진화 방법에 감독 사카로 마이 세스 세레 비지에 : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

이 프로토콜의 전반적인 목표는 유도 진화 실험을 위해 Saccharomyces Cerevisiae에서 돌연변이 라이브러리를 구성하고 스크리닝하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 어셈블리 및 복제에서 겹치는 영역을 할당하는 방법과 같은 집중적인 지시 진화 실험을 위한 실험실 생성 사용의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단 한 번의 변환 단계에서 좋은 품질의 수준을 할당할 수 있기 때문에 단순성과 견고성입니다.

돌연변이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 이 프로토콜은 진균 아릴-알코올 산화효소 또는 AAO에 대해 시연될 것입니다. 집중된 지시 진화를 위한 영역은 사용 가능한 결정 구조 또는 효소의 상동성 모델을 기반으로 하는 계산 알고리즘의 도움으로 먼저 선택됩니다. AAO의 두 영역, 즉 M1 영역과 M2 영역이 무작위 돌연변이 유발 및 재조합을 대상으로 합니다.

표적 부위를 증폭하기 위해 돌연변이유발 PCR을 수행합니다. 효모에서 생체 내 스플라이싱을 촉진하기 위해, 정의된 영역의 PCR 반응을 중첩하여 각각 약 50개의 염기쌍 세그먼트 사이에 겹치는 영역이 생성됩니다. 각각 46나노그램의 DNA 템플릿, 90나노몰의 센스 및 안티센스 프라이머, 0.3 밀리몰의 DNTP, 3%의 DMS, 1.5 밀리몰의 염화마그네슘, 05 밀리몰의 염화망간 및 05 단위의 압정 DNA 중합효소를 각각 포함하는 50 마이크로리터 용량의 돌연변이유발 PCR을 준비합니다.

다음 PCR 프로그램을 사용하십시오. 섭씨 95도에서 2분, 섭씨 95도에서 45초, 50도에서 45초, 74도에서 45초, 28사이클에서 45초, 74도에서 10분. AAO 유전자의 나머지 부분인 HF 영역은 돌연변이 유발 분절과 겹치는 해당 영역 및(또는 선형화된 벡터 돌출부) 포함과 함께 고충실도 PCR에 의해 증폭될 것입니다.

DNA 템플릿 10나노그램, 센스 및 안티센스 프라이머 각각 250나노몰, DNTP 0.8밀리몰, DMSO 3%, iProof 초고충실도 DNA 중합효소 마이크로리터당 02단위를 포함하는 50마이크로리터의 최종 부피에서 고충실도 PCR을 준비합니다. 다음 PCR 프로그램을 사용합니다. 섭씨 98도는 30초, 섭씨 98도는 10초, 섭씨 55도는 25초, 72도는 45초 동안 28도, 72도는 10분입니다.

그런 다음 모든 PCR 단편은 제조업체의 프로토콜에 따라 상업용 겔 추출 키트로 정제됩니다. 다음 단계는 벡터를 선형화하여 표적 유전자의 5개의 프라임 및 3개의 프라임 말단과 상동성인 약 50개의 염기쌍의 측면 영역을 만드는 것입니다. DNA 2마이크로그램, BamH-one 7.5 단위, XHO-one 7.5 단위, BSA 20 마이크로그램 및 10x 버퍼 BamH-one 2마이크로리터를 포함하는 20 미코리터 선형화 반응 혼합물을 준비합니다.

반응 혼합물을 섭씨 37도에서 2시간 40분 동안 배양합니다. 그 후, 섭씨 80도에서 20분 동안 반응을 비활성화합니다. 선형화된 벡터를 정제하여 잔류 원형 플라스미드로 인한 오염을 방지하려면 분해 반응 혼합물을 반분취 저융점 아가로스 겔의 메가 웰에 로드합니다.

5마이크로리터의 반응 혼합물을 인접한 우물에 리포터로 로드합니다. 섭씨 4도에서 전극 사이에 센티미터당 5볼트에서 DNA 전기영동을 실행합니다. 그런 다음 메가 웰에 해당하는 아가로스 겔을 분리하고 1개의 XTAE에 섭씨 4도에서 보관합니다.

분자량 사다리와 기자로 레인을 더럽힙니다. UV 광선 아래에서 밴드를 시각화하고 선형화된 벡터가 배치되는 위치에 흠집을 냅니다. 자외선이 없고 stained reporter lane에 있는 nicks의 안내를 사용하여 mega-well fragment에서 선형화된 벡터를 식별하고 절제합니다.

Agarose에서 선형화된 벡터를 추출하고 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 겔 추출 키트로 정제합니다. 그 후, 정제된 선형화된 벡터를 PCR 단편과 혼합하고 이 DNA 혼합물을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 적격 효모 세포를 형질전환시키는 데 사용합니다. 형질전환된 세포를 SC 드롭아웃 플레이트에 플레이트화하고 섭씨 30도에서 3일 동안 배양합니다.

이 분석을 준비하기 위해 SC 드롭아웃 플레이트에서 개별 콜로니를 선택하고 웰당 50마이크로리터의 최소 배지를 포함하는 96개의 웰 플레이트로 옮깁니다. 각 플레이트에서 6번 열을 내부 표준으로 Parent Type을 접종합니다. 음성 대조군으로, 우라실이 보충된 SC 배지로 채워진 H-one에 플라스미드가 없는 URA3 음성 ESI 내장 세포를 접종합니다.

접시를 뚜껑으로 덮고 파라 필름으로 싸서 습한 셰이커에서 섭씨 30도에서 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후 각 웰에 160마이크로리터의 발현 배지를 추가하고 플레이트를 다시 밀봉합니다. 24시간 더 배양합니다.

플레이트를 원심분리한 후 액체 처리 로봇 멀티 스테이션을 사용하여 각 플레이트의 웰에서 복제 플레이트로 20마이크로리터의 상층액을 이송합니다. 20마이크로리터의 2밀리몰 P-메톡시벤질 알코올과 100밀리몰의 인산나트륨 완충액 ph 6.0을 각 웰에 추가합니다. 96웰 플레이트 믹서로 플레이트를 잠시 저어주고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 각 복제 플레이트에 160마이크로리터의 FOX 리간트를 추가하고 믹서로 잠시 저어줍니다. 플레이트 리더에서 560나노미터로 플레이트를 판독합니다. 색이 발현될 때까지 실온에서 플레이트를 배양합니다.

흡수를 다시 측정하십시오. 상대적 활성은 배양 후 흡수 값과 각 플레이트에 대한 부모 유형으로 정규화된 초기 측정 값의 차이에서 계산됩니다. 이 대표적인 겔 이미지는 2열의 선형화된 벡터, 3열의 M1 PCR 세그먼트, 4열의 M2 PCR 세그먼트, 5열의 HF PCR 세그먼트 및 6열의 NHE 1로 선형화된 생체 내 재조립 벡터를 보여줍니다.

다음 겔은 2열에서 재조립된 벡터의 플라스미드 미니 프렙, 3열에서 NHE 1로 선형화된 플라스미드, 4열에서 BamH 1 및 XHO 1로 선형화된 플라스미드, 5열에서 겔 추출 및 클린업으로 얻은 선형화된 플라스미드를 보여줍니다. 돌연변이 부하는 서로 다른 지형을 가진 돌연변이 라이브러리를 샘플링하고, 부모 효소 활성이 10% 미만인 클론 수를 계산하고, 활성 및 비활성 변이체의 무작위 샘플을 시퀀싱하여 추가 검증을 통해 조정되었습니다. 이 분석법의 검출 한계에 대한 평가는 분석이 검은색 원으로 표시되는 소르비톨의 존재 하에서 선형임을 보여주었습니다.

흰색 사각형으로 표시되는 소르비톨이 없는 경우 선형성은 더 지속적이었지만 반응은 더 약했습니다. AAO 농도와 흡광도 사이에 선형 상관관계가 관찰되었습니다. 2, 000 클론의 돌연변이 라이브러리가 구축되고 이 분석으로 스크리닝되었습니다.

음영 사각형은 P-메톡시벤질 알코올에 대한 분비 및 활성이 현저하게 개선된 AAO 돌연변이를 나타냅니다. 일단 마스터되면 돌연변이 라이브러리는 제대로 수행되면 약 4시간 안에 만들 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 단일 형질전환 단계에서 in vivo 스플라이싱 및 클로닝을 위해 각 PCR 제품군과 선형화된 벡터에 대해 적절한 중첩 영역을 할당하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

유사한 접근법에 따라, 돌연변이 라이브러리 및/또는 대사 경로를 구축하기 위해 생체 내 DNA 샘플링, 포화 돌연변이 유발 라이브러리 또는 DNA 조립과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생명 공학 분야의 연구자들이 활동, 안정성을 탐구하거나 무한한 종류의 상호 작용을 발명할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 도서관 건설 및 스크리닝을 위해 이 Saccharomyces Cerevisiae 장치를 활용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다