Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 박테리아 세포에서 DNA 결합 단백질의 활성을 직접 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이는 관심 DNA 결합 단백질에 융합된 광활성화 형광 단백질을 발현하는 세포를 시각화함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 이미지를 촬영하는 동안 사진이 활성화되는 개별 단백질의 동영상을 획득하는 것입니다.

그런 다음 데이터를 분석하여 단백질 국소화를 결정하고 단일 세포 내부의 단백질을 추적합니다. DNA 결합 사건은 단일 단백질이 염색체와 접촉할 때 확산 계수의 변화에 의해 확인됩니다. 궁극적으로, 그 결과는 세포당 결합 및 확산 단백질의 수를 계산하여 단일 세포 수준에서 단백질 DNA 상호 작용의 정량적 측정을 제공할 수 있습니다.

이 방법은 생체 내 복구 비율 및 복구 부위의 공간적 분포와 같은 DNA 복구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이제 우리는 DNA 중합 효소의 복구 활성을 측정하여 방법을 시연 할 것입니다 : 생명 대장균 세포에서 하나 먼저 섭씨 500도의 용광로에서 한 시간 동안 배경 형광 입자없이 커버 슬립을 만듭니다. 두께 번호 1.5의 커버 슬립의 재고 공급을 태우고 알루미늄 호일에 넣어 실온에 보관하십시오.

앞으로 몇 주 동안 사용할 수 있습니다. 다음으로, 초기 지수 위상 E 대장균 밀리리터를 균주의 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 농축합니다. AB 1157 폴리 PA m 체리 2, 300G에서 5 분 동안 세포를 원심 분리하십시오.

상등액을 제거하고 세포 펠릿을 20마이크로리터의 잔류 배지에 재현탁시키고 세포를 용액으로 와류화합니다. 다음으로, 증류수에 1.5%low 형광 aros 용액을 만듭니다. 메틸 메탄 설포네이트 또는 MMS를 사용하여 DNA 손상 실험을 위해 예방 조치를 취하여 용융된 에어로 500마이크로리터를 2개의 최소 배지 500마이크로리터와 혼합합니다.

혼합물이 냉각되기 전에 aros와 혼합하기 전에 500마이크로리터의 최소 매체에 8.3마이크로리터의 MMS를 추가합니다. 탄 커버 슬립에 펴 바릅니다. 거품을 만들지 않고 중앙에 고르게 펴십시오.

두 번째로 탄 커버 슬립으로 패드를 평평하게 만듭니다. 냉각되면 패드에서 상단 덮개를 제거하고 마이크로리터의 농축 세포 현탁액을 추가합니다. 새로 탄 커버 슬립으로 패드를 덮고 매우 부드럽게 눌러 세포를 고정시킵니다.

세포는 건조되기 45분 전에 이미지화되어야 합니다. 이 시간을 연장하기 위해 DNA 손상 실험을 위해 패드를 실리콘 개스킷 내부에 밀봉할 수 있습니다. 이미징하기 전에 세포를 패드에서 20분 동안 배양합니다.

실온의 가습 용기에 담긴 현미경에는 405 나노미터 광 활성화 레이저와 561 나노미터 여기 레이저가 있습니다. 단일분자 감도는 고경사 조명을 사용하여 커버 슬립 표면 위의 얇은 섹션 내에서 형광 4개만 여기함으로써 도달하며, 형광 방출은 전자 증식 CCD 카메라에 기록됩니다. 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 세포에 초점을 맞춥니다.

투과광 조명 아래에서 잘린 시야를 정의하여 데이터 크기를 줄이고 카메라 판독 속도를 높입니다. 주변광으로부터 샘플을 덮고 단일 플루오로 4 검출을 위해 전자 증식 CCD 카메라 게인을 켭니다. 프레임 속도를 프레임당 15.26밀리초로 설정합니다.

여기에는 0.26밀리초의 카메라 판독 시간이 포함되며, 노출 시간은 움직임이 거의 없는 선명한 형광 반점을 관찰할 수 있을 만큼 충분히 짧아야 합니다. 다른 한편으로는, 트랙은 바운드와 확산 분자를 명확하게 구별할 수 있도록 충분히 긴 시간 간격으로 샘플링해야 합니다. 이제 카메라 데이터를 표시하여 어두운 배경 신호를 확인합니다.

561 나노미터 레이저를 켜고 여기 배경 신호를 확인합니다. Paul one PA M 체리 융합 단백질의 광활성화를 위해 405 나노미터 레이저를 켜고 단일 분자의 형광 반점이 나타날 때까지 강도를 높입니다. 이제 여기 빔의 각도를 조정하여 샘플의 얇은 부분만 비춥니다.

커버 슬립 표면을 닫습니다. 이 방법은 단일 형광 단백질의 검출 및 정확한 위치 파악에 의존하므로 현미경의 최적 정렬 및 감도는 데이터 품질에 매우 중요합니다. 이를 위해 레이저 빔을 100 x 개구수 1.4 대물렌즈의 후방 초점면에 초점을 맞춥니다.

초점 렌즈를 빔에 수직으로 변환하면 초점이 대물렌즈의 중심에서 멀어지므로 빔이 비스듬히 대물렌즈를 빠져나가게 됩니다. 형광 강도를 최대화하고 배경을 최소화하기 위해 빔을 조준합니다. 투과광 현미경 모드에서 세포의 새로운 시야를 찾고 이미지에 초점을 맞춥니다.

카메라 스냅샷을 찍어 셀 윤곽선을 기록합니다. 561 나노미터 레이저를 켜고 덮개의 세포 자가형광과 배경 부분을 표백합니다. 몇 초 동안 미끄러집니다.

데이터 수집을 시작하기 전에 연속 561 나노미터 여기(excitation)에서 팜 무비(palm movie) 수집을 시작합니다. 405 나노 미터 레이저를 켜고 영화가 진행되는 동안 점차적으로 강도를 증가시켜 평방 센티미터당 최대 1 와트에 도달합니다. 세포 자가형광을 유발하는 더 높은 405나노미터 강도를 피하십시오.

형광 분자의 밀도에 주의하십시오. 형광 반점이 각 프레임에서 명확하게 격리되도록 활성화율을 낮게 유지하는 것이 중요합니다. 영화 당 대략 10, 000의 구조를 기록하십시오, 자른 화각에 보통 3 분까지 그리고 하드 디스크 공간의 기가바이트까지 가지고 간다.

일단 시야가 이미지화되면, pa m cherry fluorophores는 비가역적으로 표백되어 관찰할 수 없습니다. 다시 말하지만, 다음 절차에서는 matlab의 사용자 지정 소프트웨어를 사용합니다. 단일 형광단은 점 확산 함수 또는 psfs로 나타납니다.

영화에서 psfs는 7개의 픽셀 직경을 가진 가우스 커널을 사용하여 대역 통과 필터링된 이미지에서 먼저 식별되며, 후보 위치는 배경의 표준 편차보다 4.5배 높은 피크 픽셀 강도를 가진 P SFS에 해당합니다. 후보 PSF당 국소적으로 가장 밝은 픽셀은 타원형 가우스 함수를 피팅하기 위한 초기 추측값 역할을 합니다. 자유 맞춤 매개변수는 X 위치 y, 위치 X 너비, Y 너비 회전, 각도, 진폭 및 배경 오프셋입니다.

타원형 가우스 마스크는 노출 시간 동안 분자 이동을 설명하여 PSF 플롯을 흐리게 하고 변형시킵니다. 팜 무비의 모든 프레임에서 투과광 현미경 이미지로의 결과 XY 국소화는 Paul one PAM Cherry의 동일한 시야의 편입 이미지가 대장균 세포의 중앙 영역 내에 나타나야 합니다. 자동 추적은 단백질의 움직임을 측정하지만, 추적 창을 성공적으로 선택하는 것이 중요합니다.

먼저 다양한 추적 기간 매개 변수에 대해 추적 알고리즘을 실행합니다. 추적 창과 비교하여 셀당 측정된 추적의 수를 표시하여 추적을 분할하지 않고 결과 추적을 동일한 시야의 투과광 현미경 이미지에 표시하지 않는 가능한 가장 작은 추적 창을 식별합니다. 세포 내 분자 이동의 공간적 분포를 시각화하기 위해 P one tracks는 트랙의 일부가 세포 간에 교차하는 것처럼 보이는 경우 단일 세포 내에 국한된 확산을 표시해야 하며, 이는 추적 창이 너무 크게 선택되었거나 광 활성화율이 너무 높기 때문에 별도의 분자가 잘못 연결되었음을 시사합니다.

연속된 지역화 사이의 단계 길이의 누적 분포를 플로팅합니다. 곡선은 충분히 큰 추적 창에 대해 부드럽게 상승하고 포화되지만 창이 너무 작게 선택된 경우 차단 가장자리가 표시됩니다. 적절한 추적 창이 선택되면 Paul one의 확산 특성을 분석할 수 있습니다.

총 n개의 단계를 가진 각 추적에 대한 연속적인 지역화 간의 평균 제곱 변위 또는 MSD를 계산하고, MSD의 통계적 불확실성을 줄이기 위해 최소 5개의 지역화가 있는 추적만 사용합니다. 다음으로, MSD에서 트랙당 겉보기 확산 계수를 계산합니다. 두 번째 항은 추정된 현지화 오류를 수정합니다.

이것은 두 번째 항에 대한 값입니다. 이 예에서는 이제 손상되지 않은 세포의 pol 1과 MMS로 DNA 손상 처리 중인 세포의 pol one에 대한 시야의 모든 트랙에서 측정된 확산 계수 값의 히스토그램을 플롯하면 빨간색 막대는 염색체에 결합된 것으로 나타나고 초당 0.15제곱미크론 미만으로 확산되는 개별 pol 1 분자의 집단을 식별합니다. 반면 자유롭게 확산되는 분자는 초당 약 0.9제곱미크론을 움직입니다.

바운드 폴 후에 하나의 분자가 확인되었습니다. 결합 부위의 위치는 손상되지 않은 세포와 mm MS 손상이 있는 세포에서 시각화할 수 있습니다. 관찰된 트랙의 총 수에 대한 바운드 트랙의 비율은 pol의 DNA 복구 활성에 대한 직접적인 정량적 측정을 제공합니다.

pol one PA m cherry 융합 단백질의 생체 내 광 활성화는 살아있는 대장균 세포에서 수행되었습니다. 광활성화는 한 세포에 있는 단일 PA m 체리 형광단으로 제한될 수 있으며, 광활성화율이 높을수록 더 많은 형광 분자가 드러났습니다. 팜 무비의 각 프레임에 대해 위치 파악 분석이 수행되었습니다.

정밀도는 고정된 세포의 부동분자 또는 살아있는 세포의 결합 분자를 사용하여 측정되었으며 이론적 예측과 일치하는 40나노미터인 것으로 나타났습니다. 다음으로, 지역화 임계값이 너무 낮을 때 설정되었습니다. 배경 잡음의 무작위 피크가 후보 위치로 잘못 선택되는 반면, 임계값이 너무 높으면 일부 지점이 누락되었습니다.

그 결과 Paul one 지방화는 세포의 중앙 영역을 차지하여 대장균 핵체의 공간 조직을 광범위하게 요약했습니다. 손상되지 않은 세포에서 Paul One의 대다수 트랙은 확산을 나타냅니다. 전형적인 세포는 대장균 세포 당 대략 400의 폴 1 분자의 사본 수와 일치하는 수백 개의 폴 1개의 궤도를 포함한다.

다양한 유형의 분자 운동은 지연 시간 범위에 대한 MSD 값을 계산하여 식별할 수 있으며, 지시된 운동은 포물선 곡선을 제공합니다. 브라운 운동은 직선이 특징입니다. 제한된 확산 곡선은 고원에 도달하고 부동성 입자에 대한 MSD 곡선의 오프셋은 국소화 불확실성을 나타냅니다.

Paul one에 대한 결과 MSD 곡선은 브라운 운동을 나타내는 짧은 지연 시간에 대해 선형적으로 상승하고 세포 감금으로 인해 더 긴 지연 시간에서 포화되었습니다. 이러한 방법을 사용하여, Paul의 DNA 복구 활성을 측정하였으며, 하나는 손상되지 않은 세포에서 외인성 DNA 알킬화 손상에 대한 반응으로 측정되었습니다. Paul one의 확산 계수 히스토그램은 확산 분자의 우세한 집단을 보여줍니다.

몇 개의 결합된 분자는 연속적인 100밀리몰 MMS 손상 하에서 DNA 복제 및 내인성 DNA 손상의 복구에 관여할 수 있습니다. 확산 계수가 거의 0에 가까운 트랙의 빈도가 크게 증가합니다. 이것은 더 많은 것 폴 1개의 분자가 존재하는 돌연변이 유발 물질로 DNA 수선에 포함되어야 한다 모형을 지원한다 이 절차를 따르기.

국소화, 클러스터링과 같은 다른 데이터 분석 방법은 세포 내 단백질의 공간적 분포를 정량화하고 DNA 복구와 관련된 더 큰 단백질 복합체의 존재를 조사하기 위해 수행할 수 있습니다.