에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균

이 절차의 전반적인 목표는 주어진 표적 DNA 염기서열에 대한 무작위 돌연변이 라이브러리를 생성하고 반정량적 기능 선택을 사용하여 돌연변이를 신속하게 식별하고 특성화하는 것입니다. 이는 먼저 플라스미드를 대장균으로 형질전환시킴으로써 달성되며, 이는 타겟 염기서열을 포함하는 복제의 한 기원을 돌연변이 균주로 전환함으로써 이루어집니다. 세포를 하룻밤 동안 도금하고 배양한 후, 세포를 수확하고 표적 플라스미드를 분리하여 돌연변이 라이브러리를 얻고, 돌연변이 라이브러리를 판독 균주로 변환하여 프로토콜의 두 번째 부분에서 돌연변이를 특성화하고, 구배 성장 플레이트를 구성하고 판독 균주의 박테리아 배양물을 부드러운 에어를 포함하는 별도의 페트리 접시에 로드합니다.

절차의 마지막 단계는 이러한 박테리아 배양물을 그래디언트로 스탬핑하여 옮기는 것입니다. 궁극적으로, 약물 구배(drug gradient)에서 성장의 차이를 통해 주어진 표적 염기서열의 표현형 프로파일의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 비디오는 대장균에서 단백질의 지시 진화 방법을 제시합니다.

이 과정은 무작위 영양소 라이브러리의 생성에서 자연적인 진화를 모방한 다음 그 다양성을 제한하는 선택이 뒤따릅니다. 따라서 산업 또는 생물 의학 목적을 위해 새로운 생화학 활동을 생성하는 능력을 향상시킵니다. 이 절차에는 무작위 돌연변이 라이브러리의 생성과 이 절차를 보여주는 기능 돌연변이의 이득을 얻기 위한 기능 선택의 두 가지 구성 요소가 있습니다.

이 프로토콜이 시작되기 전에 DNA 중합효소 1 또는 저충실도 극의 저충실도 변이체를 발현하는 전기 유능한 JS 200 세포를 생각했으며, 서면 프로토콜에 설명된 대로 미리 준비된 극, 이러한 세포는 저충실도 극 1 활성이 섭씨 37도를 우세하도록 극 1의 온도에 민감한 대립유전자를 포함합니다. 건설하다. 대장균을 포함하는 표적 플라스미드, 복제 기원에 인접한 클로닝된 표적 염기서열과 함께 하나의 복제 기원, 저충실도 극 1은 대장균을 시작하고, 하나의 플라스미드 복제. 따라서 돌연변이 유발을 시작하기 위해 돌연변이를 도입합니다.

40마이크로리터의 전기 역량 세포와 30-250나노그램의 표적 혈장 DNA를 2mm 간격으로 결합합니다. Electroporation 수의사 맥박, 1800 볼트에 전기판에 있는 혼합물. 시간 상수 또는 TC를 확인하여 각 샘플에 대한 균일한 ation 조건을 보장합니다.

이상적으로 TC는 5-6밀리초입니다. 세포 DNA 혼합물을 1ml의 LB 육수에서 섭씨 37도에서 40분 동안 250RPM으로 흔들어 회수하도록 합니다. 적절한 항생제를 함유한 섭씨 37도로 예열된 100mm LV 아그로 페트리 접시를 얻어 두 플라스미드 플레이트에 대해 적절한 희석액으로 회수된 세포를 선택하여 이 예에서 볼 수 있듯이 뚜렷하지만 셀 수 없는 수의 집락으로 정의되는 잔디밭 농도를 얻습니다.

하룻밤 배양 후 LB 육수로 Petri 접시의 박테리아 군체를 수확합니다. 수확된 세포에서 플라스미드, DNA, 생성된 플라스미드를 분리합니다. DNA는 무작위 돌연변이 라이브러리를 구성합니다.

타겟 plasmid와 pole을 모두 선형화하는 restriction enzyme으로 plasmid library를 절단하여 restriction digest를 수행합니다. 하나의 플라스미드는 분리된 플라스미드 DNA에 분석적 aro gel을 실행하여 품질과 수량을 확인합니다. 플라스미드가 검증되면 pole one plasmid를 선형화하지만 타겟 plasmid를 절단하지 않는 제한 효소로 라이브러리의 1μg을 분해합니다.

제한 분해가 완료된 후 DNA 정제 키트를 사용하여 라이브러리를 정리합니다. 마지막으로, clean library를 readout strain으로 변환하여 돌연변이를 특성화합니다. 그라디언트 준비를 시작하려면 정사각형 페트리 접시 바닥의 한쪽 가장자리를 가로질러 균일한 간격으로 10개의 레인을 표시합니다.

바닥으로 표시된 가장자리가 7mm 높아지도록 접시를 비스듬히 놓습니다. 적절한 농도의 선택제와 잘 혼합된 따뜻한 lb 한천 25ml를 인클라인 접시에 붓습니다. 이것은 그라디언트의 맨 아래 레이어입니다.

접시의 높이 표시된 끝 부분에 약 1mm의 LB 한천이 포함되고 내려간 부분에 약 8mm가 포함되도록 LB 한천이 페트리 접시를 코팅하는지 확인하십시오. 환기를 위해 뚜껑 KU로 접시를 덮고 농업이 10-15분 동안 굳도록 합니다. LB 한천의 바닥층이 굳은 후 접시를 평평한 표면으로 옮깁니다.

다음으로, 선택제 없이 25ml의 따뜻한 lb 한천을 부어 첫 번째 농업 표면을 오버레이하고 전체 바닥 층을 덮도록 합니다. 환기를 위해 뚜껑 KU로 플레이트를 덮은 다음 농업이 10-15 분 동안 굳어지도록 하여 박테리아의 스탬프 전달을 수행합니다. 먼저, 판독 균주의 박테리아 배양액을 얻어 600나노미터에서 1.0 미만의 광학 밀도로 동일한 세포 밀도를 갖도록 희석합니다.

다음으로, 섭씨 42도로 평형을 이룬 2밀리리터의 액체 연질 한천을 100mm 원형 페트리 접시의 바닥으로 옮기고, 박테리아 배양액 40마이크로리터를 더 부드러운 접시에 피펫팅한 다음 플레이트를 흔들어 혼합합니다. 유리 현미경 슬라이드의 긴 가장자리를 더 부드러운 혼합물로 코팅합니다. 그런 다음 슬라이드의 코팅된 가장자리를 그라디언트 접시의 하단 표시에 맞춥니다.

슬라이드를 한천 표면에 터치합니다. 부드러운 촉감은 부드러운 한천의 리본을 그라디언트 표면으로 옮기기에 충분합니다. 그런 다음 슬라이드를 청소하고 재사용하기 위해 따로 보관합니다.

이 과정을 반복합니다. 나머지 샘플, 실험 대조군은 각 그라디언트 접시에 포함되어야 합니다. 여러 그래디언트를 실행하는 경우 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 그라디언트 접시를 위에서 아래로 배양하고 배양 온도는 판독 박테리아 균주에 따라 다를 수 있지만 일반적으로 섭씨 37도에서 밤새 배양하면 눈에 띄는 성장에 충분합니다.

마지막으로, 서면 프로토콜에 설명된 대로 세포 성장을 이미지화하고 분석합니다. 표시. 다음은 unmuted ized P-G-F-U-V 또는 PG FPUV 돌연변이 라이브러리로 변환된 판독 균주의 이미지입니다. 4차례의 돌연변이 유발 어둡거나 어두운 콜로니는 GFP 불활성화 돌연변이를 포함하는 플라스미드를 나타냅니다.

이 그림은 100 염기쌍 간격으로 타겟 플라스미드의 중성 염기서열 전반에 걸친 돌연변이의 빈도를 나타냅니다. 돌연변이는 전체 플라스미드 염기서열에서 발생하지만, 복제의 기원에 가장 가까운 가장 높은 빈도에서 발생합니다. 여기서, 돌연변이의 성장은 약물 구배에 대해 표시됩니다.

구배의 상단을 향해 성장한 거리는 돌연변이 간의 차등 약물 내성 프로파일을 나타냅니다. 이 예시에서, human oxidative demethylase ABH two의 플라스미드 라이브러리는 약물 선택 구배를 사용하여 메틸 메탄 설포네이트에 대한 내성이 증가한 돌연변이에 대해 스크리닝되었습니다. 2. mutagenesis 프로토콜의 2회 및 4회 반복을 나타내는 이러한 라이브러리는 parent wild type 및 empty vector와 비교하여 표시됩니다.

흰색 선은 개별 돌연변이 군체가 고립된 임계값을 나타냅니다. 추가 표현형 분석을 위해 낮은 충실도의 P one 돌연변이 유발 및 astri 및 m selection을 사용하여 이전에 확인된 베타-락타마제 돌연변이, R1 64 H 및 E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R은 밀리리터당 0.4 마이크로그램 및 밀리리터당 4 마이크로그램에 표시됩니다. cefotaxime에 대한 Cefotaxime 구배 보호는 확장된 스펙트럼 베타-락타마제 활성을 나타냅니다.

야생형 베타-락타마제 효소는 빈 벡터를 발현하는 세포에 비해 보호를 제공하지 않습니다. 따라서 이러한 돌연변이는 새로운 생화학 활동의 적응 또는 진화를 나타냅니다. 여기에서 우리는 이 세대의 새로운 생화학 활동을 위한 돌연변이 유발과 기능 선택의 강력한 조합을 제시했습니다.

기능적 선택은 약물 선택 또는 유전적 보완을 통해 얻을 수 있으며, 이는 큰 유전적 다양성을 생성할 수 있는 우리의 능력을 활용합니다. 발병기전은 기존 단백질 활성을 최적화하기 위해 또는 부위 지시 발병기전을 위해 주어진 서열로 제한되어야 할 수 있습니다. 이는 복제를 통해 쉽게 수행할 수 있습니다.

또한, 돌연변이 유발은 시그니처 공격 또는 돌연변이 발자국을 얻기 위해 기능적 선택에서 분리될 수 있습니다.