Name: 에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균 /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 학습하세요 E. coli에서 무작위 돌연변이 라이브러리 생성 및 기능 선택을 통한 단백질 지도 진화 방법. 이 프로토콜은 산업 및 생의학적 목적을 위한 새로운 효소 활성 개발에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 작품은 수상 K08 MC로 CA116429 - 04과 지금 정복 암에서 부여 (우려) 기초 # 8501에 의해 지원되었습니다

<ol><li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+DNA+Gene+Seq%22%5BJournal%5D)">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase%2C+ribonuclease+H%2C+and+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li>
<li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ColE1+replication+control+circuitry%3A+sense+from+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li>
<li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li>
<li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile%28709%29+in+motif+A+functions+in+base+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li>
<li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li>
<li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li>
<li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27evolvability%27+of+promiscuous+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li>
<li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+experiments+with+microorganisms%3A+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li>
<li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC%28Ts%29+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 문서는 복제 또는 PCR에 대한 필요없이 대규모 무작위 돌연변이 라이브러리의 생성을 허용하는 돌연변이 유발 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 플라스미드 인코딩 관심 일련의 오류가 자주 발생하는 복제를 기반으로합니다. 이론적으로, 돌연변이 크게 RNA / DNA 스위치의 바로 하류에 위치한 100-300 BP로 제한되어야 리더 스트랜드 중간의 크기는 폴 I 2,10에 의해 생산. 우리는 플라스미드 오라이 증가 (그림 3)에서 거리로 주파수에 떨어지지만이 프로토콜에서 제시한 조건 하에서, 폴 I의 변이가 모든 플라스미드를 통해 발생하는 것으로 나타났습니다. 이 발견은 전환 또는 ColE1 플라스미드 복제하는 동안 폴 III에 폴 I에서 &quot;스위치가&quot;최소한의 실험 조건이에서 훨씬 더 점진적으로 이전에 보고된 것보다 것을 의미하고, 폴 I와 폴 사이의 기능 중복을 제안 이전의 연구에 동의 III 11. 우리의 원래의 프로토콜은 액체 문화 (4)에서 돌연변이 유발을 설명했다. 이 프로토콜은 RNA / DNA 스위치 (표 1)에 인접한 1000 BP 내에 0.41 돌연변 / D &lt;1000, IE 용 킬로바이트를 산출. 어떤 신선한 매체의 추가없이 3 일간 통에 액체 문화를 떠나는하여 Hypersaturation은 0.70 변이 / 킬로바이트하지만 매우 가난 플라스미드 수율 결과 (1 % 미만 1 일에 비해, 데이터는 표시되지 않음)에 돌연변이 주파수를 올립니다 ( 표 1). 여기에 우리가 직접 37 단단한 한천에 플라스미드 대상의 변환 도금을 기반으로 단순화된 프로토콜을 제시 ° C (그림 1). 이 절차는 돌연변이 유발의 돌연변이 /주기 (0.92 돌연변 / D &lt;1000 KB)의 가장 큰 빈도를 생산 크게 반복을 용이하게합니다. 고체 미디어 문화 조건을 변경하면 변이 스펙트럼 (표 2)에 영향을 미칩니다. 직접 도금 돌연변이 유발이 표시는 (C → T 대 G → A와 → G → C T 대 비교) 액체 문화에서 볼 보완 기지 페어 대체 간의 이러한 비대칭성 감소시킵니다. 한편, 직접 도금 더 indels을 (이하 0.5 % 4 %에서) 생산 및 G / C 돌연변이 (74 %)의 overrepresentation로 이어지는 3 배로 → G 변이의 수를 감소. 전반적으로, 우리는 여기 제시 직접 도금 프로토콜의보다 단순 성과 효율성 향상 액체 돌연변이 유발에 의해 만들어진 약간 더 균형 돌연변이 스펙트럼의 장점을 능가 있다고 생각합니다. 플라스미드 대상 내에서 우리의 방법에 의해 생성되는 돌연변이가 원하는 대상 순서로 제한되지 않습니다. 그것이 오히려 양적 변화보다는 질적을 나타냅니다 그러나, 소설 생화학 활동의 발전, 목표 유전자 내에 돌연변이에 의존해야합니다. 따라서, 기울기 접시에 돌연변이 선별과 함께 플라스미드 돌연변이 유발을 결합하는 새로운 생화 학적 속성의 진화를위한 시스템 (대형 라이브러리와 선택의 가용성)의 장점에 capitalizes. 이러한 기존의 효소 활동을 최적화하거나 유전자의 특정 영역을 randomizing 등 무작위로 돌연변이 유발의 다른 응용 프로그램이 임의의 돌연변이 유발 다음 복제를 사용해야합니다. 이 경우에는, PCR의 증폭 제품 반대로 플라스미드의 도서관 것은 증폭 및 제한을 용이하게하여 복제의 효율성을 향상시킵니다. 요컨대, 우리는 단순과 생성된 라이브러리의 다양성을 위해 의미 주어진 대상 유전자의 무작위 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는이 방법이 새로운 생화 학적 활동의 효율적인 진화를위한 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리의 생체내 생성된 라이브러리는 기존 활동의 사이트에 특정 돌연변이 유발 또는 최적화를 허용, 쉽게 복제하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>카르베니실린(carbenicillin)</td><td>Cellgro</td><td>46100R6</td><td>최종 농도 0.1mg/ml</td></tr><tr><td>테트라사이클린(tetracycline)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP7640</td><td>최종 농도 0.05mg/ml</td></tr><tr><td>클로람페니콜(chloramphenicol)</td><td>Genlantis</td><td>M120100</td><td>최종 농도 0.03mg/ml</td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth Miller</td><td>Difco Laboratories</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>연한 한천 배지(Soft Agar)</td><td>Difco Laboratories</td><td>214580</td><td>자체 제작</td></tr><tr><td>아크리딘 오렌지(Acridine Orange)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A38401-1</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam B 에멀젼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤(Glycerol)</td><td>Acros Organics</td><td>332030025</td><td></td></tr><tr><td>100x100x15mm 사각 디쉬</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711A</td><td></td></tr><tr><td>100mm 원형 디쉬</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712A</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 25x75x1mm</td><td>Gold Seal</td><td>3048</td><td></td></tr><tr><td>전기천공기 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전기천공기 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2mm 갭 튜브(gap tubes)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>Zippy 미니 프렙 키트</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>D4020</td><td></td></tr></tbody></table>

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 e. 대장균</em

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

유전자 다양성의 효율적인 세대는 DNA 합성을 레이블에 고유한 분자 서명을 만들거나 실험실에서 단백질을 진화하는 데 사용할 수있는 귀중한 분자 도구를 나타냅니다. 여기, 우리는 주어진 대상 시퀀스 대형 (&gt; 10 11) 돌연변이 라이브러리의 생성을 허용하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 DNA의 중합 효소의 낮은 충실도 변형하여 ColE1 플라스미드 인코딩 원하는 순서의 복제 I (LF - 뽈 I)을 기반으로합니다. 플라스미드 대상은 E.의 mutator 변형으로 변화됩니다 대상 유전자의 위치에 따라 0.2, 1 변이 / 킬로바이트 사이 항복 대장균 및 고체 미디어에 도금. 높은 돌연변이 주파수는 돌연변이 유발의 과정을 iterating하여 얻을 수 있습니다. 더 복제 또는 PCR에 참여하지 않습니다과 같은 돌연변이 유발의 다른 방법에 비해, 우리의 프로토콜은 그 단순을 위해 의미합니다. 따라서, 우리의 방법은 mutational plasmids 또는 기타 폴 I 템플릿의 라벨 또는 원래의 대상에 존재하지 않는 활동의 진화에 대한 순서 공간 큰 부분을 탐험에 이상적입니다. PCR 또는 무작위 oligonucleotide 기반 방법을 제공은 또한 라이브러리의 특정 섹션의 후속 복제를 통해 얻을 수있는 꽉 공간을 제어합니다. 여기서 우리는 임의의 돌연변이 라이브러리를 만드는 방법을 보여주는 프로토콜을 제공하고 E.에서 마약을 기반으로 선택을 설정하는 방법 새로운 생화 학적 활동을 전시 돌연변이를 식별하는 대장균.

여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

유전적 다양성의 효율적인 생성은 DNA 합성을 표지하거나 고유한 분자적...을 생성하는 데 사용할 수 있는 매우 가치 있는 분자 도구입니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 주어진 표적 DNA 서열에 대한 무작위 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 반정량적 기능 선택법을 사용하여 돌연변이체를 신속하게 식별 및 특성화하는 것입니다. 이는 먼저 표적 서열을 포함하는 하나의 복제 원점을 가진 플라스미드를 mutator 균주에 형질전환함으로써 이루어집니다. 세포를 도말하고 하룻밤 동안 배양한 후, 세포를 수확하고 표적 플라스미드를 분리하여 돌연변이 라이브러리를 얻습니다. 이후 프로토콜의 두 번째 단계에서 돌연변이 라이브러리를 readout 균주에 형질전환하여 돌연변이의 특성을 분석합니다. 기울기 성장 플레이트(gradient growth plate)를 제작하고, 소프트 아가(soft agar)가 담긴 별도의 페트리 접시에 readout 균주의 박테리아 배양액을 접종합니다.절차의 마지막 단계는 이러한 박테리아 배양물을 그라디언트에 스탬프 전사하는 것입니다. 결과적으로, 약물 그라디언트 상의 성장 차이를 통해 특정 표적 서열의 표현형 프로파일 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 비디오에서는 e coli 내 단백질의 지향적 진화를 위한 방법을 제시합니다.이 과정은 무작위 영양소 라이브러리를 생성한 후 그 다양성을 제한하는 선택 과정을 거치는 자연 진화 과정을 모방한 것입니다. 따라서 이를 통해 산업적 또는 생의학적 목적을 위한 새로운 생화학적 활성을 생성하는 능력을 향상시킬 수 있습니다. 이 절차는 무작위 돌연변이 라이브러리 생성과 기능 획득 돌연변이를 얻기 위한 기능적 선택이라는 두 가지 구성 요소로 이루어져 있으며, 본 절차의 시연은 저희 실험실의 기술원인 Jennifer Allen이 담당하겠습니다.본 프로토콜을 시작하기 전, 서면 프로토콜에 기술된 대로 미리 준비된, 저충실도(low fidelity) DNA polymerase I(또는 저충실도 pol I) 변이체를 발현하는 전기 천공 가능(electro competent) JS 200 세포를 준비하십시오. 이 세포들은 pol I의 온도 민감성 대립유전자를 포함하고 있어, 37 °C에서 저충실도 pol I 활성이 우세하게 나타납니다. 타겟 서열이 복제 원점 인근에 클로닝된 coli 1 복제 원점을 포함하는 타겟 플라스미드를 구축하십시오. 저충실도 pol I이 coli 1 플라스미드 복제를 개시하며, 이를 통해 돌연변이를 도입하여 돌연변이 유발을 시작합니다.2mm 갭(gap)의 전천공 큐벳에 전기천공 유능 세포 40 µL와 30~250 ng의 표적 플라스미드 DNA를 혼합합니다. 1800 V의 전압으로 혼합물에 전기천공 펄스를 가합니다. 각 샘플에 대해 균일한 전천공 조건이 유지되는지 확인하기 위해 시정수(TC)를 점검합니다.이상적으로 TC는 5~6 ms입니다. 세포 DNA 혼합물을 1 mL의 LB 배지에서 37 °C로 250 RPM으로 진탕하며 40분 동안 회복시킵니다. 두 플라스미드를 모두 선택할 수 있는 적절한 항생제가 포함되어 있고 37 °C로 예열된 100 mm LV agro 페트리 접시를 준비합니다. 회복된 세포를 적절히 희석하여 이 예시에서 보여주는 것과 같이, 개별적으로 구분되지만 그 수를 셀 수 없는 정도의 밀도인 near lawn 농도로 도말합니다.하룻밤 동안 배양한 후, LB 배지를 사용하여 페트리 접시의 박테리아 콜로니를 수확합니다. 수확한 세포로부터 플라스미드 DNA를 분리합니다. 이렇게 얻은 플라스미드 DNA가 무작위 돌연변이 라이브러리가 됩니다.표적 플라스미드와 폴 플라스미드(pole plasmid)를 모두 선형화하는 제한 효소로 플라스미드 라이브러리를 절단하여 제한 효소 소화를 수행합니다. 분리된 플라스미드 DNA의 품질과 양을 확인하기 위해 분석용 아가로스 겔 전기영동을 실시합니다. 플라스미드가 확인되면, 폴 플라스미드는 선형화하지만 표적 플라스미드는 절단하지 않는 제한 효소로 라이브러리 1 µg을 소화시킵니다.제한효소 절단이 완료되면, DNA 정제 키트를 사용하여 라이브러리를 정제합니다. 마지막으로, 정제된 라이브러리를 판독 균주(readout strain)에 형질전환하여 돌연변이의 특성을 분석합니다. 구배(gradient) 준비를 시작하려면, 정사각형 페트리 접시 바닥의 한쪽 가장자리에 10개의 레인을 일정한 간격으로 표시합니다.디시의 아래쪽 표시된 가장자리가 7 mm 높아지도록 경사지게 배치합니다. 적절한 농도의 선택제를 잘 혼합한 따뜻한 lb agar 25 mL를 경사 디시에 붓습니다. 이것이 구배의 하단 층이 됩니다.LB agar가 페트리 접시를 코팅하여, 접시의 높게 표시된 끝부분에는 약 1 mm의 LB agar가 담기고 낮은 부분에는 약 8 mm가 담기도록 합니다. 환기를 위해 뚜껑 KU로 플레이트를 덮고 agar가 굳을 때까지 10 내지 15분 동안 둡니다. LB agar 하층이 굳으면 접시를 평평한 표면으로 옮깁니다.다음으로, 선택제를 포함하지 않은 따뜻한 lb agar 25 milliliters를 부어 첫 번째 agri 표면을 덮고, 하단 층 전체가 완전히 덮이도록 합니다. 통풍을 위해 플레이트를 뚜껑 KU로 덮은 후, 박테리아의 스탬프 전이가 이루어질 수 있도록 agri를 10~15분 동안 굳힙니다. 먼저, readout strain의 박테리아 배양액을 확보하고, 600 nanometers에서의 광학 밀도가 1.0 미만이 되도록 희석하여 동일한 세포 밀도를 갖게 합니다.다음으로, 42 °C로 평형을 맞춘 액체 소프트 아가 2 mL를 100 mm 원형 페트리 접시 바닥에 옮기고, 박테리아 배양액 40 µL를 소프트 아가에 피펫팅한 후 플레이트를 흔들어 섞습니다. 유리 현미경 슬라이드의 긴 모서리에 소프트 아가 혼합물을 도포합니다. 그다음, 슬라이드의 도포된 모서리를 그라디언트 접시 바닥의 표시선에 맞춥니다.슬라이드를 한천 표면에 살짝 접촉시킵니다. 부드러운 한천 띠가 그래디언트 표면으로 옮겨가도록 가볍게 접촉하는 것만으로 충분합니다. 이후 슬라이드는 세척하여 재사용하기 위해 따로 둡니다.이 과정을 반복합니다. 남은 샘플과 실험 대조군을 각 그라디언트 디쉬에 포함시켜야 합니다. 여러 개의 그라디언트를 수행하는 경우, 그라디언트 디쉬를 뒤집어 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 시간과 온도는 판독에 사용되는 박테리아 균주에 따라 다를 수 있으나, 일반적으로 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하면 가시적인 성장이 나타나기에 충분합니다.마지막으로, 서면 프로토콜에 설명된 대로 세포 성장을 이미징하고 분석합니다. 여기 P-G-F-U-V 비변이체 또는 4라운드의 돌연변이 유발 과정을 거친 PG FPUV 돌연변이 라이브러리를 형질전환한 리드아웃 균주의 이미지가 제시되어 있습니다. 어둡거나 흐릿한 콜로니는 GFP 불활성 돌연변이가 포함된 플라스미드를 나타냅니다.이 그림은 100 base pair 간격으로 타겟 플라스미드의 중립 서열 전체에 걸쳐 나타난 돌연변이 빈도를 나타냅니다. 돌연변이는 플라스미드 서열 전체에서 발생하지만, 복제 기점(origin of replication)에 가장 가까운 곳에서 가장 높은 빈도로 발생함에 유의하십시오. 여기에서는 약물 농도 구배에 따른 돌연변이체의 성장이 표시되어 있습니다.구배의 상단을 향해 성장한 거리는 돌연변이체들 사이의 차별적인 약물 내성 프로파일을 나타냅니다. 본 예시에서는 약물 선택 구배를 사용하여 메틸 메탄 설포네이트에 대한 내성이 증가한 돌연변이체를 찾기 위해 인간 산화적 탈메틸화 효소 ABH two의 플라스미드 라이브러리를 스크리닝하였습니다. 돌연변이 유발 프로토콜을 2회 및 4회 반복하여 생성된 이러한 라이브러리를 모체 야생형 및 공벡터와 비교하여 보여줍니다.흰색 선은 개별 돌연변이 콜로니를 분리한 임계값을 나타냅니다. 추가적인 표현형 분석을 위해, 이전에 low fidelity P one mutagenesis 및 astri 및 m 선택법을 사용하여 식별된 beta-lactamase 돌연변이체인 R 1 64 H 및 E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R을 0.4 µg/mL 및 4 µg/mL Cefotaxime 농도 구배에서 보여줍니다. cefotaxime에 대한 보호 효과는 extended spectrum beta-lactamase 활성을 나타냅니다.야생형 베타-락타마제(beta-lactamase) 효소는 공벡터(empty vector)를 발현하는 세포와 비교했을 때 아무런 보호 효과를 제공하지 않는다는 점에 유의하십시오. 따라서 이러한 돌연변이체들은 적응 또는 새로운 생화학적 활성의 진화를 나타냅니다. 본 연구에서는 이러한 새로운 생화학적 활성을 생성하기 위해 돌연변이 유발과 기능적 선택을 결합한 강력한 방법을 제시하였습니다.기능적 선택은 약물 선택 또는 유전적 상보성을 통해 얻을 수 있으며, 이는 방대한 유전적 다양성을 생성할 수 있는 능력을 활용하는 것입니다. 기존 단백질 활성을 최적화하거나 부위 특이적 발병 기전을 연구하기 위해서는 발병 기전이 특정 서열로 제한되어야 할 수도 있습니다. 이러한 작업은 클로닝을 통해 쉽게 수행할 수 있습니다.또한, 시그니처 공격(signature attack) 또는 돌연변이 풋프린트(mutational footprint)를 얻기 위해 돌연변이 유발을 기능적 선택 과정과 분리하여 수행할 수 있습니다.

mutagenesis-functional-selection-protocols-for-directed-evolution

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

체계적인 대규모 합성 유전자 (유전자 유전자 또는 epistasis) 상호 작용 화면은 유전 이중화 및 경로 간 대화를 탐험하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 높은 처리량 정량 합성 유전자 배열 검사 기술을 설명, eSGA 우리는 epistatic 관계를 elucidating과의 유전 적 상호 작용 네트워크를 탐험하기 위해 개발이...

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

thermostability 공학 분야에 해당 소설 감독 진화 방법은 bacteriolytic 효소 용으로 개발하고 결과적으로 확인되었습니다. 고온의 부화 후 야생 형 단백질에 비해 무작위 mutagenesis의 한 라운드, 발전 bacteriolytic 효소, PlyC 29C3는 두 번 잔류 활동보다 더 큰 표시 한 후.

내열 Bacteriolytic 효소의 감독 진화에 대한 새로운 검사 방법

단백질 동시 발현은 단백질 복합체의 in vitro 재구성에 대한 강력한 대안이며 in vivo에서 생화학 및 유전자 검사를 수행하는 데 도움이 됩니다. 여기에서 우리는 단백질 복합체를 얻고 세포의 돌연변이 빈도를 조정하기 위해 대장균에서 단백질 공동 발현을 사용하는 것에 대해 보고합니다.

단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

우리는 높은 처리량 시퀀싱을 이용하여 단백질의 종합적인 단일 사이트 포화 돌연변이 라이브러리의 기능 평가를위한 프로토콜을 제시한다. 중요한 것은,이 방법은 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 다중화하는 직교 프라이머 쌍을 사용한다. 암피실린의 임상 적 투여 량에서 선택 TEM-1 β-lactamase를를 사용하는 대표적인 결과가 제공된다.

높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

사이트 지시 된 mutagenesis deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 돌연변이 소개 하는 기술 이다. 이 프로토콜 사이트 감독 mutagenesis 2 스텝을 수행 하는 방법을 설명 하 고 3 단계 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 접근, 관심의 모든 DNA 조각에 적용 됩니다.

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

이 원고의 목표는 RING 형 E3 유비퀴틴 리가제의 포괄적 인 생화학 및 기능 적 연구에 대한 개요를 제시하는 것입니다. 상세한 프로토콜을 갖춘 이 다단계 파이프라인은 테스트된 단백질의 효소 활성을 검증하고 활성을 작동하도록 연결하는 방법을 보여줍니다.

시험관 내 링 타입 E3 유비퀴틴 리가제의 기능적 특성화

새로운 서열 특이성을 가진 제한 endonucleases는 부분적으로 퇴화한 서열을 인식하는 효소로부터 개발될 수 있다. 여기에서 우리는 우리가 성공적으로 NlaIV 효소의 순서 특이성을 바꾸기 위하여 이용된 상세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜의 주요 성분은 전사/번역 반응의 생체외 구획화 및 새로운 서열 특이성을 가진 변이체의 선택이다.

더 엄격한 특이성을 가진 제한 endonuclease의 시험관 진화

전체 plasmids의 사이트 이동 돌연변이 유발은 원래 플라스미드의 약간 다른 유사 콘텐츠를 작성하는 간단한 방법입니다. 여기서 우리는 플라스미드를 사용 표준 시약에 기본 재료를 소개하는 쉽고 비용 효과적인 방법을 보여줍니다.

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

학습하세요 E. coli에서 무작위 돌연변이 라이브러리 생성 및 기능 선택을 통한 단백질 지도 진화 방법. 이 프로토콜은 산업 및 생의학적 목적을 위한 새로운 효소 활성 개발에 활용됩니다.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균

더 많은 동영상 탐색