멤브레인 후보, 시냅틱 응답,의 연결 회로, Neuromodulation과 크레이를 사용하여 근육 조직학 : 학생 실험실 연습

다음 실험의 전반적인 목표는 흥분성 막의 특성과 휴지 막 전위의 이온 기반을 이해하고, 막 전위를 측정하는 방법을 배우고 시냅스 전달의 특성을 입증하는 것입니다. 실험의 한 부분에서는 세포 외 칼륨을 변경하면서 휴지 막 전위를 측정합니다. 실험의 다른 부분에서는 다양한 운동 단위에서 자극된 시냅스 반응을 기록하여 시냅스 분화 메커니즘을 조사할 것입니다.

다음으로, 유지 관리가 쉬운 신경 회로가 제시됩니다. 이 준비는 교육뿐만 아니라 CNS에 대한 감각의 다양한 측면을 연구하고 뉴런을 근육 회로에 운동시키는 데 사용할 수 있습니다. 이 일련의 실험은 가재 모델을 사용하여 막 전위 시냅스 통합 및 전달, 근섬유 유형의 구조적 차이와 관련된 문제를 해결하는 것이 용이함을 보여줍니다.

전기생리학적 개념과 기술을 가르칠 때 가재 제제를 사용하는 주요 이점은 해부의 용이성, 제제의 최소 식염수의 생존 가능성, 시냅스 반응을 쉽게 얻을 수 있다는 점, 근육의 전반적인 해부학적 배열을 쉽게 식별할 수 있다는 것입니다. 이러한 기술은 다른 제제에도 적용될 수 있으며 시냅스 생리학 및 조절, 입증된 제제의 생화학적 및 구조적 차이에 대한 이해를 증진시킬 것입니다. 수술을 시작하려면 몸길이가 약 6-10cm 인 가재를 선택하여 으깬 얼음에 5 분 동안 넣어 마취시켜 가재의 목을 베고 머리 뒤에서 잡고 큰 가위를 사용하여 가재의 발톱과 입에 손가락이 닿지 않도

가재의 눈 뒤를 깨끗하게 잘라 머리를 빠르게 제거하고 가재의 다리와 발톱을 제거하여 부상을 입지 않도록 합니다. 수컷의 스타일과 수컷과 암컷 모두의 수영 ettes를 제거하십시오. 머리와 부속물을 처분하십시오.

다음으로, 복부와 흉부를 연결하는 관절막을 따라 절단하여 복부와 흉부를 분리합니다. 가재의 복부 부분을 저장하고 흉부를 처분하고 가위를 복부 쪽쪽을 향해 약간 아래로 향하게 한 다음 각도를 맞추고 복부 양쪽의 아래쪽 측면 경계를 따라 껍질을 비스듬히 자릅니다. 가재를 너무 깊게 자르지 않도록 주의하세요.

집게를 사용하여 각 세그먼트의 길이를 달리는 가재 선의 자연스러운 껍질 패턴을 따르십시오. 껍질의 복부 부분을 위아래로 당겨 제거합니다. 복부 근육이 파괴되지 않도록 주의한다.

굴곡근을 제거하십시오. 이 시점에서 깊은 굴곡근 위에 흰색 조직 덩어리가 보일 수 있습니다. 이 조직을 집게로 조심스럽게 제거하십시오.

위장관은 이제 깊은 굴곡근의 정중선을 따라 달리는 작은 튜브로 보입니다. 위쪽에 있는 집게로 꼬집어 복부에서 당겨 제거합니다. 꼬리 끝에서 위장관의 바닥을 자릅니다.

배설물이 준비를 방해하지 않도록 식염수로 해부를 헹굽니다. 해부 핀을 사용하여 준비물의 상단 및 하단 모서리를 S 가드 코팅된 페트리 접시에 고정합니다. 이제 복부 신전근이 노출되었습니다.

세포 내 기록이 수행될 때까지 제제를 덮기 위해 페트리 접시에 식염수를 붓습니다. 페트리 접시를 현미경으로 옮기고 접시 아래에 왁스를 사용하여 움직이지 않도록 합니다. 세포 내 기록에 사용되는 장치가 이 그림에 나와 있습니다.

적절한 연결 및 설정은 함께 제공되는 텍스트에 나와 있습니다. 지침에 따라 랩 차트 소프트웨어를 설정합니다. 함께 제공되는 텍스트에서 접지선을 식염수 욕조에 놓습니다.

3 몰 염화칼륨으로 채워진 유리 마이크로 피펫의 끝을 식염수 욕조에 넣고 전극 저항을 테스트합니다. 전극 저항은 20-60메가옴이어야 합니다. 의 거친 손잡이 사용 ampliifier는 고강도 조명에서 실험실 차트의 선을 0으로 이동합니다.

현미경을 통해 종방향 DEM 근육을 식별합니다. 전극 프로브를 사용하여 세포 내 전극을 DEM 근육의 근섬유에 삽입합니다. 전극은 근섬유에 거의 삽입되지 않아야 합니다.

세포를 완전히 관통하지 않도록 주의하십시오. 휴지 전위의 진폭을 측정합니다. M 커서를 차트 창의 왼쪽 아래 모서리에 있는 위치에서 추적으로 드래그합니다.

마커 M을 기준선에 놓고 커서를 기록된 신호의 가장 낮은 지점으로 이동합니다. 마커와 활성 커서의 차이는 화면의 오른쪽 상단에 표시됩니다. 이 값은 휴지 막 전위의 전압입니다.

기록 된 전압을 증폭량으로 나눕니다.이 경우 10 x 증폭이 사용되었습니다. 그런 다음 전압을 볼트에서 밀리볼트로 변환합니다. 해당 근섬유의 휴지 전위를 기록한 후 현미경을 통해 보고 근섬유에서 전극을 조심스럽게 제거합니다.

다른 근육 섬유에 대한 세포 내 기록을 반복합니다. 이 실험의 다음 부분에서는 휴지막에 대한 세포 외 칼륨 농도를 높이는 효과를 모니터링할 것입니다. 잠재적인 6개의 가재 식염수는 5.4, 20, 40, 60, 80 및 100 밀리몰의 칼륨 농도와 함께 사용됩니다.

기록 사이에 다음 세포 내 녹음을 수행하기 위해 경련하지 않는 근육을 선택하십시오. 수조 용액을 다음으로 높은 농도의 염화칼륨 용액으로 교체하십시오. 매번 준비를 완전히 덮어야 합니다.

각 용액에 대한 멤브레인 전위의 변화를 기록합니다. 세포외 칼륨 농도를 높이는 효과, 멤브레인 전위는 이 화면 캡처 플롯에 나타나 있으며, 세포 외 칼륨 농도 대 멤브레인 전위의 반 로그 플롯에서 각 칼륨 농도에 대한 휴지 멤브레인 전위를 플롯합니다. 5.4 millimolar 세포외 칼륨에서 휴지 전위를 정렬하십시오.

가상 곡선과 관측된 곡선의 경우, 관측된 선의 기울기를 가상 곡선의 기울기와 비교합니다. 이러한 전기생리학적 기록을 마친 후 다음 단계는 근섬유의 해부학적 구조와 신경 분포 패턴을 조사하는 것입니다. 준비물을 스탠딩 접시에 옮기고 메틸렌 블루를 추가합니다.

5분 후 메틸렌 블루를 제거하고 신선한 가재 식염수를 추가합니다. 분절 내의 근육에 신경을 분포시키는 주요 신경을 찾으십시오. 세그먼트의 S-E-M-D-E-L 2D EL one 및 DEM 근육에 신경 분포 패턴을 스케치합니다.

다음으로, 제제를 흄 후드 아래로 옮깁니다. 식염수를 제거하고 정착제를 첨가하십시오. 여기에 사용된 정착제는 포인 용액입니다.

흄 후드의 목적은 정착제의 증기를 피하는 것입니다. 이 용액이 피부나 눈에 묻지 않도록 각별히 주의하십시오. 눈이 따가워지기 시작하면 즉시 세안 스테이션에서 눈을 씻으십시오.

제제에 boin 용액을 10 분 정도 그대로 둔 다음 피펫을 사용하여 용액을 식염수로 교환합니다. DEL 1 또는 DEL 2 근육의 얇은 부분을 잘라냅니다. 유리 슬라이드에 놓습니다.

슬라이드에 레이블을 지정합니다. SEM 근육에 대해 절차를 반복합니다. 복합 현미경을 사용하여 두 조직 제제에서 sarcomere banding 패턴을 확인합니다.

다음 일련의 실험에서는 가재 복부 근육의 시냅스 반응을 기록하는 방법을 조사할 것입니다. 다른 가재를 선택하고 목을 베십시오. 흉부와 부속물을 제거하고 수술에서 보여지는 것처럼 복부 신전근을 노출시킵니다.

이 비디오의 첫 번째 섹션에서는 현미경을 사용하여 운동 축삭돌기를 신근 근육으로 운반하는 신경을 찾습니다. 가장 접근하기 쉬운 신경을 가진 세그먼트를 찾으십시오. 신경은 흰색이며 피펫을 사용하여 제제에 식염수를 뿌리거나 제제에 가볍게 불어 보면 볼 수 있습니다.

이것은 신경을 움직이게 하여 식별하기 쉽게 만듭니다. 마이크로미터 매니퓰레이터가 잡고 있는 흡입 전극을 신경 바로 위에 놓습니다. 주사기를 부드럽게 당겨 신경을 전극 안으로 끌어들입니다.

현미경을 통해 신경이 전극으로 빨려 들어가는 것을 볼 수 있습니다. 함께 제공되는 문서에 지정된 대로 랩 차트 소프트웨어의 설정을 조정합니다. 3몰 염화칼륨 유리 마이크로 전극을 채우고 헤드 스테이지와 파워 랩에 연결합니다.

의 코스 노브 사용 ampliifier를 사용하여 랩 차트의 선을 0으로 이동합니다. 전극을 삽입하기 전에 토글 손잡이를 여러 번 켰다가 꺼야 합니다. 전극 저항을 테스트하려면 결과 값의 진폭을 측정하십시오.

현미경을 통해 보고 전극 프로브를 사용하여 DEM 또는 DL 1 또는 DL 2의 세로 근육 섬유 중 하나에 전극을 삽입합니다. 근섬유를 통해 침투하지 않도록 주의하세요. 이제 실험을 위한 준비가 완료되었습니다.

흡입 전극은 분절 신경 다발을 자극하는 데 사용되며, 유리 마이크로 전극은 근섬유의 시냅스 반응을 기록하고, 이식편 자극기를 트리거하여 위상 반응을 위해 1헤르츠에서 신경을 자극하는 데 사용됩니다. 다음으로 전극을 SEL 근섬유에 넣습니다. SEL은 긴장성 근육입니다.

긴장 반응을 위해 10헤르츠에서 짧은 펄스로 신경을 자극합니다. DEL 근육과 SEL 근육의 기록된 반응을 비교합니다. 위상 DEL 근육은 긴장성 SEL 근육보다 더 큰 진폭 시냅스 반응을 가지고 있습니다.

이 다음 실험 세트는 신전근(extensor muscle)보다는 가재 굴곡근(crayfish flexor muscle)에 초점을 맞춥니다. 새로운 가재로 시작하여 이 수술에서 보여지는 대로 복부를 분리하십시오. 이 비디오의 첫 번째 섹션에서는 분리 된 꼬리 제제를 식염수로 채워진 페트리 접시에 넣고 꼬리와 준비물의 윗부분을 고정합니다.

dec Caro는 긴장 굴곡근에 대한 실험을 통해 복부 신경삭을 온전하게 유지해야 합니다. 메스를 사용하여 제제의 복부 쪽에 있는 두 갈비뼈 사이의 관절막을 세로로 절단하기 시작합니다. 깊은 절단은 표재성 근육이 손상되지 않도록 하기 위해 운동 신경근을 가로질러 절단할 수 있으므로 이 절단을 할 때 너무 깊게 절단하지 않도록 매우 주의하십시오.

다음 단계를 수행합니다. 근육을 덮고 있는 얇은 막층의 세로 절단에서 수평으로 절단한 가위나 메스를 사용하여 현미경을 통해 봅니다. 절단부를 확대하여 관절막의 플랩을 만들고 플랩을 위로 들어 올립니다.

가위를 사용하여 플랩을 잘라내면 표재성 굴곡근에서 세포 내 기록을 위해 표재성 굴곡근이 노출됩니다. 휴지 막 전위와 복부 신전근의 시냅스 반응을 기록하는 데 사용된 것과 동일한 기기 및 설정을 사용합니다. 이전과 마찬가지로 3개의 염화몰로 채워진 세포 내 전극을 사용하십시오.

전극을 표재성 굴곡근의 근섬유에 삽입하고 근육을 관통하지 않도록 주의하십시오. EPSP의 자발적인 활동을 기록합니다. EPSP의 크기가 다르고 IPSP가 있는지 확인합니다.

작은 붓을 가지고 기록 전극이 들어있는 동일한 세그먼트 내의 큐티클 가장자리를 따라 조심스럽게 솔질합니다. 더 큰 반응이 관찰되는 경우 자극으로 인한 EPSP의 빈도 또는 크기의 변화를 기록하십시오. 이것은 감각 신경 발화의 변화에 반응하는 추가 운동 뉴런의 동원을 나타냅니다.

식염수 수염수 용액을 1마이크로몰 세로토닌 또는 이산화탄소로 거품이 일린 식염수와 같은 신경 조절제가 포함된 용액으로 조심스럽게 교체하십시오. 그런 다음 페인트 브러시 자극을 반복합니다. 수조 용액을 교체하는 것이 기록된 활동에 미치는 영향에 유의하십시오.

목욕 식염수를 다시 일반 식염수로 변경하고 근섬유 활동이 기준선으로 돌아가는 것을 관찰합니다. 이 그림은 표재성 굴곡근 섬유에 기록된 EPSP를 보여줍니다. EPSP의 크기가 다르다는 점에 유의하십시오.

이 실험의 다음 단계에서는 세포외 전극을 사용하여 중추신경계에 대한 감각 활동의 활동에 반응하는 운동 뉴런에서 운동 뉴런 회로에 이르는 활동 전위를 모니터링합니다. 감각 신경을 자극하기 위해 흡입 전극을 만드는 것부터 시작하십시오. 화염 위로 플라스틱 튜브 조각을 당깁니다.

다음 단계는 튜브를 원하는 크기로 다시 자르는 것입니다. 이렇게 하려면 흡입 전극의 원하는 개구부 직경을 판단하기 위해 준비 과정에서 신경을 살펴봐야 합니다. 가재의 크기에 따라 신경 다발의 크기는 직경이 약 1mm에서 몇 mm까지 다양할 수 있습니다.

튜브의 늘어난 부분을 잘라 팁의 구멍을 신경을 지탱할 수 있는 올바른 크기로 만듭니다. 구멍이 너무 크면 신경이 떨어질 수 있습니다. 개구부가 너무 작으면 전극의 압력에 의해 신경이 손상될 수 있습니다.

유리 suc 전극의 끝에 플라스틱 튜브를 놓습니다. 전기생리학 및 소프트웨어 설정은 설정된 세포 내 기록과 비교하여 세포 외 반응을 모니터링하는 것과 약간 다릅니다. 동반 기사에 명시된 바와 같이, 장비는 표재성 굴근을 신경 분포시키는 세 번째 경로를 흡입 전극으로 흡입합니다.

이제 활동 전위를 기록하기 시작할 수 있습니다. 이 경로에는 5개의 흥분기 운동 뉴런과 1개의 억제체 운동 뉴런이 있습니다. 기준선 활동을 기록한 후 브러시로 큐티클을 자극하여 생성된 활동 전위의 변화를 관찰합니다.

그런 다음 이전 실험에서와 같이 목욕 용액을 세로토닌과 같은 신경 조절제로 교체하고 반응의 변화를 기록합니다. 추가 연습 문제는 함께 제공되는 텍스트에 나와 있습니다. 이 기록은 브러시로 큐티클을 자극하기 전과 자극하는 동안 세 번째 경로에서 기록된 활동 전위를 보여주며, 브러시 전의 활동 전위의 빈도를 자극 중 빈도와 비교합니다.

이 기록은 생리식염수와 세로토닌 용액의 세 번째 경로에서 기록된 활동 전위를 보여줍니다. 방금 보여진 바와 같이 생리식염수에서 활동 전위의 빈도와 그 빈도 및 세로토닌을 비교하십시오. 브러싱은 기준선을 초과하는 발사 빈도를 증가시킵니다.

또한 세로토닌이 생리식염수에 비해 발화 빈도를 증가시킨다는 사실도 입증된 활성이 입증되었습니다. 이 그림은 칫솔질과 세로토닌을 결합하면 발화 빈도가 훨씬 더 증가한다는 것을 보여줍니다. 휴지 막 전위에 대한 외부 칼륨 농도의 외부 및 이론적으로 파생된 효과의 비교는 막 전위에 대한 이온의 영향을 나타냅니다.

또한 위상근(phasic muscle)과 긴장성 근육(tonic muscle)의 신경근 접합부(neuromuscular junctions)에서 ntic 반응을 기록하는 방법도 보여줬다. 이러한 기술은 기본 개념과 생리학을 가르치기 위해 조사 학생 실험실에서 사용할 수 있습니다. 이 실험실 실습에서 얻은 기술은 의학 및 건강과 관련된 생리학적 응용뿐만 아니라 다른 실험실 준비와 관련된 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.