사이트 특정 복제 막힘의 유도

본 실험의 전반적인 목표는 뉴클레오프로테인 블록(nucleoprotein block)에서 복제 포크를 정지시키고, DNA 복구 경로를 연구하기 위해 해당 블록 부위의 DNA 구조를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 세포의 복제 장치가 단백질 도로 차단물을 만났을 때 DNA가 어떻게 처리되는지와 같이, DNA 복제 및 복구에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포 집단 전체에 걸쳐 염색체의 특정 위치에서 복제 포크를 가역적으로 정지시킬 수 있다는 점입니다.

본 절차의 시연은 저희 연구실의 Karla Mettrick 박사와 대학원생 Georgia Weaver, 그리고 Tayla-Ann Corocher가 진행하겠습니다. 이 절차에는 pKM1 플라스미드 내에 tetracycline operator array를 보유한 E.coli 균주가 사용됩니다. pKM1은 유도 가능한 yellow fluorescent protein 태그가 붙은 tetracycline repressor 단백질인 TetR-YFP를 인코딩합니다.

이 E.coli 균주의 신선한 overnight 배양액을 선택에 필요한 항생제가 포함된 희석 복합 배지에서 600 nm에서의 광학 밀도가 0.01이 되도록 희석합니다. 배양액을 30 °C에서 진탕 배양하여 600 nm에서의 광학 밀도가 0.05에서 0.1이 될 때까지 키웁니다. 유도되지 않은 대조군으로 사용할 10 mL 샘플을 취해 분리합니다.

남은 배양액에 0.01% arabinose를 첨가하여 pKM1으로부터 TetR-YFP의 생성을 유도합니다. 유도되지 않은 배양액과 유도된 배양액 모두를 30 °C에서 진탕 배양하며 계속 성장시킵니다. 한 시간 후, 형광 현미경을 사용하여 유도된 배양액의 각 세포 내에 단일 초점이 존재하는지 확인합니다.

유도된 세포의 70% 이상이 단일 초점을 가져 세포 차단이 확인된 경우, 광학 밀도를 기록하고 2차원 겔 전기영동 분석을 위해 샘플 7.5 milliliters를 채취합니다. 유도되지 않은 대조군 배양액에서도 동일한 양의 샘플을 채취합니다. 형광 현미경 관찰 전, 시각화 과정 중 세포의 이동을 방지하기 위해 아가로스 패드를 준비합니다.

각 아가로스 패드를 만들기 위해, 녹은 아가로스 500 µL를 현미경 슬라이드 위에 분주하고 아가로스가 굳기 전에 즉시 커버슬립을 덮습니다. 슬라이드는 필요할 때까지 젖은 조직 사이에 넣어 4 °C에서 보관하십시오. 세포를 확인할 시간이 되면, 아가로스 패드에서 커버슬립을 제거하고 박테리아 배양액 10 µL를 패드 중앙에 분주합니다.

약 5분 후 아가로스 패드가 마르면 커버슬립을 다시 덮습니다. 커버슬립 위에 이머전 오일을 한 방울 떨어뜨리고 슬라이드를 광학 장치 아래에 놓습니다. 100배 배율의 위상차 현미경을 사용하여 세포를 관찰합니다.

이미징 소프트웨어의 Acquire 대화 상자에서 Exposure Time을 100 milliseconds로 설정하십시오. Acquire를 선택하여 이미지를 캡처합니다. 이때 스테이지를 이동하지 마십시오.

Acquired 대화 상자에서 카메라와 연결된 외부 셔터의 조명으로 YFP를 선택하십시오. 노출 시간(Exposure Time)을 1,000 milliseconds로 설정하십시오. 스테이지 조명을 끄고 Acquire를 선택하여 형광 이미지를 캡처하십시오.

이 절차를 시작하려면, 이전에 수집한 배양 샘플에 sodium azide를 최종 농도 0.1%가 되도록 첨가하고 얼음 위에서 최소 5분 동안 배양하십시오. 세포를 5,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리하십시오. 상층액은 제거합니다.

각 세포 펠렛을 200 µL의 PIV 버퍼에 재현탁하여 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 마이크로 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다. 현미경 슬라이드를 40 µL의 적절한 유리 발수제 또는 실리콘 용액으로 처리합니다.

슬라이드를 티슈로 문질러 건조시킵니다. 세포 밀도가 가장 낮은 세포들을 50 µL의 PIV로 재현탁하여 히팅 블록의 50 °C에 둡니다. 다른 모든 샘플의 경우, 각 튜브의 최종 세포 밀도가 동일하도록 PIV의 부피를 조절합니다.

PIV 내에 갓 준비한 0.8% Agarose 용액을 샘플과 동일한 부피로 추가합니다. 응고를 방지하기 위해 샘플을 히트 블록에 보관하여 50 °C 이상으로 유지하십시오. 세포-agarose 현탁액 20 µL 방울을 처리된 슬라이드 위에 떨어뜨려 반구형의 플러그를 생성합니다.

플러그가 응고되면, 한 샘플의 모든 플러그를 단일 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮기고 세포 용해 버퍼 1 mL를 추가합니다. 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후, 세포 용해 버퍼를 제거하고 1 mL의 EDTA-Sarkosyl-Proteinase K 또는 ESP 용액을 추가합니다.

50 °C에서 하룻밤 동안 또는 플러그가 투명해질 때까지 배양합니다. 플러그가 투명해지면 ESP 버퍼를 제거하고 플러그를 15 mL 튜브로 옮깁니다. TE 버퍼 12 mL를 추가하고 30분 동안 방치합니다.

플러그를 TE 버퍼로 총 5회 세척합니다. 플러그를 1 mL의 TE 버퍼에 넣어 4 °C에서 보관합니다. 복제 중간체를 분석하려면, 아가로스 플러그 내의 DNA를 관심 영역에 적합한 제한 효소로 절단합니다.

이 예시에서 EcoRV는 어레이 바로 앞, 어레이 내부 및 어레이 뒤의 DNA를 절단하여 관심 영역에서 5.5 kb 및 6.7 kb 조각을 생성합니다. 이 절차를 시작하려면 아가로스 플러그를 새로운 마이크로 튜브로 옮기고 제한 효소 버퍼 150 µL를 추가하십시오. 25~100 unit의 제한 효소를 첨가하고 37 °C에서 6~8시간 동안 반응시킵니다.

4 °C에서 0.4% agarose gel을 준비합니다. 녹인 agarose 300 mL를 약 25 x 25 cm 크기의 gel tray에 붓습니다. plug의 직경과 거의 동일한 너비의 well을 만들기 위해 comb를 삽입합니다.

겔이 굳으면 콤을 제거하고 겔을 실온으로 옮깁니다. 접종 루프를 사용하여 소화된 아가로스 플러그 하나를 웰 안으로 밀어 넣으며, DNA가 겔로 진입할 웰의 측면에 플러그의 평평한 면이 닿도록 배치합니다. 동일한 방식으로 매 두 번째 웰마다 플러그를 하나씩 삽입합니다.

녹인 0.4% agarose를 웰에 피펫팅하여 플러그를 제자리에 밀봉합니다. 1 kb DNA ladder를 빈 웰에 로딩하며, ladder와 샘플 사이에 간격을 둡니다. 1xTBE 내에서 상온에서 하룻밤 동안 젤 전기영동을 수행합니다.

다음 날, 0.3 µg/mL의 ethidium bromide가 포함된 항온수조에서 20분 동안 겔을 염색합니다. 장파장 UV transilluminator를 사용하여 DNA를 시각화하고, 레인 양옆의 불필요한 agarose 포함을 최소화하며 각 레인 조각을 곧고 고르게 절단합니다. 절단한 겔 레인을 DNA 이동 방향의 90도 각도가 되도록 겔 트레이에 배치합니다.

다음 단계는 2차원 젤을 위한 agarose 300 milliliters를 준비하는 것입니다. agarose가 50 degrees celsius로 식으면, 액체 상태의 agarose를 젤 슬라이스 주변에 파이펫으로 분주하여 위치를 고정시킵니다. 남은 agarose를 트레이에 젤 슬라이스 높이와 최소한 같거나 더 높게 붓습니다.

겔이 응고되면, 0.3 µg/mL의 ethidium bromide가 포함된 1xTBE에서 DNA가 약 10 cm 이동할 때까지 4 °C로 전기영동합니다. 보이지 않는 DNA까지 포함하도록 겔 윗부분을 포함하여 genomic DNA가 존재하는 블록을 절제합니다. 겔 내의 DNA는 이후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Southern hybridization을 통해 시각화합니다.

본 시스템에서는 대다수의 세포가 세포 내 어레이 1카피에 해당하는 하나의 초점(focus)을 포함함으로써 복제 블록이 확인되었습니다. anhydrotetracycline을 첨가하자 블록이 해제되었으며, 이후 어레이의 복제는 다수의 초점을 가진 세포들의 축적으로 시각화되었습니다. 복제가 블록된 세포들은 성장 억제를 보였으나, 이후 anhydrotetracycline 존재 하에 배양함으로써 이러한 억제가 해제되었습니다.

복제 중간체를 분석하기 위해, DNA를 1차원 전기영동하였습니다. 이후 분석 대상 DNA를 절단하여 2차원 전기영동을 수행한 결과, 선형 DNA가 대각선 형태로 나타났습니다. 어레이 DNA의 서던 하이브리드화를 통해 블로킹하지 않은 시료에서 어레이의 예상 크기인 5.5kb 및 6.7kb 조각에 해당하는 두 개의 스팟을 확인하였습니다.

블로킹 처리된 샘플에서는 5.5kb 스폿이 감소하고 타원형 신호가 추가되었으며, 이는 Y자형 DNA의 축적을 나타냅니다. anhydrotetracycline을 첨가하면 Y자형 DNA 신호가 사라졌습니다. 또 다른 일반적인 중간체는 Holliday 접합부이며, 이는 Y-arc의 상단에 있는 원뿔형 신호와 Y-arc 끝부분의 선형 DNA에서 뻗어 나오는 스파이크 형태로 시각화됩니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 8일 만에 완료할 수 있습니다. 2D 절차이지만, DNA 구조를 최적으로 시각화하기 위해서는 DNA 플러그의 품질이 매우 중요하다는 점을 기억해야 합니다.