진화 방법에 감독

이 프로토콜의 전반적인 목표는 지향성 진화 실험을 위해 Saccharomyces Cerevisiae에서 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 어셈블리 및 클로닝 시 중첩 영역을 지정하는 방법과 같이, 집중적인 지향성 진화 실험을 위한 실험실 기반 구축 시 발생하는 주요 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단순함과 견고함에 있으며, 단 한 번의 형질전환 단계만으로도 양질의 수준을 확보할 수 있다는 점입니다.

이 돌연변이 라이브러리 제작 및 스크리닝 프로토콜은 진균 aryl-alcohol oxidase(AAO)를 통해 시연될 것입니다. 집중 유도 진화를 위한 영역은 먼저 효소의 가용한 결정 구조 또는 상동성 모델을 기반으로 한 컴퓨터 알고리즘의 도움을 받아 선택합니다. AAO의 두 영역인 M1 영역과 M2 영역을 표적으로 하여 무작위 돌연변이 유발 및 재조합을 수행할 것입니다.

표적 부위를 증폭하기 위해 돌연변이 유발 PCR을 수행합니다. 효모 내에서의 splicing을 촉진하기 위해, 정의된 영역들의 PCR 반응을 중첩시켜 각 세그먼트 사이에 약 50 base pairs의 중첩 영역을 생성합니다. DNA 템플릿 46 nanograms, 센스와 안티센스 프라이머 각 90 nanomolar, DNTPs 0.3 milimolar, DMSO 3%, 염화마그네슘 1.5 milimolar, 염화망간 0.5 milimolar, 그리고 tack DNA polymerase 0.5 units per microliter를 포함하는 50 microliter 부피의 돌연변이 유발 PCR 반응액을 준비합니다.

다음 PCR 프로그램을 사용하십시오. 95 °C에서 2분, 95 °C에서 45초, 50 °C에서 45초, 74 °C에서 45초를 28회 반복한 후, 74 °C에서 10분간 처리합니다. AAO 유전자의 나머지 부분인 HF 영역은 돌연변이 유발 세그먼트와 겹치는 해당 영역 및/또는 선형화된 벡터 오버행이 포함된 high fidelity PCR을 통해 증폭됩니다.

10 ng의 DNA 템플릿, 각 250 nM의 sense 및 antisense 프라이머, 0.8 mM의 DNTPs, 3%의 DMSO, 그리고 0.2 units/µL의 iProof ultra high-fidelity DNA polymerase를 포함하여 최종 부피 50 µL로 high-fidelity PCR 반응액을 준비합니다. 다음과 같은 PCR 프로그램을 사용합니다: 98 °C에서 30초, 98 °C에서 10초, 55 °C에서 25초, 72 °C에서 45초를 28회 반복한 후, 72 °C에서 10분간 처리합니다.

그런 다음 모든 PCR 단편을 제조사의 프로토콜에 따라 상용 젤 추출 키트로 정제합니다. 다음 단계는 벡터를 선형화하여 표적 유전자의 5' 말단 및 3' 말단과 상동성을 갖는 약 50 bp의 플랭킹 영역을 생성하는 것입니다. 2 µg의 DNA, 7.5 units의 BamH-one, 7.5 units의 XHO-one, 20 µg의 BSA 및 2 µL의 10x buffer BamH-one을 포함하는 20 µL의 선형화 반응 혼합물을 준비합니다.

반응 혼합물을 37 °C에서 2시간 40분 동안 배양합니다. 그 후, 80 °C에서 20분 동안 반응을 불활성화합니다. 잔류 원형 플라스미드에 의한 오염을 방지하기 위해 선형화된 벡터를 정제하려면, 제한효소 절단 반응 혼합물을 반준비 규모의 저융점 Agarose 겔의 메가웰(mega-well)에 로딩합니다.

리포터로 사용하기 위해 인접한 웰에 반응 혼합물 5 µL를 로딩합니다. 전극 간 전압 5 V/cm, 온도 4 °C 조건에서 DNA 전기영동을 수행합니다. 그 후 메가웰에 해당하는 아가로스 겔을 분리하여 1X TAE에 담근 채 4 °C에서 보관합니다.

분자량 마커와 리포터가 포함된 레인을 염색합니다. UV 광선 아래에서 밴드를 시각화하고, 선형화된 벡터가 위치한 지점에 표시(nick)를 합니다. UV 광선이 없는 상태에서 염색된 리포터 레인의 표시를 가이드 삼아 메가-웰(mega-well) 조각 내에서 선형화된 벡터를 찾아 절제합니다.

아가로스 겔에서 선형화된 벡터를 추출하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 겔 추출 키트로 정제합니다. 이어서 정제된 선형화된 벡터를 PCR 단편과 혼합하며, 이 DNA 혼합물을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 상용 키트로 컴피턴트 효모 세포를 형질전환시킵니다. 형질전환된 세포를 SC dropout 플레이트에 도말하고 30 °C에서 3일 동안 배양합니다.

이 분석을 준비하기 위해, SC dropout 플레이트에서 개별 콜로니를 선택하여 웰당 50 µL의 최소 배지가 들어 있는 96-웰 플레이트로 옮깁니다. 각 플레이트의 6번 열에는 내부 표준물질로서 모세포 유형을 접종합니다. 음성 대조군으로는 플라스미드가 없는 URA3 음성 ESI 내장 세포를 우라실이 보충된 SC 배지가 채워진 H-1 웰에 접종합니다.

플레이트에 뚜껑을 덮고 파라필름으로 감싼 후, 습윤 쉐이커에서 30 °C로 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후, 각 웰에 160 µL의 발현 배지를 추가하고 플레이트를 다시 밀봉합니다. 추가로 24시간 동안 더 배양합니다.

플레이트를 원심분리한 후, 액체 처리 로봇 멀티 스테이션을 사용하여 각 플레이트의 웰에서 20 µL의 상층액을 복제 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에 2 mM P-methoxybenzyl alcohol과 100 mM sodium phosphate buffer pH 6.0을 20 µL씩 첨가합니다. 96-웰 플레이트 믹서로 플레이트를 짧게 섞고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 각 복제 플레이트에 FOX 시약 160 µL를 추가하고 믹서로 짧게 섞어줍니다. 플레이트 리더를 사용하여 560 nm에서 플레이트를 읽습니다. 색이 나타날 때까지 플레이트를 실온에서 배양합니다.

흡광도를 다시 측정합니다. 상대적 활성은 각 플레이트에 대해 부모 유형(parental type)으로 정규화하여, 배양 후 흡광도 값과 초기 측정값의 차이로부터 계산합니다. 이 대표 겔 이미지는 2번 레인의 선형화된 벡터, 3번 레인의 M1 PCR 세그먼트, 4번 레인의 M2 PCR 세그먼트, 5번 레인의 HF PCR 세그먼트, 그리고 6번 레인의 NHE1으로 선형화된 in vivo 재조립 벡터를 보여줍니다.

다음 젤은 2번 레인의 재조합 벡터 플라스미드 미니-프렙(mini-prep), 3번 레인의 NHE I으로 선형화된 플라스미드, 4번 레인의 BamH I 및 Xho I으로 선형화된 플라스미드, 그리고 5번 레인의 젤 추출 및 정제를 통해 얻은 선형화된 플라스미드를 보여줍니다. 돌연변이 부하(mutational loads)는 서로 다른 랜드스케이프를 가진 돌연변이 라이브러리를 샘플링하여 모효소 활성의 10% 미만인 클론 수를 계산하고, 활성 및 비활성 변이체의 무작위 샘플을 시퀀싱하여 추가로 검증함으로써 조정되었습니다. 본 분석법의 검출 한계를 평가한 결과, 검은색 원으로 표시된 소르비톨(sorbitol) 존재 하에서 분석법이 선형성을 나타냄을 확인하였습니다.

흰색 사각형으로 표시된 소르비톨이 없는 경우, 선형성은 더 지속되었으나 반응은 더 약했습니다. AAO 농도와 흡광도 사이에서 선형 상관관계가 관찰되었습니다. 이 분석법을 사용하여 2,000개의 클론으로 구성된 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하였습니다.

음영 처리된 사각형은 P-methoxybenzyl alcohol에 대해 분비능과 활성이 현저히 개선된 AAO 변이체를 나타냅니다. 숙달되면, 적절히 수행할 경우 약 4시간 만에 변이체 라이브러리를 제작할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 단일 형질전환 단계에서 in vivo splicing 및 클로닝이 가능하도록 각 PCR 패밀리와 선형화된 벡터에 적절한 중첩 영역을 지정하는 것이 중요함을 기억하십시오.

유사한 접근 방식을 따라, 돌연변이 라이브러리 또는 대사 경로를 구축하기 위해 in vivo DNA 샘플링, 포화 돌연변이 유발 라이브러리 또는 DNA 조립과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 바이오공학 분야의 연구자들이 활성과 안정성을 탐구하거나 심지어 무한한 종류의 상호작용을 창안할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 라이브러리 구축 및 스크리닝을 위해 이 Saccharomyces Cerevisiae 장치를 활용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.