형광 영상을 통한 3차원 박테리아 단백질 분포 시각화

먼저 세포질 붉은 형광 마커와 단백질 특이적 녹색 형광 마커가 표시된 박테리아 세포가 포함된 밀폐된 슬라이드부터 시작하세요.

형광 현미경으로 슬라이드를 관찰하세요.

잘 분리된 박테리아 세포가 있는 필드를 찾아 대표 세포의 중심에 집중하세요.

첫 번째 형광 채널을 설정하고 특정 매개변수에서 z-스택 이미지를 획득하여 대표 세포와 인근 세포의 3차원 형태를 포착합니다.

그 후 두 번째 형광 채널로 전환하여 동일한 파라미터를 가진 동일한 세포의 z-스택 이미지를 다시 획득합니다.

세포 내 박테리아 단백질의 분포를 포착합니다.

각 z-스택에서 개별 셀을 크롭하여 단일 셀 분석을 위해 분리합니다.

이 이미지를 정렬하여 세포 형태에 따른 박테리아 단백질의 분포를 시각화하여, 숙주-병원체 상호작용 시 정밀한 분석을 가능하게 합니다.

커버 슬립을 밀봉한 직후 슬라이드를 현미경 스테이지에 올려놓고, 5분간 열평형 상태가 된 후 현미경 초점 휠을 사용해 셀의 중앙을 초점에 맞춥니다. ND 획득 관련 현미경 소프트웨어에서 Z 스택을 획득하려면 Z 박스를 선택하고 홈 버튼을 눌러 셀 중앙을 시작점으로 설정하세요. 스텝 사이즈를 0.1 마이크로미터, 거리를 4마이크로미터로 설정하고, Z 디바이스가 압전 단계로 설정되어 있는지 확인하세요.

셀의 상단과 하단 모두에 충분한 흐림이 있어 셀이 배경과 거의 구분되지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 람다 창 아래 형광 채널을 영상 중인 형광 분자 설정으로 설정하고, 실험 순서가 람다로 설정되어 각 색상 채널에서 완전한 Z 스택을 얻도록 한 후 전환하세요. 그런 다음 '지금 실행'을 클릭하면 이미지 획득을 시작하세요.

모든 이미지를 수집한 후에는 적절한 이미지 분석 소프트웨어에서 파일을 엽니다. 개별 셀 주위에 박스를 그려서 각 채널별로 두 번 복제하고, 하이퍼스택 중복 박스가 체크되어 있는지 확인한 후 채널을 1개 또는 2개로 변경하세요. 두 스택이 모두 사용 가능해지면, 이미지, 스택, 도구, 그리고 연결 옵션을 선택하여 이미지를 결합하세요.