사이트 특정 복제 막힘의 유도 E. 대장균 형광 리프레 운영자 시스템을 사용하여

이 실험의 전반적인 목표는 DNA 복구 경로를 연구하기 위해 핵단백질 블록에서 복제 포크를 멈추고 블록 부위의 DNA 구조를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 세포의 복제 장치가 단백질 장애물을 만났을 때 DNA가 어떻게 처리되는지와 같은 DNA 복제 및 복구에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포의 전체 집단에 걸쳐 염색체의 특정 위치에서 복제 포크를 가역적으로 정지시킬 수 있다는 것입니다.

제 연구실의 Karla Mettrick 박사와 대학원생인 Georgia Weaver, Tayla-Ann Corocher가 이 절차를 시연할 것입니다. pKM1 플라스미드에 테트라사이클린 연산자 어레이를 운반하는 E.coli 균주가 이 절차에는 사용됩니다. pKM1은 유도성 황색 형광 단백질 표지 테트라사이클린 억제 단백질인 TetR-YFP를 암호화합니다.

이 E.coli 균주의 신선한 하룻밤 배양을 600나노미터의 광학 밀도로 0.01로 희석하여 선택에 필요한 항생제가 포함된 희석된 복합 배지에 넣습니다. 섭씨 30도에서 600나노미터의 광학 밀도로 0.05 - 0.1로 흔들면서 배양물을 성장시킵니다. 10밀리리터 샘플을 제거하여, 유도되지 않은 대조군으로 작용합니다.

pKM1에서 TetR-YFP 생산을 유도하기 위해 잔여 배양액에 0.01%아라비노스를 첨가합니다. 무유도 배양액과 유도 배양액을 모두 섭씨 30도에서 흔들면서 계속 성장시킵니다. 1시간 후, 형광 현미경을 사용하여 유도 배양물의 각 세포 내에 단일 초점이 있는지 확인합니다.

유도 세포가 차단된 것으로 확인되면 단일 초점을 가진 세포의 70% 이상으로 표시되며 광학 밀도를 기록하고 2차원 겔 전기영동으로 분석을 위해 7.5ml의 샘플을 제거합니다. 유도되지 않은 통제 배양에서 동등한 샘플을 제거합니다. 형광 현미경 검사 전에 시각화 중 세포의 움직임을 방지하기 위해 아가로스 패드를 준비합니다.

각 아가로스 패드에 대해 500마이크로리터의 용융 아가로스를 현미경 슬라이드에 피펫팅하고 아가로스가 응고되기 직전에 커버슬립을 오버레이합니다. 필요할 때까지 젖은 티슈 사이의 슬라이드를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 세포를 확인할 때가 되면 아가로스 패드에서 커버슬립을 제거하고 패드 중앙에 10마이크로리터의 박테리아 배양액을 피펫팅합니다.

약 5분 후 아가로스 패드가 마르면 커버슬립을 교체합니다. 커버슬립에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨리고 슬라이드를 광학 장치 아래에 놓습니다. 위상 현미경을 사용하여 100배 배율로 세포를 시각화합니다.

이미징 소프트웨어 내의 Acquire 대화 상자에서 Exposure Time을 100밀리초로 설정합니다. Acquire를 선택하여 이미지를 캡처합니다. 스테이지를 이동하지 마십시오.

획득됨(Acquired) 대화 상자에서 YFP를 카메라에 연결된 외부 셔터의 조명으로 선택합니다. 노출 시간을 1, 000밀리초로 설정합니다. 무대 조명을 끄고 Acquire를 선택하여 형광 이미지를 캡처합니다.

이 절차를 시작하려면 이전에 수집된 배양 샘플에 아지드화나트륨을 최종 농도 0.1%까지 추가하고 얼음 위에서 최소 5분 동안 배양합니다. 5, 10 분 동안 000 시간 g에 세포를 원심 분리하십시오. 상등액을 버리십시오.

각 세포 펠릿을 200마이크로리터의 PIV 완충액에 재현탁하고 세포를 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 세포를 펠릿화하고 상층액을 버리는 마이크로 원심분리기. 현미경 슬라이드를 40마이크로리터의 적절한 유리 발수 또는 실리콘 용액으로 처리합니다.

슬라이드가 마를 때까지 티슈로 문지릅니다. 50마이크로리터의 PIV에서 세포 밀도가 가장 낮은 세포를 재현탁하고 열 블록에 섭씨 50도에 놓습니다. 다른 모든 샘플의 경우 PIV의 부피를 조정하여 최종 셀 밀도가 각 튜브에서 동일하도록 합니다.

PIV에서 새로 준비된 0.8% 아가로스 용액을 동일한 부피로 샘플에 첨가합니다. 응고를 방지하기 위해 섭씨 50도 이상인지 확인하기 위해 샘플을 열 블록에 보관하십시오. 처리된 슬라이드에 셀-아가로스 현탁액 20마이크로리터 방울을 떨어뜨려 반구형 플러그를 생성합니다.

플러그가 응고되면 한 샘플의 모든 플러그를 단일 마이크로분리 튜브에 부드럽게 밀어 넣고 1ml의 세포 용해 버퍼를 추가합니다. 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후 세포 용해 완충액을 제거하고 EDTA-Sarkosyl-Proteinase K 또는 ESP 용액 1ml를 추가합니다.

섭씨 50도에서 하룻밤 동안 또는 플러그가 투명해질 때까지 배양합니다. 플러그가 투명해지면 ESP 버퍼를 제거하고 플러그를 15ml 튜브로 옮깁니다. TE 버퍼 12ml를 넣고 30분 동안 그대로 둡니다.

TE 버퍼로 플러그를 총 5번 세척하십시오. 섭씨 4도의 플러그를 1ml의 TE 버퍼에 보관하십시오. 복제 중간체를 분석하기 위해 아가로스 플러그의 DNA를 관심 영역에 대한 적절한 제한 효소로 절단합니다.

이 예에서 EcoRV는 어레이 직전, 어레이 내부, 어레이 뒤의 DNA를 절단하여 관심 영역에 5.5kb 및 6.7kb 단편을 제공합니다. 이 절차를 시작하려면 아가로스 플러그를 새 마이크로분리 튜브에 옮기고 150마이크로리터의 제한 효소 완충액을 추가합니다. 25-100 단위의 제한 효소를 첨가하고 섭씨 37도에서 6-8 시간 동안 소화합니다.

섭씨 4도에서 0.4% 아가로스 젤을 준비합니다. 300 밀리리터의 용융 아가로 로즈를 약 25 x 25 센티미터의 젤 트레이에 붓습니다. 빗을 삽입하여 웰이 플러그의 직경과 거의 같은 너비가 되도록 합니다.

젤이 굳으면 빗을 제거하고 젤을 실온으로 옮깁니다. 접종 루프를 사용하여 소화된 아가로스 플러그 중 하나를 우물에 밀어 넣고 플러그의 평평한 면을 DNA가 겔에 들어갈 웰 쪽에 놓습니다. 두 번째 웰마다 동일한 방식으로 단일 플러그를 삽입합니다.

피펫은 0.4 % 아가 로즈를 우물로 용융하여 플러그를 제자리에 밀봉합니다. 빈 웰에 1kb DNA ladder를 로드하여 ladder와 샘플 사이에 간격을 둡니다. 실온의 1xTBE에서 밤새 젤을 실행합니다.

다음 날, 에티듐 브로마이드 밀리리터당 0.3마이크로그램이 함유된 수조에서 20분 동안 젤을 염색합니다. 장파 UV transilluminator로 DNA를 시각화하고 각 레인 조각을 직선으로 균일하게 잘라내어 레인 양쪽에 과도한 아가로스를 최소화합니다. 절제된 겔 레인을 DNA 이동 방향으로 90도로 겔 트레이에 놓습니다.

다음 단계는 2차원 겔을 위해 300밀리리터의 아가로스를 준비하는 것입니다. 아가로스가 섭씨 50도로 냉각되면 용융된 아가로스를 젤 조각 주위에 피펫팅하여 위치를 굳힙니다. 남은 아가로스를 젤 조각과 최소한 같은 높이의 깊이로 트레이에 붓습니다.

겔이 응고되면 DNA가 약 10cm로 이동할 때까지 섭씨 4도에서 에티듐 브로마이드 밀리리터당 0.3마이크로그램을 함유한 1xTBE에서 전기영동합니다. 눈에 보이지 않는 DNA를 포함하기 위해 그 위의 겔을 포함하여 게놈 DNA가 존재하는 블록을 절제합니다. 겔 내의 DNA는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Southern hybridization에 의해 이후에 시각화됩니다.

이 시스템에서, 복제 블록은 세포 내 어레이의 한 사본에 해당하는 하나의 초점을 포함하는 다수의 세포에 의해 확인되었습니다. 안하이드로테트라사이클린(anhydrotetracycline)의 첨가는 블록을 역전시켰고, 어레이의 후속 복제는 다중 병소를 가진 세포의 축적으로 시각화되었습니다. 복제가 차단된 세포는 또한 성장 억제를 보였는데, 이는 안하이드로테트라사이클린(anhydrotetracycline)의 존재 하에서 후속 성장에 의해 역전되었습니다.

복제 중간체를 분석하기 위해 DNA를 1차원에서 전기영동했습니다. 그런 다음 관심 있는 DNA를 절제하고 2차원 전기영동을 통해 선형 DNA의 대각선을 생성했습니다. 어레이 DNA의 남부 혼성화(southern hybridization)는 블록화되지 않은 샘플에서 어레이의 예상되는 5.5kb 및 6.7kb 단편에 해당하는 두 개의 반점을 드러냈습니다.

차단된 샘플은 5.5kb 스폿의 감소와 Y자형 DNA의 축적을 나타내는 타원형 신호의 추가를 보여주었습니다. 안하이드로테트라사이클린(anhydrotetracycline)을 첨가하여 Y자형 DNA 신호를 제거했습니다. 또 다른 일반적인 중간체는 Y-호의 상단에 있는 원뿔 신호와 Y-호의 끝에 있는 선형 DNA의 스파이크로 시각화된 Holliday 접합입니다.

일단 숙달되면, 이 기술은 제대로 준비된다면 8일 안에 끝낼 수 있다. 2D 절차이지만 DNA 구조의 최적 시각화를 위해서는 DNA 플러그의 품질이 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.