Name: 높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 배우세요 고처리량 시퀀싱을 활용한 전체 단백질 포화 돌연변이 유발 라이브러리의 기능 평가 방법입니다. 이 기술은 생화학 및 분자 진화 연구에서 단백질의 구조적 진화적 제약과 새로운 기능 설계에 대한 통찰을 제공합니다.

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R.R.은 미국 국립보건원(National Institutes of Health, RO1EY018720-05), 로버트 A. 웰치 재단(Robert A. Welch Foundation, I-1366), 시스템 생물학 그린 센터(Green Center for Systems Biology)의 지원을 받고 있습니다.

<ol><li>Hutchison, C. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+a+specific+position+in+a+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).</li>
<li>Mullis, K. B., Faloona, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synthesis+of+DNA+in+vitro+via+a+polymerase-catalyzed+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.</a> Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).</li>
<li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+in+one+day+with+%3E80%25+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency.</a> Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).</li>
<li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments%3A+study+of+protein+and+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).</li>
<li>Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mutation+of+bacteriophage+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme.</a> J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).</li>
<li>Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIV.+Analysis+of+4000+altered+Escherichia+coli+lac+repressors+reveals+essential+and+non-essential+residues%2C+as+well+as+%27spacers%27+which+do+not+require+a+specific+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence.</a> J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).</li>
<li>Kleina, L. G., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIII.+Extensive+amino+acid+replacements+generated+by+the+use+of+natural+and+synthetic+nonsense+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors.</a> J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).</li>
<li>Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequence+determinants+of+beta-lactamase+structure+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity.</a> J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).</li>
<li>Fowler, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+protein+sequence-function+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of protein sequence-function relationships.</a> Nat Methods. 7 (9), 741-746 (2010).</li>
<li>Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+illumination+of+a+fitness+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Experimental illumination of a fitness landscape.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).</li>
<li>McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+architecture+of+protein+function+and+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The spatial architecture of protein function and adaptation.</a> Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).</li>
<li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+of+systematic+combinatorial+libraries+reveals+beta-lactamase+sequence+constraints+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution.</a> J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).</li>
<li>Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolvability+as+a+Function+of+Purifying+Selection+in+TEM-1+beta-Lactamase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase.</a> Cell. 160 (5), 882-892 (2015).</li>
<li>Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+properties+of+class+A+beta-lactamases%3A+efficiency+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity.</a> Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).</li>
<li>Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+evolution+of+TEM-1+beta-lactamase%3A+experimental+reconstruction+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance.</a> FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).</li>
<li>Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Darwinian+evolution+can+follow+only+very+few+mutational+paths+to+fitter+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins.</a> Science. 312 (5770), 111-114 (2006).</li>
<li>Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+levels+in+sputum%2C+serum%2C+and+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva.</a> Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).</li>
<li>Giachetto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+and+penicillin+concentration+in+serum+and+pleural+fluid+of+hospitalized+children+with+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia.</a> Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).</li>
<li>Ambler, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+numbering+scheme+for+the+class+A+beta-lactamases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases.</a> Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies).</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+mutational+scanning+of+an+RRM+domain+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+poly%28A%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein.</a> RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).</li>
<li>Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+of+an+intragenic+epistatic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">A systematic survey of an intragenic epistatic landscape.</a> Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).</li>
<li>Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+prokaryotic+transcription+through+arbitrary+protein-protein+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts.</a> Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).</li>
<li>Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+enzyme+function+with+microfluidic-based+deep+mutational+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다

여기 프로토콜은 높은 처리량 시퀀싱 기술을 사용하여, 전체 단백질 포화 돌연변이 라이브러리의 관능 평가를 수행하기 위해 설명된다. 상기 방법의 중요한 특징은 클로닝 과정에서 직교하는 프라이머의 사용이다. 간단히, 각각의 아미노산 위치는 무작위 돌연변이 유발 PCR로되고, 시퀀스 길이 결합 높은 처리량 시퀀싱에 의해 수용되는 위치의 그룹으로 함께 혼합 하였다. 이러한 그룹은 직교 프라이밍 사이트 함께 혼합하고 선택 대상의 쌍을 포함하는 플라스미드 벡터로 클로닝하고, 직교 프라이머를 사용하여 디 멀티플렉싱하고,이어서 깊이 서열. 돌연변이 길이 제한 시퀀스 내의 판독 한정되기 때문에,이 방법은 유용 수가 긴 서열보다 크기가 유전자 돌연변이를 포함하는 길이가 읽혀 최대화한다. 또한,이 기술은 전체 mutatio 동시 또는 &quot;하나의 배치&quot;선택을 허용워크로드뿐만 아니라 돌연변이 선택 상이한 레벨을 경험할 가능성을 줄여 NAL 라이브러리. 실제로, 프로토콜 크게 우려 조직의 중요한 단계 : 복제 프로세스 (프로토콜 단계 ...

돌연변이 긴 생물학적 시스템과 진화의 성질을 연구하고, 향상되며 신규 한 기능 돌연변이 단백질 또는 생물체를 생성하기 위해 실험에 사용되었다. 초기 접근 방식은 생물의 무작위 돌연변이를 생산하는 방법에 의존하지만, 재조합 DNA 기술의 출현은 사이트 별 방식으로 DNA에 대한 선택의 변화, 즉., 부위 특이 적 변이 1, 2를 소개하고 연구 할 수 있었다. 현재의 기술은, 일반적으로 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 돌연변이 유발에 올리고 뉴클레오티드를 이용하여, 주어진 유전자 돌연변이 3,4- 적은 수 (예., 점 돌연변이)를 작성하고 평가하기가 비교적 용이 한 것이다. 이것은 훨씬 더 어렵고 그러나 때 목표 방법, 예를 들면, 제작 및 평가 모두 가능한 단일 사이트 (또는 고차) 돌연변이. 많은 반면 m 다수의 평가하려 초기 연구에서 알게 된유전자 utations는 사용 된 기술은 5-7 균주 독립적 넌센스 감지기를 사용하여 각 돌연변이의 평가를 필요로하는, 예를 들면, 종종 힘들고되었는지 또는 인해 생거 시퀀싱 (8)의 저 시퀀싱 깊이로 그 정량 능력을 제한 하였다. 이러한 연구에서 사용 된 기술은 주로 높은 처리량 시퀀싱 기술 9-12를 이용하는 방법에 의해 대체되어왔다. 라이브러리 전의 이러한 개념적으로 간단한 접근 기능을위한 화면이나 선택에 라이브러리를 실시 돌연변이의 다수를 포함하는 라이브러리를 생성 수반하기 다음 깊은 시퀀싱 (예.,&gt; 10 6 서열의 순서 판독) 선택 후. 이러한 방식으로, 돌연변이 다수의 표현형 적합성 효과, 각 돌연변이의 인구 주파수의 변화로서 표현 동시에 더욱 정량적으로 평가할 수있다. 우리는 이전에 SIMP 소개(. 즉, 전체 단백질 포화 돌연변이 라이브러리) 단백질 모든 가능한 단일 아미노산 돌연변이 라이브러리를 평가하는 해당 긴 서열보다 길이 유전자를위한 제작 방법 길이 11,13 읽기 : 첫째, 각 아미노산 위치는 랜덤 화 에 의해 돌연변이 PCR을 현장 지시했다. 이 과정에서 유전자 시퀀싱 플랫폼에 의해 수용 총 길이 인접한 위치로 이루어지는 그룹들로 분할된다. 각 그룹의 돌연변이 PCR 제품은 결합하고, 각 그룹이 독립적으로 선택 및 높은 처리량 시퀀싱을 실시한다. 시퀀스 및 시퀀싱 판독 길이 돌연변이의 위치와의 대응 관계를 유지함으로써, 이러한 접근 방식은 최대화 시퀀싱 깊이의 장점을 갖는다 :. 하나는 단순히 그룹 (예를 들어, 표준 산탄 의해으로 분할하지 않고 짧은 창에서 그러한 라이브러리 시퀀스 수 있지만 시퀀싱 방법)이 대부분의 야생형 따라서 m 것이다 수득 읽기낭비 시퀀싱 처리량 ajority (80 최소 % 100 아미노산 (300 BP) 창에서 서열 500 아미노산 단백질의 전체 단백질 포화 돌연변이 라이브러리의 예는 야생형 서열 것이다 판독). 여기에서, 프로토콜은 (도 1에 설명) 상기 방법을 이용하여, 전체 단백질 포화 돌연변이 라이브러리의 기능 평가를위한 높은 처리량 시퀀싱을 활용하는 제시된다. 중요한 것은 선별 또는 선택을 동시에 행하여들이 하나의 라이브러리로 다중화 될 수 있도록 각 시퀀스 그룹을 바코드하도록 라이브러리 클로닝 과정에 직교하는 프라이머의 사용을 소개하고 깊은 시퀀싱 디 멀티플렉싱. 시퀀스 그룹이 독립적으로 선택을 실시하지 않기 때문에,이 부하를 감소시키고, 각 돌연변이의 선택의 동일한 레벨을 경험할 것을 보장한다. TEM-1 β-lactamase에, 높은 수준의 내성을 부여하는 효소β - 락탐 항생제 (예., 암피실린) 박테리아는 14-16 모델 시스템으로 사용된다. 프로토콜은 E.에서 TEM-1의 전체 단백질 포화 돌연변이 라이브러리의 평가에 대해 설명한다 암피실린 임상 용량 (50 μg의 / ㎖) (17, 18)에 대한 대략의 혈청 수준에서 선택 하에서 대장균.

<table><tbody><tr><td>Typtone</td><td>리서치 프로듀셜 인터내셔널</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>Y20020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 시<td>그마-알드리치</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>페트리 플레이트</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td>http://www.mathworks.com/products/matlab/</td><td></td></tr> <tr><td>올리고뉴클레오티드 프라이머</td><td>통합 DNA 기술</td><td>https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos</td><td>25 nmol 규모, 요청</td></tr><tr><td></td> 시 표준 탈염<td>pBR322_AvrII</td><td></td><td>TEM-1 유전자 다운스트림의 AvrII 제한 부위를 포함하도록 변형된 pBR322 플라스미드</td></tr><tr><td>pBR322_OP1 &ndash; </td> 요청 <td></td> 시 직교 프라이밍 부위 Q5 고충실도 DNA 중합효소를 <td>포함하는 5개의 modified pBR322 플라스미드</td><td>요청 시 제공</td></tr>, <tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>M0491L</td><td>, 5x PCR buffer 및 PCR additive(GC enhancer) 포함,</td></tr> <tr><td>15 ml 코니컬 튜브</td>, <td>Corning</td><td>430025</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr>pBR322_OP5<tr><td>PCR 플레이트, 96웰</td><td>Fisher Scientific</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트 씰</td><td>Excel Scientific</td><td>F-96-100</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96웰 열 순환기</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>6x 겔 로딩 염료</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>20090-500.0</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech)</td><td>Fotodyne Inc.</td><td></td><td></td>http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation</tr><tr><td>EB 완충액</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>96웰 검은색 벽, 투명 바닥 분석 플레이트</td><td>Corning</td><td>3651</td><td></td></tr><tr><td>Lambda 파지 DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011S</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen dsDNA 시약</td><td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td>dsDNA 정량 시약, 프로토콜 단계 2.2.4에서 사용</td></tr><tr><td>Victor 3 V 마이크로플레이트 리더</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 정제 키트</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>장파장 UV 조명기</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBUVLS-80</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 젤 DNA 추출 버퍼</td><td>Zymo Research</td><td>D4001-1-100</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EVB100 전기 역량 E. coli</td><td>Avidity</td><td>EVB100</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator (E. coli Pulser)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652102</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvette</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계 (Ultrospec 3100 pro)</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80211237</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid 정제 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>8 웰 PCR 스트립 튜브</td><td>Axygen</td><td>321-10-551</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 분석 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>dsDNA 정량 분석 시약</td></tr>, <tr><td>Qubit 어세이 튜브</td>, <td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr>, <tr><td>Qubit 형광측정기</td>, <td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr>, <tr><td>암피실린 나트륨염</td>, <td>Akron Biotechnology</td>, <td>50824296</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 시약 키트, v2 (500 cycles)</td><td>Illumina,</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr>, <tr><td>MiSeq 데스크탑 시퀀서</td><td>, Illumina</td><td></td><td>http://www.illumina.com/systems/miseq.html 대안으로, Illumina HiSeq 플랫폼에서 시퀀싱을 할 수 있습니다</td></tr><tr><td>FLASh 소프트웨어</td><td>John Hopkins University - 오픈 소스</td><td>http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/</td> <td>소프트웨어를 사용하여 차세대 염기서열분석 데이터의 쌍단 판독을 병합할</td></tr> 수 있습니다 <tr><td>AatII_F</td><td></td><td></td><td>GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC</td></tr><tr><td>AvrII_R</td><td></td><td></td><td>CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG</td></tr><tr><td>AvrII_F</td><td></td><td></td><td>CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG</td></tr><tr><td>AatII_OP1_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGTATTTCAAC 
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP2_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGCTCACGGA 
GTGTACTAATTAAGAAaccatt 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP3_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTACGTCTGA 
ACTTGGGACTTAAGAAacca 
TTATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP4_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT 
ACCAAGTGATAAGAAaccatt 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP5_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTCCGTCGGA 
GTAACAATCTTAAGAAACCAT 
TATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>OP1_F</td><td></td><td></td><td>GACCGGACAGTTGAAATACG</td></tr><tr><td>OP1_R</td><td></td><td></td><td>CGACGTACAGGACAATTTCC</td></tr><tr><td>OP2_F</td><td></td><td></td><td>ATTAGTACACTCCGTGAGCG</td></tr><tr><td>OP2_R</td><td></td><td></td><td>AGTATTAGGCGTCAAGGTCC</td></tr><tr><td>OP3_F</td><td></td><td></td><td>AGTCCCAAGTTCAGACGTAC</td></tr><tr><td>OP3_R</td><td></td><td></td><td>GAAAAGTCCCAATGAGTGCC</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> OP4_F <td>TCACTTGGTATCGAGAACGG</td></tr><tr><td>OP4_R</td><td></td><td></td><td>TATCACGGAAGGACTCAACG</td></tr><tr><td>OP5_F</td><td></td><td></td><td>AGATTGTTACTCCGACGGAC</td></tr><tr><td>OP5_R</td><td></td><td></td><td>TATAACAGGCTGCTGAGACC</td></tr><tr><td>Group1_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC 
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC</td></tr><tr><td>Group1_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
TTGCCCGGCGTCAAC</td></tr><tr><td>Group2_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA 
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC</td></tr><tr><td>Group2_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT 
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG</td></tr><tr><td>Group3_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG 
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC</td></tr><tr><td>Group3_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
GCCAGTTAATAGTTTGCGC</td></tr><tr><td>Group4_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC 
AAACGACGAGCGTGACAC</td></tr><tr><td>Group4_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC 
AATGATACCGCGAGACCC</td></tr><tr><td>Group5_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG 
GCTGGCTGGTTTATTGC</td></tr><tr><td>Group5_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT 
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높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis는 단백질 구조, 기능 및 진화를 조사하는 방법으로 오랫동안 사용되어 왔습니다. 최근 대규모 병렬 염기서열분석 기술의 발전으로 많은 수의 돌연변이가 동시에 발생하는 기능적 또는 적합성 효과를 평가할 수 있는 가능성이 열렸습니다. 여기에서는 263 아미노산 항생제 내성 효소 TEM-1 β-lactamase를 예로 들어 고처리량 염기서열분석 기술을 활용하여 관심 단백질에서 가능한 모든 단일 아미노산 돌연변이의 효과를 실험적으로 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법에서는 전체 단백질 포화 돌연변이 유발 라이브러리가 부위 지정 돌연변이 유발 PCR에 의해 구성되며, 각 위치를 가능한 모든 아미노산에 개별적으로 무작위화합니다. 그런 다음 라이브러리는 박테리아로 변환되고 β-락탐 항생제에 대한 내성을 부여하는 능력을 위해 선택됩니다. 그런 다음 각 돌연변이의 적합성 효과는 선택 전과 후의 라이브러리의 심층 염기서열분석에 의해 결정됩니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 고처리량 염기서열분석 판독 길이에 의해 수용되는 길이 그룹으로 인접 위치를 혼합하고 각 그룹에 바코드를 부착하기 위해 직교 프라이머를 사용함으로써 염기서열분석 판독 깊이를 최대화하고 전체 돌연변이 라이브러리를 동시에 선택할 수 있는 방법을 도입한다는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하는 대표적인 결과는 임상적으로 관련된 암피실린 용량에서 TEM-1의 모든 단일 아미노산 돌연변이의 적합성 효과를 평가하여 제공됩니다. 이 방법은 고처리량 선택 분석이 있는 다른 단백질로 쉽게 확장할 수 있어야 합니다.

직교 프라이밍 사이트를 포함하는 다섯 가지 변형 인 pBR322 플라스미드의 플라스미드지도 (pBR322_OP1 - pBR322_OP5)는도 2a에 도시된다. 직교 프라이머의 PCR은 다섯 pBR322_OP1-5 플라스미드와 함께, 각각의 직교의 프라이머 각 쌍을 사용하여 수행하거나, 모든 플라스미드를 뺀 직교 프라이머 쌍을 일치 플라스미드하고, 특정 여부를 테스트한다. 일치하는 플라스미드가 포함 된 경우 올바른 제품은 획득하고, 어떤 크기의 어떤 제품은 그것의 부재 (그림 2B)에서 얻어진되지 않았다. 대표적인 실험이 텍스트 (도 1)에 기술 된 프로토콜은 다음을 수행 하였다. 처리는 다음 (프로토콜 4.2) 6.2 × 10 6은 예비 선택 상태로부...

우리는 높은 처리량 시퀀싱을 이용하여 단백질의 종합적인 단일 사이트 포화 돌연변이 라이브러리의 기능 평가를위한 프로토콜을 제시한다. 중요한 것은,이 방법은 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 다중화하는 직교 프라이머 쌍을 사용한다. 암피실린의 임상 적 투여 량에서 선택 TEM-1 β-lactamase를를 사용하는 대표적인 결과가 제공된다.

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 고처리량 염기서열분석을 활용하여 단백질의 포괄적인 단일 부위 포화 돌연변이 유발 라이브러리의 기능 평가를 설명하는 것입니다. 이 방법은 생화학 및 분자 진화 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 단백질에 대한 생화학적 구조적 및 진화적 제약은 무엇입니까?그리고 어떻게 새로운 기능을 가진 단백질을 설계할 수 있을까요? 이 기술의 주요 장점은 라이브러리 구축 및 염기서열분석을 멀티플렉싱하여 전체 단백질 포화 돌연변이 유발 연구에서 여러 가지 유용한 염기서열분석 판독을 극대화한다는 것입니다. 텍스트의 프로토콜에 따라 PCR Master Mix 플레이트를 준비한 후 멀티채널 피펫을 사용하여 이전에 희석된 Sense 돌연변이 유발 프라이머가 포함된 96웰 플레이트에서 PCR 플레이트의 동족 웰로 10마이크로리터를 옮깁니다.플레이트 씰을 사용하여 각 PCR 플레이트를 덮고 200Gs에서 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 PCR 플레이트를 thermocycler로 옮기고 다음 프로그램을 실행합니다. 추가 PCR을 수행하고 반응을 1에서 100까지 희석한 후, 혼합 및 희석된 1차 돌연변이 유발 PCR 산물에서 1마이크로리터를 Master Mix를 포함하는 새로운 PCR 플레이트의 동족 웰로 이동합니다.플레이트 씰을 사용하여 각 PCR 플레이트를 덮습니다. 약 200Gs에서 2분 동안 플레이트를 원심분리합니다. 그런 다음 플레이트를 thermocycler로 옮기고 비디오의 앞부분에 나열된 것과 동일한 프로그램을 실행합니다.PCR 산물 크기를 확인하고 텍스트 프로토콜에 따라 농도를 측정한 후 각 NNS 하위 라이브러리 PCR 산물을 100나노그램으로 5개의 NNS 하위 라이브러리 그룹으로 혼합합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 sublibrary PCR 반응을 실행하고 PCR 반응에서 클로닝 벡터를 분해한 후, 동족 제한 digested cloning vector와 함께 digested NNS sublibrary group 각각에 대해 이 가이드라인에 따라 ligation reaction을 설정합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 배양합니다.전기 기능이 있는 E.coli 세포가 해동되면 각 정제된 ligation 반응에 10마이크로리터의 세포를 추가하고 전기 증식 큐벳으로 옮깁니다. 1.8 킬로볼트에서 셀을 전기로 비례 배합한 다음 1밀리리터의 SOB 배지를 추가

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 "다음 세대"염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

효모 단백병증 모델은 질병과 관련된 단백질의 독성 및 응집을 평가하는 데 유용한 도구입니다. 여기에서는 Hsp104 변이체 라이브러리에서 독성 억제제를 스크리닝하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 효모에서 독성이 있는 단백질의 독성 억제자에 대해 모든 단백질 라이브러리를 스크리닝하는 데 적용할 수 있습니다.

효력을 더 Hsp104 변종 사용 효모 Proteinopathy 모델을 분리

이 원고는 두 개의 차세대 염기서열분석 패널에 대한 임상 프로토콜을 설명합니다. 한 패널은 혈액학적 악성 종양을 조사하고 다른 패널은 고형 종양에서 일반적으로 돌연변이가 발생하는 유전자를 대상으로 합니다. 인간 악성 종양에서 드라이버 돌연변이의 분자 분류는 귀중한 예후 및 예측 정보를 제공합니다.

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

임상 증상은 다음 이전에 또는에 - - 타겟 치료제에 대한 약물 저항은 광범위하고 저항의 메커니즘을 식별 할 필요가있다 대체 임상 관리 전략을 안내하기위한 중요합니다. 여기, 우리는 이러한 메커니즘의 발견을 촉진하는 순서와 체외에서 약제 내성 라인의 몇 유도에 프로토콜을 제시한다.

구현<em&gt; 체외</em&gt; 약물 저항 분석법 : 임상 적 저항 메커니즘을 폭로 가능성을 극대화

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

특정 RNA 순서 묶는 단백질 유전자 발현에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이러한 바인딩 사이트의 상세한 특성은 유전자 규칙의 우리의 이해를 위해 중요 합니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis에 대 한 단일-단계 접근 방식을 설명 합니다. 이 방법은 모든 단백질 바인딩 사이트 RNA에 대 한 관련입니다.

Phosphorothioates를 사용 하 여 RNA에서 사이트 바인딩 규제 단백질의 소설 포화 Mutagenesis 접근: 단일 단계 특성

이 프로토콜 셀룰러 맥락에서 본질적으로 낮은 활동, 단일 매출 효소의 분해 활동을 평가 하는 메서드를 제공 합니다. 특히,이 메서드는 PCSK9, 그 분해 활동은 그것의 궁극적인 노인 기능에 필요한 지질 대사의 핵심 드라이버의 분해 활동을 평가에 적용 됩니다.

단일-매출 Protease PCSK9의 베이스를 평가 하는 높은 처리량 Luciferase 분석 결과

서열 특이성은 유전자 조절에 매우 중요합니다. 특정 서열을 인식하는 조절 단백질은 유전자 조절에 중요합니다. 이러한 단백질에 대한 기능적 결합 부위를 정의하는 것은 어려운 생물학적 문제입니다. RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위의 식별을 위한 반복적 접근법은 여기에 기재되어 있으며 모든 RNA 결합 단백질에 적용가능하다.

규제 RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위를 식별하기 위한 서열 공간 탐색

이 문서에서는 주어진 환자에게서 다른 견본 중 클론 및 subclonal 변경을 확인하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 실험은 특정 종양 모형에 집중하더라도, 접근은 그밖 고형 종양에 광범위하게 적용가능하다.

표적 시퀀싱 접근법을 통한 비교 병변 분석

배우세요 고처리량 시퀀싱을 활용한 전체 단백질 포화 돌연변이 유발 라이브러리의 기능 평가 방법입니다. 이 기술은 생화학 및 분자 진화 연구에서 단백질의 구조적 진화적 제약과 새로운 기능 설계에 대한 통찰을 제공합니다.

높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

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