화 오차를 보정하는 것입니다.이것들은 두 번째 항에 대한 값들입니다. 이 예시에서는, 손상되지 않은 세포의 pol one과 MMS를 이용한 DNA 손상 처리 세포의 pol one에 대해 시야 내 모든 트랙에서 측정된 확산 계수 값의 히스토그램을 그립니다. 빨간색 막대는 염색체에 결합되어 0.15 square microns per second 미만으로 확산되는 개별 pol one 분자 집단을 나타냅니다. 반면, 자유롭게 확산되는 분자들은 0.9 square microns per second 주변으로 이동합니다.결합된 Pol $\nu$ 분자가 확인된 후, 결합 부위의 위치를 손상되지 않은 세포와 MMS 손상이 있는 세포에서 시각화할 수 있습니다. 관찰된 전체 트랙 수 대비 결합된 트랙의 비율은 Pol $\nu$의 DNA 복구 활성에 대한 직접적인 정량적 척도를 제공합니다.살아있는 E. coli 세포 내에서 Pol I-PA-mCherry 융합 단백질의 in vivo 광활성화를 수행하였습니다. 광활성화는 세포 내의 단일 PA-mCherry 형광체로 제한될 수 있었으며, 광활성화 비율을 높임으로써 더 많은 형광 분자들을 검출할 수 있었습니다. PALM 동영상 각 프레임에 대해 국소화 분석을 수행하였습니다.고정된 세포 내의 부동 분자 또는 살아있는 세포 내의 결합된 분자를 사용하여 정밀도를 측정한 결과, 이론적 예측과 일치하는 40 nanometers로 나타났습니다. 다음으로, 위치 결정 임계값이 너무 낮을 때의 설정을 검토하였습니다. 임계값이 너무 낮으면 배경 노이즈의 무작위 피크가 후보 위치로 잘못 선택되었으며, 반대로 임계값이 너무 높으면 일부 스팟을 놓치게 되었습니다.결과적으로 Paul one 국소화는 세포의 중앙 영역에 위치하여, e coli 뉴클레오이드의 공간적 조직을 대체적으로 재현하였습니다. 손상되지 않은 세포 내 Paul one 궤적의 대부분은 확산을 나타냅니다. 전형적인 세포는 수백 개의 Paul one 궤적을 포함하고 있으며, 이는 e coli 세포당 약 400개의 Paul one 분자라는 복제수와 일치합니다.다양한 유형의 분자 운동은 여러 지연 시간(lag time)에 걸쳐 MSD 값을 계산함으로써 식별할 수 있으며, 지향성 운동(directed motion)은 포물선형 곡선을 나타냅니다. 브라운 운동(Brownian motion)은 직선으로 특징지어집니다. 제한된 확산(confined diffusion) 곡선은 정체기(plateau)에 도달하며, 부동 입자의 MSD 곡선 오프셋은 국소화 불확실성(localization uncertainty)을 나타냅니다.결과적으로 Paul one의 MSD 곡선은 짧은 lag time에서는 브라운 운동을 나타내는 선형적으로 증가하는 모습을 보였으며, 더 긴 lag time에서는 세포 내 구속으로 인해 포화되었습니다. 이러한 방법들을 사용하여, 손상되지 않은 세포 내 외인성 DNA 알킬화 손상에 대한 Paul one의 DNA 복구 활성을 측정하였습니다. Paul one의 확산 계수 히스토그램은 확산되는 분자들의 지배적인 집단을 보여줍니다.결합된 소수의 분자들은 100 millimolar MMS 손상이 지속되는 환경에서 내인성 DNA 손상의 복구 및 DNA 복제에 관여할 수 있습니다. 확산 계수가 거의 0에 가까운 트랙의 빈도가 상당히 증가합니다. 이는 돌연변이 유발 물질이 존재하는 상태에서 더 많은 Paul one 분자들이 DNA 복구에 관여해야 한다는 모델을 뒷받침하며, 이 절차를 따릅니다.세포 내 단백질의 공간적 분포를 정량화하고 DNA 복구에 관여하는 더 큰 단백질 복합체의 존재를 조사하기 위해 로컬라이제이션(localization)이나 클러스터링(clustering)과 같은 다른 데이터 분석 방법을 수행할 수 있습니다.

visualizing-protein-dna-interactions-live-bacterial-cells-using

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기 기능성 분자 단지가 추적 및 계량, 감지 있도록 박테리아 세포를 생활에 단일 분자 형광 현미경을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

출처: Bratton, B. P. 외, 『박테리아 세포의 3차원 영상 정밀 세포 표현과 단백질 위치 파악』. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 박테리아 세포의 3차원 형광 이미지를 획득하고 분석하여 단일 세포 수준에서 단백질 조직을 연구하는 방법을 시연합니다.

형광 영상을 통한 3차원 박테리아 단백질 분포 시각화

이 비디오는 형광 단백질, 공여자 eGFP 및 수용체 mCherry로 표지된 세포질 단백질을 발현하는 살아있는 박테리아에서 단백질-단백질 상호 작용을 결정하기 위한 FLIM-FRET 이미징 기술에 대해 설명합니다. 결합된 기술은 또한 상호 작용하는 단백질의 정량화를 허용합니다.

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폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 아비딘 코팅 유리 표면에 테더링되고 미세유체 전단 흐름으로 늘어난 형광 단백질 DNA 결합 펩타이드(FP-DBP) 염색 대형 DNA 분자를 시각화하는 접근 방식을 제시합니다.

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형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

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