높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

이 프로토콜의 전반적인 목표는 고처리량 염기서열분석을 활용하여 단백질의 포괄적인 단일 부위 포화 돌연변이 유발 라이브러리의 기능 평가를 설명하는 것입니다. 이 방법은 생화학 및 분자 진화 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 단백질에 대한 생화학적 구조적 및 진화적 제약은 무엇입니까?

그리고 어떻게 새로운 기능을 가진 단백질을 설계할 수 있을까요? 이 기술의 주요 장점은 라이브러리 구축 및 염기서열분석을 멀티플렉싱하여 전체 단백질 포화 돌연변이 유발 연구에서 여러 가지 유용한 염기서열분석 판독을 극대화한다는 것입니다. 텍스트의 프로토콜에 따라 PCR Master Mix 플레이트를 준비한 후 멀티채널 피펫을 사용하여 이전에 희석된 Sense 돌연변이 유발 프라이머가 포함된 96웰 플레이트에서 PCR 플레이트의 동족 웰로 10마이크로리터를 옮깁니다.

플레이트 씰을 사용하여 각 PCR 플레이트를 덮고 200Gs에서 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 PCR 플레이트를 thermocycler로 옮기고 다음 프로그램을 실행합니다. 추가 PCR을 수행하고 반응을 1에서 100까지 희석한 후, 혼합 및 희석된 1차 돌연변이 유발 PCR 산물에서 1마이크로리터를 Master Mix를 포함하는 새로운 PCR 플레이트의 동족 웰로 이동합니다.

플레이트 씰을 사용하여 각 PCR 플레이트를 덮습니다. 약 200Gs에서 2분 동안 플레이트를 원심분리합니다. 그런 다음 플레이트를 thermocycler로 옮기고 비디오의 앞부분에 나열된 것과 동일한 프로그램을 실행합니다.

PCR 산물 크기를 확인하고 텍스트 프로토콜에 따라 농도를 측정한 후 각 NNS 하위 라이브러리 PCR 산물을 100나노그램으로 5개의 NNS 하위 라이브러리 그룹으로 혼합합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 sublibrary PCR 반응을 실행하고 PCR 반응에서 클로닝 벡터를 분해한 후, 동족 제한 digested cloning vector와 함께 digested NNS sublibrary group 각각에 대해 이 가이드라인에 따라 ligation reaction을 설정합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

전기 기능이 있는 E.coli 세포가 해동되면 각 정제된 ligation 반응에 10마이크로리터의 세포를 추가하고 전기 증식 큐벳으로 옮깁니다. 1.8 킬로볼트에서 셀을 전기로 비례 배합한 다음 1밀리리터의 SOB 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 각 회수 배양 10마이크로리터를 LB 990마이크로리터에 다시 현탁합니다. 그리고 테트라사이클린 밀리리터당 12마이크로그램이 들어 있는 LB 오거 플레이트에 100마이크로리터를 펴 바릅니다.

각 회수 배양당, 50ml의 LB와 50마이크로리터의 tet-stock이 포함된 250ml 배양 플라스크를 준비합니다. 나머지 약 1ml의 회수 배양액을 플라스크로 옮깁니다. 섭씨 37도, 200rpm에서 밤새 배양합니다.

플레이트에서 성공적인 형질전환체의 수를 세고 하룻밤 배양물에서 플라즈마 DNA를 분리한 후 각 플라스미드 100나노그램을 함께 혼합합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 DNA 라이브러리를 형질전환한 후 라이브러리 오버나이트 배양을 0.1과 같은 OD-600으로 희석합니다. 그리고 1 플라스크에 1 밀리리터를 첨가하십시오.

사전 선택 배양을 섭씨 37도 및 200RPM에서 배양합니다. OD-600이 0.1이 될 때까지 측정하여 성장을 주기적으로 모니터링합니다. 사전 선택 배양 100ml를 50ml 원추형 튜브 2개로 옮기고 섭씨 4도에서 6분 동안 4, 000Gs에서 원심분리합니다.

대부분의 상등액을 제거하고 펠릿을 하나의 15ml 원추형 튜브로 결합합니다. 그런 다음 원심 분리를 반복 한 후 모든 상층액을 제거합니다. 다른 두 개의 플라스크에 테트라사이클린을 최종 농도인 밀리리터당 12마이크로그램으로 추가합니다.

그리고 최종 OD-600이 0.001과 같은 사전 선택 배양의 부피. 플라스크 1개에 최종 농도 50마이크로그램/밀리리터 암피실린 1밀리리터를 50마이크로그램/밀리리터로 추가합니다. 이것이 바로 선택 문화입니다.

섭씨 37도에서 200RPM으로 배양물을 배양하는 동안 암피실린이 없는 배양액이 0.1과 같은 OD-600에 도달할 때까지 배양물의 성장을 모니터링합니다. 또한 선택 배양의 OD-600을 측정합니다. 선택 배양의 OD-600을 0.1로 나누고 100을 곱한 후 이 부피를 50밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 4, 000G 및 섭씨 4도에서 6분 동안 원심분리합니다.

대부분의 상등액을 제거한 후 다시 회전하여 모든 상등액을 제거하기 전에 펠릿을 단일 튜브로 결합하십시오. 고처리량 염기서열분석을 수행하려면 PCR Master Mix를 준비하고 23마이크로리터를 10개의 PCR 튜브로 옮깁니다. 사전 선택 배양에서 정제된 플라스미드 DNA의 마이크로리터당 0.5 나노그램 1마이크로리터를 튜브 1에서 5까지 추가합니다.

그리고 선택 문화에서 튜브 6에서 10까지. 50 마이크로 리터의 50 마이크로 몰 순방향 직교 프라이머, OP1F에서 OP5F를 각각의 역 직교 프라이머 OP1R에서 OP5R과 함께 혼합합니다. 같은 순서로 1마이크로리터를 PCR 튜브 1-5, 6-10으로 옮깁니다.

PCR 튜브를 thermocycler로 옮기고 다음 프로그램을 실행합니다. 그런 다음 각 튜브에서 1마이크로리터를 99마이크로리터의 물로 옮겨 PCR 반응을 100배 희석합니다. 잘 섞은 다음 튜브에서 99 마이크로 리터를 피펫으로 넣고 버립니다.

50 마이크로 리터의 정방향 및 역방향 프라이머를 함께 혼합합니다. 그런 다음 1마이크로리터를 PCR 튜브 1-5, 6-10에 넣습니다. 그런 다음 PCR Master Mix를 준비한 후 각 PCR 튜브에 23마이크로리터를 넣고 다음 프로그램을 실행합니다.

인덱싱 시퀀스를 추가하기 위해 최종 PCR을 수행하려면 이전과 같이 PCR 반응을 100배 희석하고 1마이크로리터를 유지한 후 PCR Master Mix 23마이크로리터를 추가합니다. NNS 하위 라이브러리 그룹 1에서 5까지 생성된 템플릿이 있는 튜브의 경우 각각 0.5마이크로리터의 전방 프라이머 501F에서 505F를 추가합니다. 사전 선택 및 선택 배양으로 인한 템플릿이 있는 튜브의 경우 0.5마이크로리터의 리버스 프라이머 701R 및 702R을 추가합니다.

방금 표시한 것과 동일한 PCR 프로그램을 실행합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 각 반응의 농도를 측정한 후 각 PCR 산물 100나노그램을 단일 마이크로 원심분리 튜브에 혼합합니다. 6X gel loading dye를 추가한 후 결합된 PCR 샘플 전체를 2% agarose gel에 로드합니다.

그리고 젤을 100볼트에서 50분 동안 실행합니다. 장파장 UV illuminator를 사용하여 약 360개의 염기쌍의 PCR 산물을 포함하는 slice를 시각화한 다음 절제합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 정제, 염기서열 분석 및 분석합니다.

직교 프라이밍 부위를 포함하는 5개의 변형된 pBR322 플라스미드에 대한 플라스미드 맵이 여기에 나와 있습니다. PCR을 사용한 직교 프라이머의 특이성을 테스트한 결과, 일치하는 플라스미드가 반응에 포함된 경우에만 올바른 PCR 산물이 얻어지는 것으로 나타났습니다. 그리고 그것이 없는 동안 어떤 크기의 제품도 얻어지지 않았습니다.

실험 처리 후, 사전 선택 조건으로부터 6.2 곱하기 10 부터 6번째 리드, 그리고 암피실린 조건으로부터 6.3 곱하기 10 부터 6번째 리드를 얻었다. 사전 선택 조건의 각 아미노산 돌연변이에 대한 개수는 로그 정규 분포를 표시합니다. 이 그림은 TEM-one의 각 위치에서 각 돌연변이에 대한 상대적 적합성 효과 FIA를 보여줍니다.

그리고 그 분포가 여기에 표시됩니다. 암피실린 밀리리터당 50마이크로그램에서 선택하면, 대부분의 돌연변이는 중립 또는 거의 중립적인 적합 효과를 갖는다. 여기는 흰색 픽셀에 해당하고 여기는 큰 피크에 해당합니다.

이 항생제 농도에서 돌연변이의 작은 부분만으로도 체력에 상당한 영향을 미칩니다. 예상대로, 여기에는 고도로 보존된 활성 부위 잔류물 내의 돌연변이가 포함됩니다. 반면, 일부 픽셀은 현저하게 빨간색으로 나타납니다.

이 기술을 완전히 익히면 약 일주일 안에 완료할 수 있습니다. 적절하게 수행되고 모든 시약을 사용할 수 있는 경우. 이 절차를 시도하는 동안 돌연변이 유발 PCR 산물을 올바른 그룹으로 결합하고 올바른 벡터로 복제하기 위해 클로닝 중에 체계적인 상태를 유지하는 것이 중요합니다.

그리고 시퀀싱 준비 중에는 올바른 프라이머를 사용합니다. 이 절차에서 확장하여, 돌연변이의 유전적 및 환경적 맥락 의존성에 관한 추가 질문에 답하기 위해 돌연변이 조합, 다양한 선택 환경 및 기타 단백질 시스템을 조사하도록 프로토콜의 주요 단계를 수정할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 전체 단백질 포화 돌연변이 유발 라이브러리를 구성하고 고처리량 염기서열분석을 사용하여 각 돌연변이의 기능적 효과를 동시에 평가하는 데 필요한 작업을 잘 이해하게 될 것입니다.

브롬화 에티듐 및 자외선으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 프로토콜의 일부를 수행하는 동안 항상 장갑, 실험실 가운 및 자외선 차폐와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.