전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

이 실험 전략의 전반적인 목표는 질병과 관련된 비코딩 변이체의 기능을 조사하는 것입니다. 이 방법은 실제로 아미노산 염기서열을 변경하지 않는 유전적 변이가 여전히 질병 표현형에 어떻게 기여하는지와 같은 유전체학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기능 활성에 대한 유전적 변이를 평가하기 위한 간소화된 프로세스를 제공하고 영향을 받는 조절 단백질 및 경로에 대한 통찰력을 제공한다는 것입니다.

이 기술은 후보 원인 변이가 있는 모든 질병의 조사에 도움이 될 수 있습니다. 이러한 변이체를 분석하는 절차는 연구되는 표현형에 관계없이 보편적이기 때문입니다. 이 방법은 인간의 질병에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 모든 유기체의 돌연변이에도 적용할 수 있습니다.

이 실험에서는 B-림프모세포 세포에서 핵 용해물을 준비하지만 이 절차는 대부분의 세포주에 적용할 수 있습니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수한 후 용해를 위해 원하는 수의 세포를 스핀다운합니다. 배지를 흡인하고 얼음처럼 차가운 PBS 10ml를 첨가한 다음 셀을 다시 스핀다운합니다.

PBS로 세포를 두 번 세척하고 탈수 후 PBS를 제거합니다. 7번째 세포까지 10개당 1ml의 PBS를 사용하여 얼음처럼 차가운 PBS에서 세포 구개를 재현탁합니다. 1ml의 세포 현탁액을 1.5mL의 마이크로 원심분리 튜브에 분취하여 각 튜브가 PBS에서 10개에서 7번째 세포를 포함하도록 합니다.

2분 동안 원심분리기를 사용하고 PBS를 흡입합니다. CE 완충액, 1밀리몰 디티오트레이톨(DTT), 1X 포스파타제 억제제, 0.5밀리몰 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)를 추가합니다. 이 완충액 400마이크로리터로 각 세포 팔레트를 재현탁하고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.

각 마이크로 원심분리기 튜브에 25마이크로리터의 10%Nonidet P-40을 넣고 피펫팅으로 혼합합니다. 섭씨 4도에서 원심분리기를 사용하고 최대 속도를 3분 동안 유지합니다. 상층액을 디캔팅하고 버립니다.

다음으로, NE-완충액, 1밀리몰 DTT, 1X 포스포아제 억제제 및 1밀리몰 PMSF의 작업 재고에 추가합니다. 이 완충액 30마이크로리터로 각 세포 구개를 재현탁하고 와류로 혼합합니다. 섭씨 4도의 튜브 로테이터에서 10분 동안 배양합니다.

2분 동안 원심분리기를 사용합니다. 핵 용해물인 투명한 상층액을 수집합니다. 단백질을 분해할 수 있는 여러 번의 동결 해동 주기를 피하기 위해 섭씨 영하 80도에서 보관하기 전에 핵 용해물을 분취하십시오.

프로토콜 텍스트에 설명된 대로 올리고뉴클레오티드의 50나노몰 작업 스톡을 준비하여 이 절차를 시작합니다. 올리고를 섭씨 90도의 열 블록에 5분 동안 놓습니다. 5분 후 가열 블록을 끄고 올리고를 사용하기 전에 최소 1시간 동안 실온으로 천천히 식히십시오.

다음으로 전기영동 이동성 이동 분석 또는 EMSA 겔을 준비합니다. 프리캐스트, 6% 트리스-보레이트-EDTA 또는 TBE 겔에서 슬라이드를 제거하고 탈이온수로 여러 번 헹구어 웰에서 완충액을 제거합니다. 겔 전기영동 장치를 조립하고 내부 챔버를 0.5X TBE 버퍼로 채워 누출 여부를 확인합니다.

외부 챔버로 버퍼가 누출되지 않으면 외부 챔버를 대략 2/3 정도 채웁니다. 젤을 100볼트에서 60분 동안 미리 실행합니다. 사전 실행이 완료되면 200마이크로리터의 0.5X TBE 버퍼로 각 웰을 플러시합니다.

바인딩 버퍼 마스터 믹스를 준비합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에서 모든 반응에 공통적인 이러한 시약을 혼합합니다. 10X 결합 완충액, DTT 폴리소르베이트, 폴리(dI-dC) 및 연어 정자 DNA.

EMSA 반응을 설정하려면 각 마이크로 원심분리 튜브에 뉴클레아제가 없는 물을 추가하여 모든 시약을 추가한 후 최종 부피가 20마이크로리터가 되도록 합니다. 각 마이크로 원심분리기 튜브에 적절한 양의 마스터 믹스를 추가합니다. 8마이크로그램의 핵 용해물을 적절한 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다.

핵 추출물이 없는 올리고를 함유한 튜브를 음성 대조군으로 포함합니다. 50 펨토몰의 올리고를 적절한 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 튕겨서 섞습니다. 내용물을 튜브 바닥으로 짧게 돌립니다.

모든 튜브를 실온에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 마이크로 원심분리기 튜브에 2마이크로리터의 10X 주황색 로딩 염료를 추가합니다. 피펫을 위아래로 섞습니다.

위아래로 피펫팅하여 혼합한 다음 각 샘플을 별도의 웰로 배출하여 실행 전 6% TBE 겔에 샘플을 로드합니다. 주황색 염료가 젤 아래의 2/3에서 3/4로 이동할 때까지 약 60-75분 동안 80볼트에서 젤을 실행합니다. 실행이 완료되면 젤 나이프를 사용하여 플라스틱 카세트를 들어 올립니다.

카세트에서 젤을 제거하고 0.5% TBE 버퍼가 있는 용기에 넣어 건조되지 않도록 합니다. 겔을 적외선 및 화학발광 이미징 시스템의 표면에 놓습니다. 이미지를 방해할 수 있는 기포나 오염 물질을 제거합니다.

프로토콜 텍스트에 설명된 대로 스캔 시스템 소프트웨어를 사용하여 겔을 스캔합니다. 이 절차를 시작하려면 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 5마이크로몰 올리고 작업 재고를 준비합니다. 올리고를 섭씨 95도의 열 블록에 5분 동안 놓습니다.

5분 후 가열 블록을 끄고 올리고를 사용하기 전에 실온으로 천천히 식히십시오. 다음 완충액을 실온으로 데우십시오: 결합 완충액, 낮은 엄격성 세척 완충액, 높은 엄격성 세척 완충액 및 용리 완충액. 각 변형에 대한 결합 혼합물을 준비합니다.

1 부피의 핵 용해물과 2 부피의 결합 완충액을 혼합합니다. 1X 인산가수분해효소 억제제, 0.5밀리몰 PMSF 및 1X 결합 강화제를 추가합니다. 각 결합 혼합물에 10마이크로리터의 5마이크로몰 비오틴화된 포획 DNA를 추가합니다.

튜브를 여러 번 튕겨 섞습니다. 결합 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 결합 혼합물에 100마이크로리터의 스트렙타비딘 마이크로비즈를 추가합니다.

실온에서 10분 동안 배양합니다. 테스트 중인 각 올리고 프로브에 대해 자기 분리기에 결합 컬럼을 배치합니다. 결합 혼합물에 사용된 변형 올리고(variant oligo)로 컬럼에 라벨이 부착되어 있는지 확인합니다.

각 결합 컬럼 바로 아래에 미세 원심분리 튜브를 놓고 100마이크로리터의 결합 버퍼를 적용하여 컬럼을 헹굽니다. 각 결합 혼합물의 내용물을 별도의 컬럼에 피펫으로 주입합니다. 액체가 컬럼을 통해 마이크로 원심분리기 튜브로 완전히 흐르도록 합니다.

100마이크로리터의 낮은 엄격성 세척 버퍼를 컬럼에 적용하고 컬럼 저장소가 비워질 때까지 기다립니다. 100마이크로리터의 낮은 엄격성 세척 버퍼를 컬럼에 다시 적용합니다. 100마이크로리터의 매우 엄격한 세척 버퍼를 컬럼에 적용하고 컬럼 저장소가 비워질 때까지 기다립니다.

100마이크로리터의 고강도 세척 버퍼를 컬럼에 다시 적용합니다. 30마이크로리터의 천연 용리 완충액을 컬럼에 추가하고 5분 동안 그대로 둡니다. 마지막으로, 50마이크로리터의 천연 용리 완충액을 추가로 추가하여 결합된 전사 인자를 용리합니다.

EMSA 결과의 재현성과 동결 해동 주기의 결과를 조사하기 위해 유전적 변이의 참조 또는 비참조 대립유전자를 포함하는 올리고를 사용하여 여러 번의 동결 및 해동 주기 후 B-림프구 핵 추출물의 동일한 준비를 조사했습니다. 파란색 화살표는 프리 프로브를 나타냅니다. 전사 인자(transcription factor)가 올리고(oligo)에 결합하는 것은 겔의 위쪽 절반에 있는 띠로 보이며, 빨간색 화살표로 표시됩니다.

이러한 결과는 이 특정 핵 추출물을 최대 5회까지 동결 및 해동하는 것이 겉보기에는 단백질의 무결성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냅니다. EMSA에 대한 신호 대 잡음비를 최적화하는 것도 중요합니다. 다양한 농도의 올리고를 사용하여 핵 용해물의 단일 제제를 조사했습니다.

밴드의 강도 증가, 최대 100 개의 올리고가 관찰되었습니다. 루푸스 관련 위험 대립유전자에 대한 연구의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 전사 인자인 STAT 1은 DAPA에 의해 먼저 식별된 후 단백질체 분석이 수행되었습니다.

그런 다음 DAPA 웨스턴 블롯을 통해 STAT 1의 정체를 확인하고 STAT 1의 인산화 형태와 루푸스 위험 올리고의 더 높은 결합을 확인했습니다. 이 절차에 따라 질량 분석 및 웨스턴 블롯과 같은 다른 기술을 수행할 수 있습니다. 이것은 대립유전자 의존성 결합을 보여주는 조절 단백질을 식별하는 데 도움이 될 것입니다.

루시퍼라제(luciferase)와 같은 리포터 분석법은 대립유전자의 기능으로서 유전자 발현의 변화를 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다.