Name: 더 엄격한 특이성을 가진 제한 endonuclease의 시험관 진화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 학습하세요 시험관 내 구획화와 지향적 진화를 이용하여 더 엄격한 서열 특이성을 가진 제한 효소를 개발하는 방법을. 이 프로토콜은 다양한 제한 효소에 적용 가능하며 효소 공학 연구에 활용됩니다.

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<li>Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+variants+of+the+restriction+endonuclease+EcoRV+that+depend+in+their+cleavage+activity+on+the+flexibility+of+sequences+flanking+the+recognition+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site.</a> Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).</li>
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<li>Czapinska, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+and+Directed+Evolution+of+Specificity+of+NlaIV+Restriction+Endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).</li>
<li>Miller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+by+in+vitro+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution by in vitro compartmentalization.</a> Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).</li>
<li>Zheng, Y., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+restriction+endonucleases+using+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Selection of restriction endonucleases using artificial cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), e83(2007).</li>
<li>Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesign+of+extensive+protein-DNA+interfaces+of+meganucleases+using+iterative+cycles+of+in+vitro+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기서 설명된 선택 프로토콜은 NlaIV8,중앙 NN 염기를 가진 팔린드로믹 표적 부위를 인식하고 NN 염기 들 사이의 무딘 단부 절단을 촉매하는 디메릭 PD-(D/E)XK 접힌 인식 서열에 대해 시험되었다. NlaIV는 NN 기지 사이 분열이 이 기지가 복합체에 있는 단백질에 가깝다는 것을 건의하기 때문에 선택되었습니다. 원칙적으로, 프로토콜은 임의의 배그룹 중 임의의 임의의 계열 특이적 제한 엔도누클리스, 단일머티즘 또는 디메릭, 촉매 및 특이성 도메인이 일치하는지 여부(NlaIV 예에서와 같이) 또는 별도의(예를 들어, FokI)에 관계없이 임의의 스태거의 이중 가닥 브레이크를 촉매하는 임의의 서열에 사용될 수 있다. 더욱이, 원칙적으로 프로토콜은 새롭고 더 좁은 효소 특이성의 생성뿐만 아니라, 스타 활동을 제거하거나 높은 충실도 endonucleases를 만드는 데 사용될 수 있습니다. 그러나 이 모든 것은 아직 테스트되지 않았습니다. 특히, 스타 활성의 표적 제거는 동일한 아미노산 잔기가 원하는 및 바람직하지 않은 염기와 결합하는 데 관여할 수 있기 때문에 복잡할 수 있다. 이 프로토콜에 기술된 시험관내 단계는 좁아진 특이성의 선택에 한정되지 않고 달리 변경된 특이성을 선택하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 변이체 endonucleases에 문제가 있습니다: 기판의 스펙트럼이 부모 endonuclease에 의해 절제되지 않은 새로운 표적을 포함하는 경우에, 일반적으로 이 활동의 유해한 효력에서 세포를 보호하는 좋은 방법은 없습니다. 대조적으로, endonuclease 특이성이 단지 좁혀지면, 표적은 야생형 표적의 서브세트이고, 따라서 이미 이용 가능한 코그네이트 메틸트랜스퍼라제는 완전히 보호되어야 한다.
우리의 프로토콜은 여러 가지 지향 진화 프로토콜에서 여러 가지 면에서 다릅니다. 개방형 판독 프레임 다양성은 모든 반복이 아니라 실험 시작 시 한 번 생성됩니다. 또한, 그것은 분할 및 혼합 합성에 의해 생성, 보다는 EP-PCR에 의해. 이 작업에서 사용되는 바와 같이, 코돈의 NNS 치환의 경우, 6개의6 위치에 대해 (4 x 4 x 2) 6~1.07 x 109조합이 있다. 따라서, 임의의 주어진 변이체는 ESC의 1.7 fmoles에서 평균적으로 한 번 존재한다. 이 용량은 Glen Research에서 제공하는 20개의 삼중뉴클레오티드 전구체의 혼합물과 합성을 사용하거나 분할 및 혼합 올리고뉴클레오티드 합성을 가진 덜 유망한 위치에서 돌연변이 빈도를 감소시킴으로써 7개의 위치로 증가될 수 있습니다. 가능하면 변형 범위를 6위치로 제한하는 것이 좋습니다. 명백하게, 이러한 돌연변이 유발 표적화는 기질 결합에 관여하는 REase의 적어도 영역에 대한 일부 기존 지식을 필요로 한다. 다양성을 생성하는 분할 및 혼합 프로토콜은 EP-PCR에 비해 분명한 장점이 있습니다. EP-PCR을 사용하여, 우리는 동일한 EP-PCR에서 NlaIV ESC에 대한 8개의 치환을 운반하는 변경되지 않은 변이체 및 시퀀스를얻었다(표 4). EP-PCR의 라이브러리는 피해야 할 클론의 실질적인 분획을 포함합니다(야생 형 서열, 다중 치환, 프레임 시프트 및 넌센스 돌연변이, 및 서열 특이성에 영향을 미치지 않는 장소에서의 돌연변이).
또한 당사의 프로토콜은 두 가지 순차적 선택 단계가 있음에 따라 다른 많은 지향 진화 프로토콜과도 다릅니다. 양수 선택은 원하는 활성이 유지되고, 그렇지 않으면 비오틴 태그가 제거되지 않고, 코딩 시퀀스를 풀다운하여 제거할 수 있는지 확인합니다. 기술적으로 는 소설, 비 중첩 특이성 (예를 들어, GCATGC)의 운이 출현은 적절한 분열 부위가 원하는 분열 근처에 존재하는 경우, 뿐만 아니라 비오틴 태그의 절단으로 이어질 수 있지만, 다른 곳에서는. 그러나, 이것은 매우 가능성이 있을 것 이라고. 음수 선택은 여전히 바람직하지 않은 활성이 있는 효소에 대해 코딩하는 열린 판독 프레임을 제거합니다. 프로토콜은 선택 시퀀스를 절단할 수 있지만 ESC의 다른 곳에서는 절단할 수 없는 변형으로 출력 라이브러리를 보강하므로 PCR 증폭에 적합하지 않기 때문에 이 단계는 엄격하게 필수가 아닙니다. 그러나, 원래 서열 특이성을 가진 효소가 출력에서 제거되지 않고 변경된 특이성을 가진 유망한 변이체를 능가할 것이기 때문에 선택 효과는 더 낮을 것으로 예상되며 또한 효소 활성이 감소할 것이다. 채우기 수준에서 원하는 대상 시퀀스와 원하지 않는 대상 시퀀스는 모두 퇴화될 수 있지만 그렇지 않을 수도 있습니다. NlaIV 예에서, 안티-타겟은 퇴화되고 표적은 퇴화되었다. 인구 수준에서 퇴화가 있더라도, 단일 액적에서 단 하나의 (비퇴화) 표적 또는 반표적이 존재한다. 프로토콜에서 대상 및 안티 대상 시퀀스는 선택 단계의 모든 반복에서 다시 도입됩니다. 따라서 개방 된 판독 프레임은 가능한 모든 대상을 갈라 놓을 수있는 효소를 인코딩해야하며, 여러 선택 라운드에서 살아남기 위해 항 표적 중 어느 것을 갈라 놓을 수 없습니다. 프로토콜의 각 반복에서 선택 취소 대상을 다시 도입해야 할 필요성은 두 개의 순차적 PcR을 적용합니다. 제1 PCR은 안티-타겟 외부의 어닐리마를 사용하는 프라이머를 사용하므로, 반대로 표적의 분열이 PCR 반응을 방지한다. 두 번째 PCR은 안티 타겟을 넘어 도달 프라이머를 필요로하고, 안티 대상을 다시 도입, 선택의 여러 라운드 동안 있는지 확인하기 위해, 각 열린 독서 프레임은 안티 대상의 모든 변종에 대해 테스트됩니다.
끈적끈적한 말단을 생성하는 효소의 경우, REase ORF10의 분리를 위한 앞에서 설명한 방법에 기초한 관련 대체 프로토콜이 사용될 수 있다. 실험에서 사용되는 비오틴 포획에 의한 비활성 변이체의 고갈은 선택적 PCR에서 프라이머 결합 부위로 사용되는 서열과 호환어댑터의 결찰에 의해 대체되는 프로토콜로 대체된다(도9). 선택된 특이성을 가진 효소를 생성하는 ESC만이 결찰 가능 말단을 생성하고 따라서 선택될 것이다. 카운터 e선택 시퀀스의 끈적끈적한 말단의 시퀀스는 어댑터와 결찰에 참여할 수 없는 방식으로 설계되어야 한다. 선택 프로세스의 반복은 선택적 PCR에서 두 개의 서로 다른 어댑터와 결과적으로 두 개의 서로 다른 역프라이머 사이를 전환하여 쉽게 달성할 수 있습니다.
새로운 프로토콜이 있더라도 시험관 내 새로운 특이성을 엔지니어링하는 작업은 여전히 매우 까다롭습니다. 전형적인 타입 II REases를 위해, 서열 특이성 및 내분핵용해 활성은 동일한 단백질 지구에 의존한다. 따라서 다른 하나에 영향을 주지 않고 하나를 변경하기가 어렵습니다. 성공은 효소의 발자국을 고려하고, 단백질-DNA 상호 작용의 대칭을 존중하며, NlaIV 예8에서와 같이 생화학 실험에서 선행으로 결정되어야 하는 기존의 효소 선호도를 기반으로 하는 전략에 의해 더 가능성이 높아집니다.

시퀀스 특이성 엔지니어링은 클래스 II REases에 매우 까다롭습니다. endonucleases의이 클래스에서, 서열 인식 및 촉매는 밀접하게 얽혀, 가장 아마 그것의 동체 메틸 트랜스퍼 라제보다 더 넓은 특이성의 엔도누글레스의 생성에 대한 진화적 보호로, 이는 호스트 DNA를 손상시킬 것이다. 세포에 있는 새로운 특이성의 지시된 진화는 새로 설계된 endonuclease 활동에 대하여 호스트 DNA를 보호하는 필요에 의해 더 복잡합니다. 따라서 REase 엔지니어링의 몇 가지 성공적인 시도가보고되고 그들 모두는 특정 효소1,2,,3,3,4,,5,,6,,7의독특한 특징을 이용한다.
여기에서 우리는 NlaIV endonuclease8의우리의 성공적인 공학에 근거를 둔 부모 효소 보다는 더 좁은 특이성을 가진 endonuclease 이체를 생성하는 것을 이용될 수 있는 특이성 공학을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 임의 인식 서열을 가진 임의의 효소의 경우, 측면에 있는 염기들을 위해 추가 특이성을 도입할 수 있다. 부분적으로 퇴화된 서열을 인식하는 부모 효소(예: GGNNCC 표적을 가진 NlaIV)의 경우, 추가특이성은 또한 인식 서열 내에서 도입될 수 있다. 추가 특이성은 가능성이 단백질 DNA 접촉을 요구할 것이기 때문에, 새로 인식된 기지는 DNA에 부모 endonuclease의 발자국 안에 놓여야 합니다. 원칙적으로, 선택 방식은 인식 시퀀스의 임의의 원하는 전문화에 대해 설정될 수 있다. 그러나, 팔린드로믹 및 거의 팔린드로믹 표적 서열을 인식하는 대부분의 REases는 팔린드롬의 반부위만을 인식하는 기능적 이량체이다. 그러므로, 단백질 핵 상호 작용의 대칭을 위반하는 새로운 특이성의 선택은 작동하기 위하여 확률이 낮습니다. 디메릭 NlaIV의 경우, 예를 들어, GGNNCC 서열은 이론적으로 GGATCC로 좁힐 수 있지만 GGAACC로의 특이성을 좁히는 것은 더 어려울 것으로 예상된다. 우리의 계획은 긍정적이고 부정적인 선택을 모두 포함한다.
이 공정은 음의 선택이 바람직한 좁은 특이성 이외의 모든 서열을 분리할 수 있는 특이성을 제거하는 데 사용될 때 더욱 효율적입니다. 예를 들어 GGATCC에 대한 선택은 GGBVCC에 대한 선택 방지와 결합될 수 있습니다(B는 A 이외의 베이스이고 V는 T 이외의 베이스입니다). 가능한 대상 서열 중 일부가 다루지 않는 경우 선택 실험의 결과는 양수 및 음수 선택의 효과에 따라 달라집니다. NlaIV 작업에서 GGATCC및 GGSSCC(S가 G 또는 C인 경우)를 대상으로 선택하고 대칭 파괴 대상을 무시하고 GGWWCC(W가 A 또는 T인 경우)로 설명할 수 있는 특이성을 얻었으며, 이 경우 부정적인 선택이 더 많다는 것을 시사합니다. 긍정적 인 선택보다 중요합니다.
우리의 접근 방식은 식 선택 카세트 (ESC)의 생성으로 시작됩니다. ESC는 섹션으로 구성됩니다. 내부 코어 섹션에는 T7 프로모터 제어 하에 REase의 개방 판독 프레임(ORF)의 변이체가 있습니다. ESC의 이 핵심 섹션에는 엔지니어링된 REase에 대한 코그네이트 사이트가 포함되어 있지 않습니다. 코어는 야생형 REase에 대한 두 개의 동조 부위 사이에 끼어있다: 바람직하지 않은S활성을 위한 절단 부위(이 예에서 선택된 시퀀스, GGSCC)와 원하는 활성을 위한 절단 부위(예에서 선택된 시퀀스, GGATCC). PCR에서 ESC의 제조의 최종 단계는 5' 말단에서 원하는 활성에 가까운 비오틴을 추가하고 다양한 카운터 선택 서열을 생성한다(예에서 GGSSCC). 선택 전략은 시험관 내 전사/번역/선택프로토콜(그림 1A)을사용한 후 ESC 재증폭 프로토콜에서 신중하게 설계된 프라이머의 사용에 의존한다. ESC 라이브러리는 체외 구획화된 전사 번역 물-인-오일 에멀젼99,10,,11로표현된다. 각 액적 내에서, 발현된 효소의 특이성은 ESC의 상태에 영향을미친다(도 1B,단계 I). 기재된 배열을 위해, 번역된 단백질의 바람직한 절단 활성은 DNA의 비오틴 태그를 제거하지만, 카운터 선택서열로 다른 ESC 말단에 영향을 미치지 않는다. 에멀젼이 파손되면, 생체 티니글리드 단편은 스트렙타비딘 친화도 풀다운에 의해 제거되어 원하는 활성을 가진 액적으로부터의 단편만 남아 있게된다(그림 1B,단계 II). 이 단계는 비활성 REase 변형을 제거합니다. 풀다운 단계의 상급 분획은 PCR에 의해 증폭됩니다. 제1 PCR 반응 프라이머F2 및 R1이 사용된다(도1A, B,단계 III). 프라이머 F2는 카운터 선택서열과 분자 말단 사이의 ESC 섹션에 결합한다. 따라서, 카운터 선택 서열을 절단할 수 있는 변이체를 발현하는 ESCs(따라서, 프라이머 F2 및 R1에 대한 결합 부위를 두 개의 상이한 DNA 분자로 분리)는 증폭되지 않고 따라서 라이브러리로부터 제거된다. 프라이머 R1은 선택된 부위와 ESC의 코어 사이에 결합하여 선택된 부위의 절단 상태에 영향을 받지 않도록 하고 원하는 활성(GGATCC)에 대한 절단 부위를 복원한다. 사이클은 선택된 부위에 가까운 5' 끝에 비오틴을 추가하고 ESC의 반대쪽 끝에 가까운 카운터 선택 부위에서 설계 변형을 복원하는 제2 PCR(프라이머 F1 및 R2)에 의해 폐쇄된다(그림1B,단계 IV). 생성된 DNA 혼합물은 또 다른 선택을 위해 준비됩니다.
선택 프로토콜의 성공은 새롭고 더 엄격한 표적 인식 시퀀스의 적절한 선택과 돌연변이 유발 전략및 효과적인 구현의 신중한 설계에 크게 좌우됩니다. REase를 극복하는 것보다 REase의 기존 환경 설정을 약간 개선하는 것이 훨씬 쉽기 때문에 기존의 환경 설정에 대한 역학 연구로 시작하는 것이 좋습니다. 신중한 돌연변이 생성 설계의 필요성은 제시된 프로토콜에 의해 처리될 수 있는 돌연변이 라이브러리의9 제한된 크기로부터 발생한다(단일 실험에서 109클론). 따라서 모든 20 개의 가능한 아미노산 치환은 몇 가지 위치에서효과적으로 테스트 할 수 있습니다 (토론 참조). 대안으로 제시된 오류가 발생하기 쉬운 PCR(EP-PCR)과 같은 무작위 돌연변이 발생은 기존 복잡성의 심오한 하소 샘플링으로 이어질 것입니다. DNA와의 접촉에 관여하는 잠재적 아미노산 위치(또는 코그네이트 서열에서 퇴화된 뉴클레오티드에 근접한 위치)에 관한 정보가 있는 경우, 올리고뉴클레오티드 유도 포화 돌연변이 발생에 대한 몇 가지 아미노산을 선택하는 데 확실히 사용되어야 합니다(프로토콜 단계 1.6-3.10).

<table><tbody><tr><td>1000&어링; CPG 지원 (dA, dT, dC, dG)</td><td>Biosset</td><td>45-1000-050</td><td>다른 공급업체도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>ASM-800 DNA/RNA</td><td>Biosset</td><td>800-001-000</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Gel Extraction Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td>다른 모든 키트도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Glen-Pak DNA 정제 카트리지</td><td>Glen Research</td><td>60-5200</td><td></td></tr><tr><td>HIS-Select Nickel Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>P6611</td><td></td></tr><tr><td>pET 28a 벡터</td><td></td><td></td>: <td>플라이클로닝 부위 상류에 T7 프로모터가 있는 다른 벡터를 대신 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td>다른 고충실도 및 고과정성 호열성 polymearse를 대신 사용할 수 있습니다</td></tr>. 다<tr><td>공성 강철 호일</td><td>Biosset</td><td>40-063</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Translation System RTS 100, E.coli HY Kit</td><td>Roche</td><td>3 186 148</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucleases</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> 당<td>연히 다른 공급업체, 효소를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Streptavidin Magnetic Beads</td><td>New England Biolabs</td><td>S1420S</td><td>다른 공급업체도 사용할 수 있습니다. 우리는 인산을 포함한 Sigma Synthesis 화학 물질에서 긍정적으로 테스트된 베드를 보유하고</td></tr> 있습니다. <tr><td></td><td>Carl Roth</td><td></td><td>다른 공급업체도 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>합성 컬럼(다양한 크기)</td><td>Biosset</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td>다른 리가제를 사용할 수 있습니다</td></tr></tbody></table>.

더 엄격한 특이성을 가진 제한 endonuclease의 시험관 진화

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

제한 엔도너첼리스(REase) 특이성 엔지니어링은 매우 어렵습니다. 여기에서 우리는 부모 효소 보다는 더 엄격한 특이성을 가진 REase 이체를 생성하는 것을 돕는 다단계 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 DNA 결합에 영향을 미칠 가능성이 있는 위치의 가변성을 가진 이상적으로 REase의 변이체에 대한 발현 선택 카세트(ESC)의 라이브러리를 생성해야 합니다. ESC는 바람직한 제한 부위 활성 및 비오틴 태그에 대한 서열에 의해 한쪽에 측면되고, 다른 쪽에는 바람직하지 않은 활성 및 프라이머 어닐링 부위에 대한 제한 부위에 의해 서열이 있다. ESCs는 액적 당 하나 이상의 DNA 분자의 존재를 가능성 있게 하는 조건에서 물-인-오일 에멀젼으로 전사되고 번역됩니다. 따라서, 각 카세트 분자의 DNA는 번역된, 인코딩된 효소의 활성에만 적용된다. 원하는 특이성의 REase 변이체는 프라이머 어닐링 부위가 아닌 비오틴 태그를 제거한다. 에멀젼을 파괴 한 후 DNA 분자는 비오틴 풀다운을 받게되며 상류에 있는 분자만 유지됩니다. 이 단계에서는 원하는 활성을 잃지 않은 변형에 대한 ESC만 유지됩니다. 이 DNA 분자는 그 때 첫번째 PCR 반응을 복종됩니다. 바람직하지 않은 시퀀스에서의 절단은 프라이머 중 하나에 대한 프라이머 결합 부위를 차단한다. 따라서 PCR은 원치 않는 활성없이 액적에서 만 ESC를 증폭시다. 제2 PCR 반응은 선택 단계가 반복될 수 있도록 원하는 특이성 및 비오틴 태그에 대한 제한 부위를 재도입하기 위해 수행된다. 선택된 개방 판독 프레임은 또한 부모 REase의 코그네이트 메틸 트랜스퍼라제를 발현하는 세균 세포에서 과발현될 수 있으며, 이는 새로 진화된 REase가 메틸트랜스퍼라제 표적 부위의 서브세트만을 대상으로 하기 때문이다.

이 프로토콜은 두 가지 원치 않는 클래스를 고갈시켜 엔지니어링 된 REase의 원하는 변이체의 빈도를 증가시키는 도구일 뿐입니다: 변하지 않는 야생 형 서열 특이성을 가진 비활성 효소 및 endonucleases. 한편, REase 특이성을 변경하는 것은 매우 어렵기 때문에, 24개의 클론의 단일 스크리닝에서 야생형 효소와 는 다른 분열 패턴을 생성하는 하나의 변이체를 찾는 것이 성공으로 간주되어야 한다. 우리의 손에 최고의 화면은 유망한 변종의 최대 20 %를 식별 할 수 있습니다(그림 8A).
긍정적 인 결과는 라이브러리 품질 (즉, 대체 및 임의 분포의 제한된 빈도) 및 라이브러리 구성원의 생체 생물 집단의 효율적인 캡처 (단계 3.6-3.7)에 크게 의존합니다. 두 가지 문제를 모두 감지할 수 있습니다. 라이브러리 품질은 가능한 한 많은 클론(&gt;15)을 시퀀싱하거나 높은 처리량 시퀀싱을 통해 라이브러리의 직접 시퀀싱을 통해 선택하기 전에 확인해야 합니다(단계 3.10, 표 3). 선택한 클론의 대다수가 활성화되지 않은 경우, 이것은 스트렙타비딘 캡처 선택의 실패의 명확한 표시이다. 이러한 라이브러리는 스트렙타비딘 캡처 선택 단계를 벗어난 비활성 변이체에 의해 대부분 지배되기 때문에 많은 선택 주기를 거치는 라이브러리의 경우 유사한 효과가 관찰됩니다(그림8B). 따라서 모든 선택 주기 후에 스크리닝을 실행하고 선택 반복에 의존하지 않고 수동으로 선택한 유망한 변형을 개발하는 것이 좋습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg"> 도 1: NlaIV 엔지니어링에 기초한 새로운 서열 특이성의 시험관 내 선택. (a)발현/선택 카세트(ESC)의 조직은 REase에 대한 2개의 인식 사이트, 1) 우측 끝에 가까운 선택된 서열(GGATCC)과 2) 카운터 선택서열(GGSSCC)을 왼쪽 끝에 가까운, 뿐만 아니라 T7p 및 T7t-T7 프로모터 및 T7 터미네이터를 포함한다. 프라이머 바인딩 사이트는 다음과 같습니다. 야생 유형및 선택된 NlaIV 변이체에 의한 분열은 각각 빨간색및 녹색 삼각형으로 도시된다. (B)선택 주기 단계: I) 전사-번역-분열 반응의 유화는 ESC 라이브러리와 혼합; II) 모든 생체 활성 DNA는 스트렙타비딘으로 코팅된 자기 입자에 포착되어 제거되어 비활성 변이체를 인코딩하지 않습니다. III) 야생형 활성(즉, GGSSCC 서열을 절단할 수 있는 것)을 가진 REase를 인코딩하는 ESCs는 순방향 및 역방향 프라이머에 대한 결합 부위를 분리하기 때문에 제거된다. 따라서 이러한 ESC의 증폭이 발생하지 않습니다. IV) 다음 선택 라운드에 대한 입력은 오른쪽 끝에 비오틴을 첨가하고 왼쪽 끝에 있는 카운터 선택 서열의 변형을 재도입하여 생성된다. 엘스비어의 허가를 받아 Czapinska 등8에서 전재. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg"> 그림 2: ESC의 준비. T7 프로모터의 제어하에 NlaIV ORF를 포함하는 발현 벡터에서 본래 구문으로부터 유래된 프래그먼트는 발현/선택에 적합하도록 수정되었다. NlaIV ORF로부터의 NlaIV 사이트 다운스트림은 제거되었고 선택된 위치를 돌연변이화하는 데 사용된 고유 사이트(SalI, EcoRI 및 Eco52I)는 NlaIV ORF에서 침묵하는 돌연변이로 도입되었다. 최종 구문은 왼쪽에 있는 카운터 선택 시퀀스(GGSSCC)와 오른쪽에 선택된 시퀀스(GGATCC)의 두 개의 측면 NlaIV 사이트를 도입한 측면 프라이머로 증폭되었습니다. 역프라이머는 또한 비오틴을 도입했다. 돌연변이 된 ECS의 생성에 사용되는 프라이머는 파란색 화살표로 표시되고 아래에 레이블이 지정됩니다 (표 1B, C참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg"> 그림 3: 분할 및 혼합 합성 방식. 이 예는 NNS 서열이 4위치에서 0.8 주파수로 도입된 MutB 프라이머 합성을 참조한다(표 3참조). 화학 합성은 3'에서 5'까지 수행되지만 모든 서열은 정식 5'-3' 방향으로 표시됩니다(즉, 이 방식에서 오른쪽에서 왼쪽으로 진행됨). NNS 돌연변이 성 서열이 빨간색인 동안 돌연변이 위치에서 야생 형 서열은 녹색으로 표시됩니다. 나중에 ESC에서 돌연변이를 소개하는 데 사용되는 SalI 인식 사이트는 밑줄이 그어져 있습니다. 혼합 및 분할 단계(2 및 4)의 점이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg"> 그림 4: 올리고뉴클레오티드 표적 돌연변이 발생에서 독특한 제한 효소 부위의 사용. 돌연변이 도입의 전략은 라이브러리 A-C의 구성의 예에 도시되어 있다(단계 3.1-3.7 참조). 엘스비어의 허가를 받아 Czapinska 등8에서 전재. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg"> 도 5: 체외 전사-번역에서 내핵성 절단. (a)최적의 REase 버퍼에서 시험 기판의 절단: 1) 기판, 단일 NlaIV 인식 사이트를 가진 612 bp PCR 제품; 2) 분열 제품, 355 bp 및 257 bp.(B)체외 전사 번역 반응에서 분열 (ESC의 0.5 μg을 포함): 1-2) 15 μL 기질 없이 시험관 내 전사 번역의 (라인 2: 1.5 mM MgCl2로보충 된 반응); 3-4) 시험기기의 1μg을 가진 시험관내 전사-번역의 15 μL aliquots; (라인 4: 반응 1.5 mM MgCl2로보충). S-DNA 크기 마커 (pBR322 는 MSPI로 소화). 샘플은 6% 네이티브 PAGE에서 해결되었습니다. DNA를 에티듐 브로마이드로 염색시켰다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg"> 그림 6: 선택 주기에서 첫 번째 PCR의 제품입니다. 도 1B,단계 III; 프로토콜 단계 5.10. 열 집합 1과 2는 세 배로 로드된 두 개의 서로 다른 라이브러리의 aliquot입니다. S-DNA 크기 표준 (람다 DNA힌드III 및 EcoRI로 소화). 화살표는 전체 길이 ESC(1,050bp)의 위치를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg"> 도 7: 미니 스케일에서 추가 스크리닝을 위해 정제된 NlaIV 변이체. 6.3.11 단계를 참조하십시오. 각 줄에는 다른 변이체의 10 μL aliquot가 포함되어 있습니다. S-단백질 분자량 표준. NaIV REase 소단위의 분자 질량은 29.9 kDa입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg"> 도 8: 서열 특이성 변경을 위한 NlaIV 변이체의 스크리닝의 예. 6.4.2 단계를 참조하십시오. (A)유망한 변종의 높은 빈도로 성공적인 선별. S=DNA 크기 마커, 람다 DNA가 힌드III 및 에코리(EcoRI)로 갈라진; 야생형(wt) = 람다 DNA가 야생형 NlaIV로 갈라진; λ = 람다 DNA 기판, 갈라지지 않음; 활동이 매우 낮은 다른 열=변형. 변형은 레이블이 지정됩니다! = 야생형 효소와 구별되는 분열 패턴을 생성하는 유망한 변이체; ? = 시퀀스 기본 설정을 변경했을 수도 있는 변형입니다. (B)실패 한 선별, 변이체의 대다수비활성 및 명백하게 변경되지 않은 절단 패턴을 가진 1개의 변종. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg"> 그림 9: 결찰에 의한 대체 선택. 이 대안은 끈적끈적한 끝을 생성하는 모든 REases에 사용할 수 있습니다. 여기서 우리는 MwoI 효소(미공개)에 대한 선택 계획에 대한 예시 프로토콜을 제시한다. I) 선택된 시퀀스(ESC의 오른쪽 끝에 위치)와 정의된 잔기가 빨간색으로 표시되고 청색으로 표시된 코그네이트 서열의 선택된 변형. ESC의 왼쪽 끝에 배치할 카운터 선택 시퀀스 아래의 괄호안에 도시된; II) MwoI 분열의 제품; III) 시험관 내 전사/번역을 종료한 후, 제품이 정제되고 과잉 어댑터로 결찰이 수행됩니다. 선택된 순서로 절단된 분열 산물만이 결찰에 참여할 수 있다. 따라서 비활성 변이체가 제거되고 풀다운 단계가 필요하지 않습니다. 카운터 선택 서열의 절단 생성물(ESC의 왼쪽 끝에, 도시되지 않음)은 어댑터의 돌출된 단부가 카운터 선택 서열에 상보적이지 않기 때문에 이 결찰에 참여할 수 없다; IV) 선택적 PCR은 메인 프로토콜에서와 동일한 전략을 사용하여 야생형 퇴화 서열 특이성(F1 프라이머 결합이 카운터 선택부위에 대한 말단)을 가진 변이체를 제거하는 반면, 비활성 변이체는 삼촌에 결합할 수 없는 선택적 역프라이머에 의해 제거된다(따라서 어댑터 결찰에 의해 수정되지 않음) 오른쪽 끝. 다음 사이클에서 공정은 이전 단계의 분열 생성물(즉, 패널 III의 "절단 카세트") 및 적절한 선택적 역프라이머와 동일한 어댑터를 사용하여 반복될 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: NlaIV 엔지니어링에 사용되는 프라이머. 주석에 언급 된 제한 사이트의 시퀀스는 밑줄이 그어져 있습니다. 작은 글자들은 DNA 템플릿에 보완이 없는 서열을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">이 표를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 단추로 클릭하십시오).</a>
표 2: 프로토콜에서 사용되는 PCR 반응의 조건. Tm = 프라이머 용융 온도(프라이머에 대해 Tm이 다른 경우, 낮은 Tm을 사용해야 한다). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">이 표를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 단추로 클릭하십시오).</a>
표 3: 분할 및 혼합 전략으로 합성된 두 개의 돌연변이원 프라이머의 품질 검사 결과. 돌연변이 코돈은 [XXX]로 표시됩니다. 인덱스 수가 낮을수록 인코딩된 아미노산의 위치를 나타냅니다. 엘스비어의 허가를 받아 Czapinska 등8에서 적응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">이 표를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 단추로 클릭하십시오).</a>
표 4: EP-PCR의 결과. ECS의 22개 클론의 서열 분석에서 파생된 주요 파라미터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">이 표를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 단추로 클릭하십시오).</a>

새로운 서열 특이성을 가진 제한 endonucleases는 부분적으로 퇴화한 서열을 인식하는 효소로부터 개발될 수 있다. 여기에서 우리는 우리가 성공적으로 NlaIV 효소의 순서 특이성을 바꾸기 위하여 이용된 상세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜의 주요 성분은 전사/번역 반응의 생체외 구획화 및 새로운 서열 특이성을 가진 변이체의 선택이다.

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

당사의 프로토콜은 체외 구획화와 지향 진화의 독특한 선택 전략을 사용하여 변경되고 보다 엄격한 서열 특이성을 가진 제한 효소를 생성할 수 있게 합니다. 잠재적으로 그것은 매우 보편적이다, 그것은 어떤 제한 엔토뉴리스에 적용해야하고 선택은 원래 의 cognate 시퀀스의 더 엄격한 버전으로 지시 할 수 있습니다. 새로 생성된 변형이 시험관 내 전사 변환에 의해 표현되는 경우, 프로토콜은 특이성을 좁히는 것뿐만 아니라 특이성을 변경하는 데도 적합합니다.하위 돌연변이 발생에 대한 사이트를 결정하려면 사이트의 가상의 중요성에 따라 돌연변이 발생 주파수를 선택하여 전체 라이브러리 복잡성을 제한합니다. 합성을 시작하려면 신디사이저에 새 수지로 포장 된 열을 삽입합니다. 모든 컬럼에서 올리고뉴클레오티드를 삼중까지 합성하고, 바로 앞의 제2절 돌연변이 발생 부위가 3-프라임 엔드에서 계산된다.합성, 끝에 다섯 프라임 트리틸 그룹을 떠나. 보호 그룹은 다음 합성 주기의 시작 부분에서 제거됩니다. 합성 컬럼을 열고 간략하게 원심분리기를 건조 1.5 밀리리터 튜브로 열어 수지를 수집합니다.CPG 합성 지지대를 당기고 소용돌이에 섞습니다. 혼합 CPG 수지의 새 합성 열로 다시 분할합니다. 전체 수율을 감소시킬 수 있기 때문에 습도를 도입하지 마십시오.식도 돌연변이 발생 부위삼중에서 시작하여 합성을 계속한다. 원하는 돌연변이 발생 주파수에 따라 무작위 NNS 삼중항 또는 야생형 삼중항에 컬럼을 할당합니다. 추가 하위 영역이 있는 경우 다음 하위 돌연변이 발생 부위 앞에 있는 삼중으로만 진행합니다.더 이상 하위 화 사이트가 다운스트림이 없는 경우 합성을 완료하여 5프라임 트리틸 그룹을 종료합니다. 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 15 밀리리터 원뿔 튜브에 Span 80 및 25 마이크로리터의 Span 80 및 25 마이크로리터를 추가하여 오일 계면활성제 혼합물을 준비합니다. 부드러운 반전으로 15번 충분히 섞으세요.이 단계의 혼합물은 반투명해야합니다. 각 라이브러리에 대해 오일 계면활성제 혼합물의 950 마이크로리터를 2밀리리터 원형 극저온 바이알로 옮기. 라이브러리 이름으로 레이블을 지정하고 얼음으로 옮김합니다.각 유리병에 작은 원통형 교반 바 하나를 넣습니다. 제조업체의 제안에 따라 시험관 내 전사 번역 반응 혼합물을 준비합니다. 염화 마그네슘과 혼합물을 1.5 밀리몰러의 최종 농도로 보충합니다.반응 혼합물의 50 마이크로리터 알리쿼트를 얼음 에 1.5 밀리리터 튜브에 분배합니다. 얼음에 반응 혼합물에 라이브러리의 1.7 펨토몰을 추가합니다. 1150 RPM으로 설정된 교반 속도와 함께 자기 교반기에 얼음으로 채워진 작은 비커를 먼저 배치하여 각 라이브러리에 대해 물 오일 에멀젼을 연속적으로 준비합니다.그런 다음 950 마이크로리터의 오일 계면활성제 혼합물과 작은 교반 바를 자기 교반기의 얼음 차가운 비커로 옮기는 극저온 바이알을 전달합니다. 교반 바가 회전하고 있는지 확인합니다. 시험관 내 라이브러리 전사 번역 혼합물의 5개의 10 마이크로리터 알리쿼트를 30초 간격으로 2분 동안 추가하고 추가 1분 동안 계속 저어줍니다.에멀젼으로 바이알을 얼음 용기로 옮는다. 이 시점에서 액체는 반투명이 아니라 불투명해야 합니다. 그런 다음 다음 라이브러리를 진행합니다.모든 라이브러리가 처리된 후 키트 제조업체의 권장 사항에 따라 모든 라이브러리의 인큐베이션을 시작합니다. 바이알을 엔지니어링 된 엔도누셀에 최적 온도로 옮기고 2 시간 이상 얼음위에 놓습니다. 극저온 바이알에서 에멀젼을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기.5 개의 어금니 EDTA의 마이크로 리터 1 개를 추가하십시오. 그리고 원심 분리는 실온에서 5 분 동안 13, 000 배 g로 분리합니다. 원심 분리 후 물 오일 인터페이스를 명확하게 볼 수 없다면 상부 오일 위상의 포부 전에 혼합물을 동결하십시오.파이펫으로 상부 오일 위상을 이동하고 폐기합니다. 페놀 클로로폼 150마이크로리터와 10밀리머 트리스-HCl의 100마이크로리터를 수성상에 첨가하여 즉시 추출을 수행합니다. 소용돌이 및 13, 000 배 g에서 30 초 원심 분리를 통해 위상 분리를 수행합니다.상부 수성 단계를 수집합니다. 3-어금니 아세테이트 15마이크로리터, 글리코겐 2.5~5마이크로그램, 에탄올 375마이크로리터를 첨가하여 DNA를 침전시합니다. 샘플을 영하 20도에서 1시간 동안 배양한 후, 원심분리기는 13, 000배, 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리기를 사용한다.상체를 버리고 차가운 70 %의 에탄올 1 밀리리터로 펠릿을 간략하게 씻으십시오. DNA 글리코겐 펠릿을 고속 진공 또는 공기 건조기에서 5분 이상 건조시킵니다. 그런 다음 10 밀리머 트리스-HCl의 50 마이크로 리터에 펠릿을 용해.다음으로 제조업체의 지시에 따라 준비된 5개의 스티르타비딘 마그네틱 비즈를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 섞거나, 바람직하게는 회전 목마 믹서나 부드러운 소용돌이에 섞는다. 튜브를 자기 스탠드로 옮겨 구슬을 분리합니다.그런 다음 비오틴없이 DNA에 농축 된 액체를 수집합니다. 이 프로토콜은 변경되지 않은 야생 형 서열 특이성으로 비활성 효소 및 엔도뇌리스를 고갈시킴으로써 설계 된 제한 엔토나크리스의 원하는 변이체의 주파수를 증가시키는 도구입니다. 성공적인 심사는 유망한 변종의 최대 20%를 식별할 수 있습니다.변이체는 야생식 효소와 구별되는 분열 패턴을 생성하는 경우 유망한 변형으로 표시됩니다. 시퀀스 기본 설정을 변경했을 수 있는 변형도 레이블이 지정됩니다. 여기에 표시 분산 비활성 의 대부분과 분명히 변경되지 않은 분열 패턴을 가진 하나의 변종과 실패 한 검사입니다.이 경우 라이브러리는 스트렙타비딘 캡처 선택 단계를 벗어난 비활성 변형에 의해 지배될 수 있습니다. 선택한 및 반대로 선택된 시퀀스를 신중하게 설계하고 선택한 몇 개 위치에서만 대체를 생성하는 돌연변이 발생 전략에 따라 라이브러리 다양성을 제한하는 것이 중요합니다. 선택된 최상의 변종은 초기 스크리닝의 결과에 기초하여 선호되고 절단된 시퀀스가 아닌 결합 및 분열 역학을 위해 철저히 특성화되어야 한다.우리의 시험 케이스에서, 돌연변이 발생 사이트는 상동성 모형에 근거하여 선택되었습니다. 놀랍게도, 결정 구조는 나중에 몇몇 변경한 잔류물이 DNA와 직접 접촉하지 않다는 것을 보여주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

thermostability 공학 분야에 해당 소설 감독 진화 방법은 bacteriolytic 효소 용으로 개발하고 결과적으로 확인되었습니다. 고온의 부화 후 야생 형 단백질에 비해 무작위 mutagenesis의 한 라운드, 발전 bacteriolytic 효소, PlyC 29C3는 두 번 잔류 활동보다 더 큰 표시 한 후.

내열 Bacteriolytic 효소의 감독 진화에 대한 새로운 검사 방법

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

여기, 우리 CRISPR-Cas9-대상 활동의 손실 없이 더 높은 특이성을 달성 하기 위해 최적화 하는 프로토콜을 제시. 우리는 원하는 특성을 가진 돌연변이 Cas9를 찾을 수 라고 스나이퍼-화면 감독된 진화 접근을 사용 합니다. 스나이퍼-Cas9와 잘린된 단일 가이드 RNAs는 ribonucleoprotein 형태로 배달 높은 특이성을 달성 하기 위한 잘 알려진 전략 이다.

스나이퍼-Cas9를 사용 하 여 대상에서 감독된 진화를 통해 대상에 활동의 손실 없이 CRISPR Cas9의 영향을 최소화 하

이 프로토콜은 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 사용하여 전장 돌연변이 RNA 합성을 결합하여 C형 간염 바이러스 게놈에 제어 가능한 유전적 다양성을 도입하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 표현형 선택을 위한 모델을 제공하며 10kb 길이의 양성 감지 RNA 바이러스 게놈에 사용할 수 있습니다.

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