Name: 효모 콜로니 임베딩 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 학습하세요 효모 콜로니 임베딩 방법으로 광학 및 전자현미경을 위한 단면분석을 수행하는 기술입니다. 포자형성 및 의사균사세포의 분포를 시각화하여 진균 군집의 세포 조직화를 연구할 수 있습니다.

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연구는 NIH에 의해 투자 1R15GM094770했다.

1. 콜로니 분리 및 고정 <ol><li> 표시된 시간을 한천 배지에 300 식민지 (격리 식민지가 직경 1~2mm한다) 알을 품다. </li><li> 콜로니 (얼굴까지)와 좁은 주걱을 사용하여 기본 매체를 제거합니다. </li><li> 2 % 한천의 여러 방울을 플레이스 42 ° C가 굳은 한천 전에 얼굴 1 ML pipetman 팁 즉시 장소 식민지를 사용하여 현미경 슬라이드에. </li><li> 42 ° C 식민지에서 2 % 한천의 여러 방울을 넣고 응고 수 있습니다. </li><li> 이 프로토콜의 나머지 부분을 통해 모든 단계에 대한 장갑을 착용 </li><li> 트림 면도날로 블록과 4에서 7 일 동안 2 % paraformaldehyde / 2 % 글루 타 알데히드 정착액을 포함하는 3.5 ML borosilicate 나사 캡 병에 넣어 ° C. </li></ol> 2. 세척 및 오스뮴 트리 트먼트 <ol><li> 약 1 주 후, 완전히 동일한 볼륨 5 분 후 식민지 (약 1.5 ML) 두 번 이상을 감추기에 충분 할만큼 0.15M 나트륨 cacodylate (산도 7.2)로 15 분 동안 두 번 잠복기에 의해 화학 퓸 후드 아래에 얼음 한천 블록을 씻어 1X OS 버퍼 (100 MM KH 2 PO 4 10 MM MgCl 2, 산도 6.0). </li><li> 1 시간 동안 화학 퓸 후드 아래에있는 한천 블록을 커버하기 위해 1% 오소 4의 같은 볼륨 [2 ML 오소 4 (2 %) + 2 ML 2X OS 버퍼] 튜브로 (얼음) 추가 후 같은 양의 두 번 씻어 십분 각 1X OS 버퍼. </li><li> 4 튜브가 하룻밤 사이에 남겨 ° 1X 운영 체제 버퍼에 C. </li><li> 정착액이 단계의 모든 세척은 유해 폐기물로 폐기됩니다. 오소 네를 포함한 모든 pipettes은 식물성 기름과 함께 배 씻어서되었습니다. </li></ol> 3. 씻고 탈수 <ol><li> 십분 파스퇴르 피펫을 사용하여 각각에 대해 차가운​​ 물 위의 동일한 볼륨 두 번 얼음 다음날 아침 와시 한천 차단합니다. </li><li> 25 % 동일한 볼륨, 50 %, 75 % 10 분 10 분 100 % 에탄올 2 세척하여 다음 각 95 % 에탄올로 순차적으로 씻으십시오. 4 박 남겨 ° C 100 % 에탄올 인치 </li><li> 이 단계의 모든 세척은 유해 폐기물로 폐기됩니다. </li></ol> 4. 스퍼의 준비 <ol><li> 다음날 아침 (최대한 빨리)은 스퍼의 시약을 준비 퓸 후드 아래 일회용 플라스틱 비커에 다음 솔루션을 (EM 과학)의 무게. 이 시약을 사용하는 모든 후속 작업 들어, 퓸 후드를 사용하여 계속 진행합니다. (ERL 4,221 솔루션 5g) (DER 736 솔루션 4g) (NSA 솔루션 13g) </li><li> 저어 막대를 사용하여 모자에 20 분 이러한 솔루션 (천천히) 믹스 </li><li> DMAE 솔루션에게 0.15 그램을 추가하고 위의 20 분 저어. </li><li> 모자에 1-2 시간에 대한 데가스 상기 혼합물. </li></ol> 5. 스퍼의 침투 <ol><li> 스퍼의 위의 십분 각각에 대해 100 % 객실 임시 에탄올의 동일 볼륨 한천 블록에게 5 번 씻어 만든 마자. 마지막으로 에탄올 세척 후 남아있는 에탄올 그냥 한천 블록을 커버하므로 파스퇴르 피펫을 사용하여 에탄올을 제거합니다. </li><li> 스퍼의 시약 (약 0.5 ML)의 약 동일한 금액을 추가하고 30 분 동안 서있게 다음 실온에서 15 분 동안 바퀴에 튜브를 회전합니다. 30 분 완전히 파스퇴르 피펫을 사용하여 솔루션을 제거한 후에 추가 스퍼는 한천 블록 (약 1.5 ML)를 커버하는이야, 실온에서 15 분 동안 바퀴에 튜브를 회전하고 30 분 동안 서있게합니다. 스퍼의 교체, 회전, 그리고 부화 3 번 이상 반복합니다. </li><li> 마지막 30 분 후에, 스퍼의 시약을 제거하고 블록을 충당하기 위해 새로운 스퍼의를 추가합니다. 한천 블록 4 시간에 대한 온도는 실온에 서 수 있습니다. </li><li> 스퍼의를 교체하고 하룻밤 회전. </li><li> 아침에 스퍼의를 교체하고 다음 날까지 회전 둡니다. </li><li> 다음날 아침 플레이스 스퍼는 다음 금형의 하단 커버 금형에 한천 블록을 추가하는 번호의 실리콘 금형 (피셔 과학)에 있어요. 4 시간 동안 60 ° C에서 알을 품다 </li><li> 더 많은 스퍼이고, 부화 60 ° C 하룻밤에있는 금형에서 맨 후 4 시간,. </li><li> 금형에서 블록을 제거 후 블록 아직도 약간 유연 경우, 금형으로 돌아가 추가 이일 품어 </li></ol> 6. Sectioning <ol><li> Leica Ultracut S 마이크로톰는 가벼운 현미경과 0.1 μ 전송 EM을위한 얇은 섹션 0.5 μ 두꺼운 부분을 절단하는 데 사용되었다. </li><li> 섹션 컷 것처럼 가벼운 현미경 들어, 그들은 DH 2 O의 드롭에 게재되었고, 52 ° C 열 블록에 건조. 말린 섹션은 다음 1.0 % toluidine 파랑, 5~15초 1 %의 나트륨 Borate의 드롭 물들일되었습니다. 얼룩 후 섹션은 즉시 물의 흐름에 따라 씻어 건조, 설치 미디어 (KPL)에서 설명하고 커버 용지는 샘플을 통해 봉인했다. </li></ol> 효모 및 기타 미생물의 패턴 형성을 측정하는 광범위한 관련는 이전에 다음 ID로 한 검토되었습니다. 특히주의의 분열 사회에 대한 상대 조직 미생물 식민지의 증가 기능입니다. 설명한 방법은 큰 전문 식민지 2 삽입하는 방법의 변경이며, 우리의 수정에 대한 간단한 설명 3 게시되었습니다. 야생 S.의 식민지의 중심을 통해 섹션의 가벼운 현미경의 예 cerevisiae 효모 콜로니는 그림 1에 표시됩니다. Asci, pseudohyphae 및 난형 효모 쉽게 구별할 수 있으며, 기본 한천을 침해 식민지의 지역도 분명 있습니다. 효모의 실험실 스트레인 (W303 배경)의 전자 현미경의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이미지 sporulated 세포의 높은 주파수를 포함하고있는 식민지의 영역에서이다. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 야생 효모 식민지의 빛 현미경. 이 효모 (YPS133)는 나무 exudates 4 최근에 고립되었다. 식민지 전에 sectioning에 YNA 중간 5 6 일간 incubated했다. 오픈 화살표가 가득한 화살촉은 길쭉한 세포의 체인 (pseudohyphae)와 asci를 나타내는, 채워진 화살표 대표 난형의 식물 세포를 나타냅니다, 대표 asci를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 실험실 효모 스트레인의 전자 현미경. SH1020 (W303 배경)의 식민지는 3 sectioning하기 전에 YNA 매체에서 6 일간 incubated했다. 이미지 asci 높은 주파수 부분의 영역을 보여줍니다. 화살표는 포자 벽의 이중 계층 구조를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 식민지 sporulated 세포의 배포판의 부량 : A)는 자신의 긴 쪽 함께 스택 15 인접한 사각형을 포함하는 격자는 식민지 섹션의 이미지의 중심 지역에 겹쳐있다. 의 비율이 지속적으로 유지하면서 그리드는 단지 식민지의 상단과 하단을 포함하기 위해, 크기를 조정합니다. (B &amp; C)는 직사각형의 전체 세포에 상대적으로 각 사각형의 sporulated 세포의 분율은 4 일 이전 (B)과 8 일 이전 (C) 식민지에서 이미지의 육안 검사에 의해 결정됩니다. 예를 들어, 식민지의 상단에있는 직사각형은 ( "1"표시) 그래프의 왼쪽에 해당합니다. 4 식민지의 뜻이 나타납니다, 오차 막대는 표준을 표시합니다. 오류가 발생했습니다.

<ol><li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+symmetries%3A+regulation+of+Dictyostelium+development+through+chemoattractant+and+morphogen+signal-response%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response.</a> Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).</li>
<li>Palkova, Z., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+within+a+community%3A+benefit+to+yeast+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Life within a community: benefit to yeast long-term survival.</a> FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significances+of+bacterial+colony+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The significances of bacterial colony patterns.</a> Bioessays. 17, 597-597 (1995).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).</li>
<li>Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+stalk-like+structures+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).</li>
<li>Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+analysis+of+Saccharomyces+cerevisiae+stalk-like+structures+reveals+spatial+organization+and+cell+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization.</a> J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).</li>
<li>Piccirillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+pathway+and+alkaline+pH+regulate+pattern+formation+in+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies.</a> Genetics. 184, 707-707 (2010).</li>
<li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).</li>
<li>Piccirillo, S., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+patterning+and+invasive+growth+in+wild+and+domesticated+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies.</a> Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).</li>
<li>Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environ Microbiol. , (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

제출 방법은 식민지의 내부 구조를 보여준다. 방법은 S.의 범위의 셀 유형의 패턴을 결정하는 효과가 있기 때문에 다른 콜로니 morphologies로 cerevisiae의 변종, 또한 관련 종 S. paradoxus 5, 방법은 곰팡이와 다른 미생물의 다양한에서 작동 가능성이 높습니다. 방법의 성공을 위해 한 중요한 단계는 식민지의 상단을 포함한 전체 식민지는, 프로토콜에 걸쳐 한천으로 쌌다는 것을 보장하는 것입니다. 식민지 한천 완전히 쌌다 여부는 toluidine과 청색의 빛을 현미경과 얼룩에 대한 sectioning 후 결정하실 수 있습니다. 얼룩진 부분이 빛을 현미경으로 볼 때, 한천 배지는 포함 매체보다 약간 어두운 얼룩이다. dehydrations 단계 중에 한천 축소, 전체 식민지를 복구하기 위해서는 반드시 그 이유는 1) 안정 단계 1.2의 식민지를 충당하기 위해 한천의 4-5 방울을 추가하고, 2)하지에 오직...

<table><tbody><tr><td>사산화오스뮴(Osmium tetroxide)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19152</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 임베딩 몰드</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC 9975029</td><td></td></tr><tr><td>지환족 에폭사이드 수지</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15004</td><td>ERL 4221</td></tr><tr><td>에폭시 수지</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13000</td><td>DER 736</td></tr><tr><td>노네닐 숙신산 무수물</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19050</td><td>NSA</td></tr><tr><td>2-Dimethyl amin&amp;#8211;thanol</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13300</td><td>DMAE</td></tr><tr><td>마운팅 매질</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>회전 휠</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Pelco 1055</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰</td><td>Leica Microsystems</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr></tbody></table>

효모 콜로니 임베딩 방법

Yeast Colony Embedding Method

배아 다른 세포 유형의 Patterning는 metazoan 개발에 중요한 메커니즘입니다. 이러한 식민지와 biofilms과 같은 미생물의 커뮤니티는 세포 유형의 패턴을 표시합니다. 예를 들어, 효모의 S. cerevisiae는 sporulated 세포 pseudohyphal 세포 균일 식민지에서 배포되지 않습니다. patterning 이러한 패턴을 기초 분자 메커니즘의 기능 중요성은 아직도 제대로 이해하고 있습니다. 곰팡이 식민지의 세포 유형의 패턴을 조사에 관한 한 과제는 metazoan 조직과는 달리, 식민지의 세포가 상대적으로 약하게 서로 연결된 것입니다. 특히, 곰팡이 식민지는 대부분의 조직에서 발견 세포외 기질 같은 광범위한 수준을 포함​​하지 않습니다. 여기이 식민지에서 세포 유형의 내부 패턴을 보여줍니다 효모 식민지를 포함하고 sectioning하는 방법에 대한 리포트입니다. 방법은 가벼운 현미경 및 전송 전자 현미경에 적합한 얇은 섹션 (0.1 μ)에 유용 (0.5 μ) 두꺼운 부분을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 세포의 내부 구조가 EM으로 시각 수 있지만 Asci과 pseudohyphal 세포는 쉽게, 가벼운 현미경으로 난형의 효모 세포를 구분할 수 있습니다. 방법은 한천과 식민지를 둘러싼 스퍼의 중간 그들을 침투하고, 다음 sectioning을 기반으로합니다. 1~2mm의 범위에있는 직경이 식민지는이 프로토콜에 적합합니다. 식민지의 내부를 시각화뿐만 아니라, 방법은 기본 한천을 침공 식민지 지역의 시각화 수 있습니다.

빛과 전자 현미경에 대한 sectioning 수 있도록 효모 식민지를 포함하는 방법. 이 프로토콜은 곰팡이 지역 사회 내에서 세포 유형의 조직을 이해하는 방향으로 새로운 도구를 제공하는 식민지 이내 sporulated 세포 pseudohyphal 세포의 분포의 결정 수 있습니다.

배아 내 서로 다른 세포 유형의 패턴 형성은 후생동물 발생의 핵심 기전입니다. 군집 및 바이오필름과 같은 미생물 군집은...

이 절차의 전반적인 목표는 효모 콜로니를 임베딩하는 것입니다. 이는 먼저 한천 배지에서 콜로니와 그 아래의 한천을 제거하여, 이를 녹은 한천 방울 위에 올린 후 빠르게 더 많은 녹은 한천으로 덮음으로써 달성됩니다. 그다음, 몰드에 들어갈 수 있을 만큼 크기를 줄이기 위해 콜로니 주변의 과잉 한천을 다듬어 냅니다.그 후 AER 임베딩 콜로니를 고정, 염색, 탈수하고 최종적으로 spurs 레진으로 침투시킵니다. 해당 블록을 추가 spurs 레진이 담긴 몰드에 넣고 경화될 때까지 배양한 후 절편을 제작합니다. 최종적으로 광학 현미경 또는 전자 현미경을 통해 효모 콜로니 내 세포 유형의 분포를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.주사전자현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 군집의 내부 구조를 파악할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 군집 내 세포 유형의 분포와 같이 미생물 발달 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 croce CAC 군집의 구조에 대한 통찰을 제공하였으나, 다른 미생물에도 적용 가능할 것으로 보입니다.군락(colony)의 취급 및 임베딩은 서면 프로토콜만으로는 학습하기 어려울 수 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 방법은 포자가 군락 내에 균일하게 분포하지 않는다는 점을 시사한 2002년의 유전 데이터 발표에서 영감을 얻었습니다. 저희는 Fin 연구실의 Engelberg가 개발한 군락 절편 제작 방법을 응용하였습니다.그럼 시작해 보겠습니다. 먼저 Wild S visi 효모를 30 °C의 auger 플레이트에서 약 300개의 콜로니가 생성될 때까지 배양하십시오. 좁은 스파툴라를 사용하여 지름 1~2 mm의 콜로니를 플레이트에서 하나씩 제거합니다.그 다음, 1 mL 피펫 팁을 사용하여 42 °C의 2% agar를 현미경 슬라이드 위에 몇 방울 떨어뜨리고, AER이 굳기 전에 즉시 콜로니를 agar 면이 위로 향하게 하여 올려놓습니다. 콜로니 위에 agar를 몇 방울 더 추가하고 agar가 굳을 때까지 기다려, 콜로니의 상단을 포함한 전체가 agar에 완전히 둘러싸이도록 합니다. 이후의 모든 프로토콜 단계에서는 면도날을 사용합니다.콜로니 주변의 AER을 다듬고, 콜로니가 포함된 AER 블록을 2% 파라포름알데히드와 2% 글루타르알데히드 고정액이 들어 있는 3.5 mL 붕규산 유리 스크류 캡 바이알에 넣습니다. 건조를 방지하기 위

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연구

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Biology

생물학

여기에 침묵 교미 loci HML과 HMR에서 형광등 기자 적용 성장 고정화 효모 세포의 시각화에 대한 신속한...

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학습하세요 효모 콜로니 임베딩 방법으로 광학 및 전자현미경을 위한 단면분석을 수행하는 기술입니다. 포자형성 및 의사균사세포의 분포를 시각화하여 진균 군집의 세포 조직화를 연구할 수 있습니다.

효모 콜로니 임베딩 방법

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