Name: 진화 방법에 감독 사카로 마이 세스 세레 비지에 : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 배우세요 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 돌연변이 라이브러리 구축 및 선별 방법을. 계산 알고리즘으로 표적 영역을 선정하고 단일 형질전환 단계로 고품질 돌연변이체를 선별하는 이 기술은 단백질 공학 연구에 필수적입니다.

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이 작업은 유럽연합 집행위원회(European Commission) 프로젝트 Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549, 비용 작용 CM1303-Systems Biocatalysis, 국가 프로젝트 Dewry [BIO201343407-R] 및 Cambios [RTC-2014-1777-3]의 지원을 받았습니다.

1. 돌연변이 라이브러리 생성 <ol><li> 선택 영역은 가능한 결정 구조 또는 상 동성 모델 (18)에 기초하여 계산 알고리즘의 도움으로 모핑을하여야한다. <ol><li> 여기에, 임의의 돌연변이와 재조합 (메트로 [α1] -Val109, Phe392 - Gln566), 고성능 PCR에 의한 유전자 (844 bp의)의 나머지를 증폭하는 동안 (그림 1)에 대한 새송이에서 AAO의 두 지역을 대상으로. 참고 : 여러 세그먼트가 독립 또는 결합 방식으로 16 모핑으로 공부하실 수 있습니다. </li></ol></li><li> 돌연변이 유발 PCR에 의해 대상 영역을 증폭. 정의 된 영역의 PCR 반응을 중첩하여 세그먼트 사이의 영역 (~ 50 bp의 각)를 중복 작성합니다. <ol><li> DNA 템플릿을 포함하는 50 μL (0.92 NG / μL), 90 나노 올리고 감각 (세그먼트 MI 세그먼트 M-II에 대한 AAO-BP에 대한 RMLN)의 최종 볼륨에서 대상 세그먼트의 돌연변이 PCR을 준비, 90 nM의 a를ntisense 프라이머 (세그먼트 M-II에 대한 세그먼트 MI 및 RMLC에 대한 AAO-92C), 0.3 밀리미터의 dNTPs (0.075 mM의 각), 3 % (v / v)의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 0.05 mM의 MnCl 2, 0.05 이 U / μL의 Taq DNA 폴리머 라제. 프라이머 서열은 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다. </li><li> 다음 PCR 프로그램을 사용하여 2 분 (1주기) 95 ° C를; 45 초, 45 초 동안 50 ° C, 45 초 동안 74 ° C (28 회) 95 ° C; 10 분 (1주기) 74 ° C. </li></ol></li><li> 초고 충실도 중합 효소와 비 돌연변이 영역을 증폭 및 돌연변이 세그먼트 및 / 또는 선형화 벡터 오버행 중복 해당 지역을 포함한다. <ol><li> 포함 된 50 μL의 최종 부피에 반응 혼합물을 준비 : DNA 템플릿 (0.2 NG / μL), 250 nM의 올리고 의미 HFF, 250 nm의 올리고 안티센스 HFR, 0.8 밀리미터의 dNTPs (0.2 mM의 각), 3 % (v / v)의 디메틸 설폭 (DMSO)와 DNA 중합 효소 iproof 0.02 U / μL. 프라이머 서열에 자세히 설명되어 &lt;강한&gt; 그림 1. </li><li> 다음 PCR 프로그램을 사용하여 30 초 (1주기) 98 ° C를; 10 초, 25 초 동안 55 ° C, 45 초 동안 72 ° C (28 회) 98 ° C; 10 분 (1주기) 72 ° C. 참고 : 1.2에 설명 된 조건 (43) BP (플라스미드-M1 영역)의 1.3 중복으로; 46 BP (M1 지역-HF 영역); 47 BP (HF 영역-M2 영역) 61 BP (M2 인 지역 플라스미드) 효모에서 생체 접합에서 선호하는 (그림 1) 설계되었습니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 겔 추출 키트 (돌연변이 및 비 돌연변이) 모든 PCR 단편을 정제 하였다. </li></ol></li><li> 약 50 염기쌍의 영역을 플 랭킹하는 것은 표적 유전자의 5&#39;- 및 3&#39;- 말단에 상동이 생성되도록 상기 벡터 선형화. <ol><li> 2 μg의 DNA, 7.5 U의 BamHI, 7.5 U을 XhoI, 버퍼 바 20 μg의 BSA 2 μl를 함유하는 선형 반응 혼합물을 제조20 μL의 최종 부피 m HI 배. </li><li> 2 시간 40 분 동안 37 ℃에서 반응 혼합물을 인큐베이션. 그 후, 20 분 동안 80 ℃에서 불 활성화를 진행합니다. </li></ol></li><li> 잔류 원형 플라스미드 (도 2)의 오염을 방지하기 위해, 아가 로스 겔 추출에 의해 선형화 된 벡터를 정제. <ol><li> 잘 기자로 인접에 반응 믹스의뿐만 아니라 나누어지는 (5 μL) : (V 승, 0.75 %) 세미 예비 저 융점 아가로 오스 겔의 메가 우물에 소화 반응 혼합물을로드합니다. </li><li> 실행 DNA 전기 영동 (전극 사이에 5 V / cm, 4 ᵒC)과 메가 웰에 해당하는 아가 로스 겔을 분리하고 1X TAE 4 ᵒC에 저장합니다. </li><li> 분자량 사다리 기자와 차선 얼룩. UV 빛 아래 밴드를 시각화합니다. 닉 위치 선형화 된 벡터 곳. 주 : 정제 선형화 된 벡터의 품질이 criti이므로칼 요인은 효모에서 성공 재조합 및 조립, 반 예비 DNA 전기 영동 젤 염색을 피하십시오. 염료 및 겔 추출 UV 노광의 사용은 생체 내 재조합 효율 저하의 DNA 벡터의 안정성에 영향을 미칠 수있다. 독성 EtBr이 염료에 대한 대안으로, 젤 빨간색과 SYBR 염료는 일반적으로 겔 염색에 사용된다. </li><li> UV 광이없는 경우,이 분리 될 수 있도록 염색 리포터 레인 닉의지도를 사용하여 메가 아니라 단편의 선형 벡터를 식별한다. </li><li> 아가로 오스에서 선형화 된 벡터를 추출하고 제조 업체의 프로토콜에 따른 상업 겔 추출 키트를 정화. 참고 : 항생제와 영양 요 마커를 사용하여 높은 복사 에피 솜 셔틀 벡터 : 우리는 효모 GAL1 프로모터의 제어하에, 우라실 독립적 인 암피실린 내성 pJRoC30 벡터를 사용이 예에서. </li></ol></li><li> 같은 몰 마일을 준비PCR을 조각의 xture과 2에서 선형화 된 벡터와 함께 혼합 : 선형화 된 플라스미드없이 100 개 미만 NG로, 1 비율 (몰 라이브러리 / 오픈 벡터의 테스트 다른 비율은 좋은 형질 전환 수율을 달성하기 위해). <ol><li> 그 농도 및 순도를 결정하기 위하여 PCR 단편을 260 nm 내지 280 nm에서 선형화 된 벡터의 흡광도를 측정한다. </li></ol></li><li> 상업적 효모 형질 전환 키트를 사용하여 DNA 혼합물로 효모 세포를 형질 전환 능력 제조업체의 지시에 따라 (공급 표 참조). <ol><li> 종속 S. - 여기서, 결핍 된 단백질 분해 효소와 URA3을 사용 cerevisiae의 변형, BJ5465. (아래 참조) 심사 중 내부 표준으로 부모의 고리 화 벡터와 세포를 변형. 또한, PCR 단편의 부재에서 선형화 된 벡터를 변환함으로써 배경을 확인한다. 주 : 저 초기 분비 수준을 검출하는 경우, S.을 사용BJ5465 같은 cerevisiae의 단백질 분해 효소 결핍 균주 배양 상층 액에서 활성 단백질의 축적을 촉진합니다. 표적 효소를 과당 질화, 글리코 실화가 결핍 된 균주의 사용을 겪는 경우 (예, 오직 작은 만노스 올리고머 부착 할 Δ의 kre2)는 적절한 선택 될 수있다. </li></ol></li><li> 접시 변환 SC 탈락 플레이트상에서 세포 및 3 일 동안 30 ° C에서 그들을 부화. 플레이트 (우라실 보충 SC 드롭 아웃 접시에) URA3 - S. 선별 음성 대조군으로 플라스미드가없는 cerevisiae의 세포 (아래 참조). </li></ol> 분석을 심사 2. 높은 처리량 (그림 3) <ol><li> 피펫 로봇의 도움으로 잘 당 50 μl의 최소한의 매체 (2,000 클론의 라이브러리를 분석하기 위해 23 판) 멸균 96 웰 플레이트의 적절한 수를 입력합니다. </li><li> 판 밖으로 SC-드롭에서 개별 식민지를 선택하고 96 웰 플레이트로 전송. <ol><li> 각 플레이트에서, 부모의 내부 표준 타입과 잘 URA3와 H1에서와 열 번호 6 접종 - S.을 음성 대조군으로 더 플라스미드 (우라실 보충 SC 매체에서) cerevisiae의 세포. 참고 : 음 H1은 우라실 보충 드롭 아웃 미디어 구체적으로 가득합니다. 세포가없는 웰 빈 함유 배지는 추가로 멸균 대조군으로서 제조 될 수있다. </li></ol></li><li> 자신의 뚜껑 접시를 덮고 파라 필름에서 그들을 포장. 습기 통에서 30 ° C에서 48 시간, 225 rpm으로 80 %의 상대 습도에 대한 번호판을 품어. </li><li> 는 파라 필름을 제거 피펫 로봇의 도움으로 각 웰에 표현 매체의 160 μl를 추가, 번호판을 봉인하고 추가로 24 시간 동안 그들을 품어. 참고 : 19 다른보고 된 최소 배지 표현 매체가 제조된다. 분비 수준 t, 따라서 연구중인 유전자에 따라 달라질 수있다그 시간은 모든 웰에서 세포 성장을 동기화 각 경우에 최적화되어야 인큐베이션. </li><li> 원심 분리기 4 ° C에서 10 분 동안 2,800 X g에서 판 (마스터 판). </li><li> 이송 로봇 멀티 스테이션 처리 액을 사용하여 레플리카 플레이트 마스터 플레이트 웰로부터 상층 액 20 μL. 참고 : 효소 분비를 선호하는 것이 일반적으로 효모에서 이종 발현 (에 사용되는 신호 펩타이드에 의해 표적 단백질의 기본 신호 펩타이드를 교체하는 것이 좋습니다 예를 들면, α 계수 prepro 리더, S.에서 K 1 킬러 독소의 지도자 세레 비지 또는 둘 펩티드 13)이라도 키메라 버전. 대안 적으로, 천연 신호 펩티드 독점적 효모 분비를 위해 전개 될 수있다. </li><li> 피펫 로봇의 도움으로 100 mM의 인산 나트륨 완충액 pH 6.0에서 2 mM의 P는 -methoxybenzylalcohol의 20 μl를 추가합니다. 96 우리 짧게 접시를 저어접시 믹서 LL RT에서 30 분 동안이를 부화. </li><li> 피펫 로봇으로, 각 복제 판에 FOX 시약 160 μl를 추가하고 잘 FOX 혼합물의 믹서 (최종 농도 짧게 저어 : 100 μM 크 실레 놀 오렌지, 250 μM 철 (NH 4) 2 (SO 4) 2 25 mM의 H 2 SO 4). <ol><li> 유기 공동 용매 (DMSO, 에탄올, 메탄올) 또는 소르비톨 (17)의 감도를 향상시키기 위해 시약에 여러 가지 첨가제를 추가합니다. 여기서, 100 밀리미터 (도 4)의 최종 농도 소르비톨을 첨가하여 반응을 증폭한다. </li></ol></li><li> 접시 리더에서 560 nm에서 플레이트 (엔드 포인트 모드, t 0)를 참조하십시오. </li><li> 색상이 개발 될 때까지 RT에서 접시를 품어 다시 (t 1) 흡수를 측정한다. <ol><li> 배양 후 애비 값의 차이에서 상대 활성을 계산하고 초기 측정의는 PARE에 정상화각 플레이트에 대한 ntal 유형 (의 Δt 1 - t 0). </li></ol></li><li> 오탐 (false positive)을 배제하기 위해 두 개의 연속 재 상영에 최적의 돌연변이 안타 대상으로 할 수 없다. 주 : 일반적으로 재 스크리닝 플라스미드 19 신선한 효모 세포를 형질 전환 한 다음, 대장균의 효모, 증폭 및 정제로부터 분리 된 플라스미드를 포함한다. 선택한 각 클론 pentaplicate에서 다시 상영된다. </li></ol>

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이 글에서, 우리는 팁과 트릭의 대부분은 S.의 감독 진화에 의해 효소를 엔지니어링하는 우리의 실험실에서 사용 요약 한 세레 비지에 (예를 들어 AAO 사용)들은 단순히 여기에 기술 된 일반적인 방법에 따라 많은 다른 진핵 효소 시스템과 함께 사용하도록 적응 될 수 있도록. 라이브러리 생성의 측면에서, 모핑 소개 (16) 변경되지 않은 단백질의 나머지 영역을 남기면서 작은 단백질 뻗어 무작위 돌연변이를 재결합하는 빠르고 한 냄비 방법입니다. 몇몇 돌연변이 부하 라이브러리는 용이하게 전체 자율적으로 복제하는 벡터를 생성하기 위해 상기 선형화 된 플라스미드와 함께 제조 및 생체 내에서 재결합 할 수있다. 중첩 서열은 추가 PCR 반응과 시험 관내 결찰 단계 회피 전체 유전자의 단편은 생체 내 재조합을 통해 조립 될 수 있도록 각각의 측면 연신하는 것이 중요하다. 이...

감독 분자 진화는 효소 1, 2를 설계 할 수있는 강력하고 빠르고 안정적인 방법입니다. 비 자연에서 새로운 반응에, 새로운 기판에 작용 무작위 돌연변이, 재조합 및 검사, 효소의 개선 된 버전을 생성 할 수의 반복 라운드를 통해 환경, 또는 새로운 대사 3-5 목표를 달성하기 위해 셀을 지원한다. 직접 진화에 사용 된 호스트 사이에서, 맥주의 효모 사카로 마이 세스 세레 비지는 원핵 생물의 대응 6,7에서, 그렇지 않으면 사용할 수없는 복잡한 진핵 세포 단백질의 기능 발현을위한 솔루션의 레퍼토리를 제공합니다. 세포 생물학 연구에 철저 사용,이 작은 진핵 모델은 직접 진화 (8)에 의해 효소를 엔지니어링하는 중요한 특성입니다 모두 번역 후 변형, 조작 및 변환 효율의 용이성 측면에서 많은 장점을 가지고있다. 또한, 고주파S.에서 상동 DNA 재조합의 효율적인 증명 판독 장치에 연결 cerevisiae의 복잡한 인공 경로 9-12에 하나의 효소는 다른 시스템의 진화를 촉진, 생체 내에서 라이브러리 생성 및 유전자 조립을위한 가능성의 다양한 열립니다. 우리 연구소는 효모에서 다른 ligninases의 분자 진화 (천연 나무 붕괴시 리그닌의 분해에 관여하는 산화 환원 효소) 13 ~ 14를위한 도구와 전략을 설계 지난 십을 보냈다. 이 통신에서 우리는 준비 S.에서 화면 돌연변이 라이브러리에 대한 자세한 프로토콜을 제시 모델 flavooxidase, 아릴 알코올 산화 효소 세레 비지에 (AAO 15) -, 즉 쉽게 많은 다른 효소로 번역 할 수있다. 효모 전지 장치 (16), 도움을 (상동 생체 그룹화에 의한 돌연변이 유발 조직 된 재조합 과정 모핑) 프로토콜은 초점 지시 진화 방법을 포함한다배양액 (17) 내로 분비 AAO 활성을 검출하기 위해 펜톤 반응을 이용한 다 민감 스크리닝 분석법.

<table><tbody><tr><td><강한>1. 배양 매체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&ordm; 50-99-7 MW 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&ordm; 17629-30-0 MW 594.51</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>효모 질소 염기(아미노산 제외)</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>효모 합성 드롭아웃 매체 보충제(우라실 제외</td>) <td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>댓글</td></tr><tr><td>2. PCR 반응</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP 믹스</td><td>애질런트 유전체학</td><td>200415-51</td><td>25 mM 각각</td></tr><tr><td>iProof High-Fidelity DNA 중합효소</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>망간(II) 염화물 사수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&ordm; 13446-34-9 M.W. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>오류용 엎드려 있는 PCR</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</strong</td><td>>코멘트</td></tr><tr><td>3. 플라스미드 선형화</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI 제한 효소</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI 제한 효소</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Not I 제한 효소</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>젤 레드</td><td>비오튬</td><td>41003</td><td>DNA 염색용</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>4. FOX 분석</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>암모늄 철(II) 황산염 육수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N&ordm; 7783-85-9 MW 392.14</td></tr><tr><td>Anysil 알코올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N&ordm; 105-13-5 MW 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N&ordm; 50-70-4 MW 182.17</td></tr><tr><td>과산화수소 30%</td><td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX 표준 곡선</td></tr><tr><td>Xylenol 오렌지 디소듐 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>52097</td><td>CAS N&ordm; 1611-35-4 MW 716.62</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>5. 아가로스 젤 스터프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>겔 레드</td><td>비오튬</td><td>41003</td><td>DNA 분석 염료</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W. 표준</td></tr><tr><td>로딩 염료 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>저융점 온도 아가로스</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N&ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>6. 키트 및 세포 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae 균주 BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC</td><td>208289 유전자형을 가진 프로테아제 결핍 균주 : MAT &alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4 :: HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue 유능 세포</td><td>Agilent genomics</td><td>200150</td><td>플라스미드 정제 및 증폭 용</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>DNA 겔 추출</td></tr><tr><td>NucleoSpin 플라스미드 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>컬럼 miniprep 키트</td></tr><tr><td>효모 변환 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>포함 DNA 운반체 (연어 고환)</td></tr><tr><td>Zymoprep 효모 플라스미드 miniprep I</td><td>Zymo research</td><td>D2001</td><td>효모에서 플라스미드 추출</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>7. 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>투명, 비멸균, 폴리스티렌(활성 측정용)</td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>투명, 멸균, 폴리스티렌(미세발효용)</td></tr><tr><td>96웰 플레이트 뚜껑</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>투명, 멸균, 폴리스티렌(미세발효용)</td></tr></tbody></table>

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

생체 내 고주파 DNA 상동 재조합에 결합 구성, 복제 및 돌연변이 라이브러리의 발현을 수반하는 처리를위한 응용 바이오 효소를 설계 할 때 사카 cerevisiae를 향하고 진화 매력적인 많은 장점을 제공한다. 여기서는 총 활성을 향상시키는 진균 아릴 알코올 산화 효소 (AAO)의 예에 기초하여 효모 및 화면 변이체 라이브러리를 제작하는 프로토콜을 제시한다. 두 단백질 세그먼트는 무작위 돌연변이에 의해 생체 내 DNA 재조합에 초점을 맞춘 지시 진화 하였다. 각 세그먼트의 측면에 50 ~ BP의 오버행 전체 자율적으로 복제하는 플라스미드에 초래하는 선형화 된 벡터에 AAO 융합 유전자의 정확한 재결합을 허용했다. 기능 AAO 변형 풍부 돌연변이 라이브러리는 S.에서 상영되었다 펜톤 반응을 이용한 고감도 높은 처리량으로 분석 cerevisiae의 상층 액. 의 일반적인 과정S.에서 라이브러리 건설 cerevisiae에 여분의 PCR 반응, 시험 관내 재조합 DNA 및 결찰 단계를 피하고, 여기에 설명 쉽게 많은 다른 진핵 유전자 발전에 적용될 수있다.

P.에서 AAO 속 eryngii는 리그닌을 공격 시작 H 2 O 2와 곰팡이 퍼 옥시다아제를 공급하는 세포 외 flavooxidase입니다. AAO의 두 세그먼트는 활성 및 S.에서의 발현을 향상시키기 위해서 모핑에 의해 집광 지향 진화 하였다 cerevisiae의 19. S.에 의해 숨겨 외국 효소에 관계없이 cerevisiae의 효모에서 돌연변이 라이브러리를 구성하는 조각과 선형화 된 벡터에 자신의 복제 사이의 접합을 선호하는 특정 중복 영역의 엔지니어링에 관한 가장 중요한 문제. 현재의 예에서, 각각의 PCR 반응에 모든 단편은 효모 생체에 접합 촉진 약 50 염기쌍의 오버행을 가지고 있었다. 세그먼트의 개수가 조립 선형화 된 벡터로 클로닝에 재조합 사건의 개수가 종속 (즉, ...

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 지향성 진화 실험을 위해 Saccharomyces Cerevisiae에서 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 어셈블리 및 클로닝 시 중첩 영역을 지정하는 방법과 같이, 집중적인 지향성 진화 실험을 위한 실험실 기반 구축 시 발생하는 주요 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단순함과 견고함에 있으며, 단 한 번의 형질전환 단계만으로도 양질의 수준을 확보할 수 있다는 점입니다.이 돌연변이 라이브러리 제작 및 스크리닝 프로토콜은 진균 aryl-alcohol oxidase(AAO)를 통해 시연될 것입니다. 집중 유도 진화를 위한 영역은 먼저 효소의 가용한 결정 구조 또는 상동성 모델을 기반으로 한 컴퓨터 알고리즘의 도움을 받아 선택합니다. AAO의 두 영역인 M1 영역과 M2 영역을 표적으로 하여 무작위 돌연변이 유발 및 재조합을 수행할 것입니다.표적 부위를 증폭하기 위해 돌연변이 유발 PCR을 수행합니다. 효모 내에서의 splicing을 촉진하기 위해, 정의된 영역들의 PCR 반응을 중첩시켜 각 세그먼트 사이에 약 50 base pairs의 중첩 영역을 생성합니다. DNA 템플릿 46 nanograms, 센스와 안티센스 프라이머 각 90 nanomolar, DNTPs 0.3 milimolar, DMSO 3%, 염화마그네슘 1.5 milimolar, 염화망간 0.5 milimolar, 그리고 tack DNA polymerase 0.5 units per microliter를 포함하는 50 microliter 부피의 돌연변이 유발 PCR 반응액을 준비합니다.다음 PCR 프로그램을 사용하십시오. 95 °C에서 2분, 95 °C에서 45초, 50 °C에서 45초, 74 °C에서 45초를 28회 반복한 후, 74 °C에서 10분간 처리합니다. AAO 유전자의 나머지 부분인 HF 영역은 돌연변이 유발 세그먼트와 겹치는 해당 영역 및/또는 선형화된 벡터 오버행이 포함된 high fidelity PCR을 통해 증폭됩니다.10 ng의 DNA 템플릿, 각 250 nM의 sense 및 antisense 프라이머, 0.8 mM의 DNTPs, 3%의 DMSO, 그리고 0.2 units/µL의 iProof ultra high-fidelity DNA polymerase를 포함하여 최종 부피 50 µL로 high-fidelity PCR 반응액을 준비합니다. 다음과 같은 PCR 프로그램을 사용합니다: 98 °C에서 30초, 98 °C에서 10초, 55 °C에서 25초, 72 °C에서 45초를 28회 반복한 후, 72 °C에서 10분간 처리합니다.그런 다음 모든 PCR 단편을 제조사의 프로토콜에 따라 상용 젤 추출 키트로 정제합니다. 다음 단계는 벡터를 선형화하여 표적 유전자의 5' 말단 및 3' 말단과 상동성을 갖는 약 50 bp의 플랭킹 영역을 생성하는 것입니다. 2 µg의 DNA, 7.5 units의 BamH-one, 7.5 units의 XHO-one, 20 µg의 BSA 및 2 µL의 10x buffer BamH-one을 포함하는 20 µL의 선형화 반응 혼합물을 준비합니다.반응 혼합물을 37 °C에서 2시간 40분 동안 배양합니다. 그 후, 80 °C에서 20분 동안 반응을 불활성화합니다. 잔류 원형 플라스미드에 의한 오염을 방지하기 위해 선형화된 벡터를 정제하려면, 제한효소 절단 반응 혼합물을 반준비 규모의 저융점 Agarose 겔의 메가웰(mega-well)에 로딩합니다.리포터로 사용하기 위해 인접한 웰에 반응 혼합물 5 µL를 로딩합니다. 전극 간 전압 5 V/cm, 온도 4 °C 조건에서 DNA 전기영동을 수행합니다. 그 후 메가웰에 해당하는 아가로스 겔을 분리하여 1X TAE에 담근 채 4 °C에서 보관합니다.분자량 마커와 리포터가 포함된 레인을 염색합니다. UV 광선 아래에서 밴드를 시각화하고, 선형화된 벡터가 위치한 지점에 표시(nick)를 합니다. UV 광선이 없는 상태에서 염색된 리포터 레인의 표시를 가이드 삼아 메가-웰(mega-well) 조각 내에서 선형화된 벡터를 찾아 절제합니다.아가로스 겔에서 선형화된 벡터를 추출하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 겔 추출 키트로 정제합니다. 이어서 정제된 선형화된 벡터를 PCR 단편과 혼합하며, 이 DNA 혼합물을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 상용 키트로 컴피턴트 효모 세포를 형질전환시킵니다. 형질전환된 세포를 SC dropout 플레이트에 도말하고 30 °C에서 3일 동안 배양합니다.이 분석을 준비하기 위해, SC dropout 플레이트에서 개별 콜로니를 선택하여 웰당 50 µL의 최소 배지가 들어 있는 96-웰 플레이트로 옮깁니다. 각 플레이트의 6번 열에는 내부 표준물질로서 모세포 유형을 접종합니다. 음성 대조군으로는 플라스미드가 없는 URA3 음성 ESI 내장 세포를 우라실이 보충된 SC 배지가 채워진 H-1 웰에 접종합니다.플레이트에 뚜껑을 덮고 파라필름으로 감싼 후, 습윤 쉐이커에서 30 °C로 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후, 각 웰에 160 µL의 발현 배지를 추가하고 플레이트를 다시 밀봉합니다. 추가로 24시간 동안 더 배양합니다.플레이트를 원심분리한 후, 액체 처리 로봇 멀티 스테이션을 사용하여 각 플레이트의 웰에서 20 µL의 상층액을 복제 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에 2 mM P-methoxybenzyl alcohol과 100 mM sodium phosphate buffer pH 6.0을 20 µL씩 첨가합니다. 96-웰 플레이트 믹서로 플레이트를 짧게 섞고 실온에서 30분 동안 배양합니다.다음으로, 각 복제 플레이트에 FOX 시약 160 µL를 추가하고 믹서로 짧게 섞어줍니다. 플레이트 리더를 사용하여 560 nm에서 플레이트를 읽습니다. 색이 나타날 때까지 플레이트를 실온에서 배양합니다.흡광도를 다시 측정합니다. 상대적 활성은 각 플레이트에 대해 부모 유형(parental type)으로 정규화하여, 배양 후 흡광도 값과 초기 측정값의 차이로부터 계산합니다. 이 대표 겔 이미지는 2번 레인의 선형화된 벡터, 3번 레인의 M1 PCR 세그먼트, 4번 레인의 M2 PCR 세그먼트, 5번 레인의 HF PCR 세그먼트, 그리고 6번 레인의 NHE1으로 선형화된 in vivo 재조립 벡터를 보여줍니다.다음 젤은 2번 레인의 재조합 벡터 플라스미드 미니-프렙(mini-prep), 3번 레인의 NHE I으로 선형화된 플라스미드, 4번 레인의 BamH I 및 Xho I으로 선형화된 플라스미드, 그리고 5번 레인의 젤 추출 및 정제를 통해 얻은 선형화된 플라스미드를 보여줍니다. 돌연변이 부하(mutational loads)는 서로 다른 랜드스케이프를 가진 돌연변이 라이브러리를 샘플링하여 모효소 활성의 10% 미만인 클론 수를 계산하고, 활성 및 비활성 변이체의 무작위 샘플을 시퀀싱하여 추가로 검증함으로써 조정되었습니다. 본 분석법의 검출 한계를 평가한 결과, 검은색 원으로 표시된 소르비톨(sorbitol) 존재 하에서 분석법이 선형성을 나타냄을 확인하였습니다.흰색 사각형으로 표시된 소르비톨이 없는 경우, 선형성은 더 지속되었으나 반응은 더 약했습니다. AAO 농도와 흡광도 사이에서 선형 상관관계가 관찰되었습니다. 이 분석법을 사용하여 2,000개의 클론으로 구성된 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하였습니다.음영 처리된 사각형은 P-methoxybenzyl alcohol에 대해 분비능과 활성이 현저히 개선된 AAO 변이체를 나타냅니다. 숙달되면, 적절히 수행할 경우 약 4시간 만에 변이체 라이브러리를 제작할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 단일 형질전환 단계에서 in vivo splicing 및 클로닝이 가능하도록 각 PCR 패밀리와 선형화된 벡터에 적절한 중첩 영역을 지정하는 것이 중요함을 기억하십시오.유사한 접근 방식을 따라, 돌연변이 라이브러리 또는 대사 경로를 구축하기 위해 in vivo DNA 샘플링, 포화 돌연변이 유발 라이브러리 또는 DNA 조립과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 바이오공학 분야의 연구자들이 활성과 안정성을 탐구하거나 심지어 무한한 종류의 상호작용을 창안할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 라이브러리 구축 및 스크리닝을 위해 이 Saccharomyces Cerevisiae 장치를 활용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

thermostability 공학 분야에 해당 소설 감독 진화 방법은 bacteriolytic 효소 용으로 개발하고 결과적으로 확인되었습니다. 고온의 부화 후 야생 형 단백질에 비해 무작위 mutagenesis의 한 라운드, 발전 bacteriolytic 효소, PlyC 29C3는 두 번 잔류 활동보다 더 큰 표시 한 후.

내열 Bacteriolytic 효소의 감독 진화에 대한 새로운 검사 방법

이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

선물이 분열에 간단한 억압 화면 프로토콜 효 모. 이 방법은 효율적, 돌연 무료이 고 단일 게놈 소재 시에 자주 발생 하는 돌연변이 대 한 선택적입니다.  프로토콜은 진압 완화 돌연변이 또는 약물에 의해 발생 하는 액체 문화에서 성장 결함 격리 적합 합니다.

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

새로운 서열 특이성을 가진 제한 endonucleases는 부분적으로 퇴화한 서열을 인식하는 효소로부터 개발될 수 있다. 여기에서 우리는 우리가 성공적으로 NlaIV 효소의 순서 특이성을 바꾸기 위하여 이용된 상세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜의 주요 성분은 전사/번역 반응의 생체외 구획화 및 새로운 서열 특이성을 가진 변이체의 선택이다.

더 엄격한 특이성을 가진 제한 endonuclease의 시험관 진화

이 연구는 Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 유전자 스크리닝을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스크린은 게놈 전체 플라스미드 라이브러리를 사용하여 질의 돌연변이 균주와 관련된 기능 상실 표현형의 억제인자 클론(들)을 식별합니다. ell1 null 돌연변이체의 신규한 유전자 억제인자를 이 스크린을 사용하여 확인하였다.

Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자의 식별을위한 유전자 스크리닝

단백질-단백질 상호 작용과 같은 생체 분자의 상호 작용은 생물학적 기능의 분자 기초입니다. 특별히 관련 상호작용이 없는 상호작용 null/손상된 돌연변이를 분리할 수 있다면, 이 상호작용의 기능을 이해하는 데 크게 도움이 될 것입니다. 이 문서에서는 interaction-null/impaired mutant를 격리하는 효율적인 방법을 제시합니다.

Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

이 프로토콜은 관심 항원에 결합하는 단백질 변이체를 풍부하게 하기 위해 효모 표면 디스플레이 선택 캠페인을 수행하기 위한 필수 단계를 설명합니다.

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

배우세요 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 돌연변이 라이브러리 구축 및 선별 방법을. 계산 알고리즘으로 표적 영역을 선정하고 단일 형질전환 단계로 고품질 돌연변이체를 선별하는 이 기술은 단백질 공학 연구에 필수적입니다.

진화 방법에 감독

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