효모 콜로니 임베딩 방법

이 절차의 전반적인 목표는 효모 군체를 포함하는 것입니다. 이것은 먼저 한천 플레이트에서 군체와 밑에 있는 한천을 제거하고, 용융된 한천 몇 방울에 놓고 더 많은 용융된 한천으로 빠르게 덮음으로써 수행됩니다. 다음으로, 여분의 AER을 군체에서 잘라내어 주형에 들어갈 수 있을 만큼 작게 만듭니다.

그런 다음 AER에 내장된 콜로니는 고정, 염색, 탈수되고 최종적으로 스퍼 수지로 침투됩니다. 그런 다음 블록은 경화될 때까지 배양된 추가 스퍼 수지가 있는 주형에 배치된 다음 절단됩니다. 궁극적으로, 빛 또는 전자 현미경을 통해 효모 군집 내의 세포 유형 분포를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

주사 전자 현미경과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 군체의 내부 구조를 결정할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 군집 내 세포 유형의 분포와 같은 미생물 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 크로체 CAC 군체의 구조에 대한 통찰력을 제공했지만 다른 미생물에도 적용할 수 있을 가능성이 높습니다.

이 방법의 시각적 시연은 군체의 처리 및 내장이 서면 프로토콜에서 배우기 어려울 수 있기 때문에 중요합니다. 이 방법에 대한 아이디어는 2002년에 발표된 포자가 군체에 고르게 분포되어 있지 않다는 것을 시사하는 일부 유전 데이터에서 영감을 받았습니다. 우리는 지느러미 실험실에서 엥겔베르그(engelberg)가 개발한 군체를 절단하는 방법을 적용했습니다.

시작하겠습니다. 약 300개의 콜로니가 존재할 때까지 30도의 오거 플레이트에서 Wild S visi 효모를 배양하는 것으로 시작합니다. 좁은 주걱을 사용하여 플레이트에서 한 번에 하나씩 직경 1-2mm의 집락을 제거합니다.

그런 다음 1 밀리리터 피펫 맨 팁을 사용하여 현미경 슬라이드에 섭씨 42도의 2% 한천 몇 방울을 떨어뜨리고 AER이 응고되기 전에 즉시 한천을 위로 향하게 하여 콜로니를 놓습니다. 군체에 한천을 몇 방울 더 떨어뜨리고 한천이 굳어지도록 하여 군체의 상단을 포함한 전체 군체가 한천으로 둘러싸여 있도록 합니다. 면도날을 사용하는 모든 후속 프로토콜 단계에서.

군체 주위의 AER을 자르고 군체가 포함된 AER 블록을 배치합니다. 2%파라폼 알데히드와 2%글루타르알데히드가 함유된 3.5밀리리터 붕규산염 스크류 캡 바이알에서 건조를 방지하기 위해 한 번에 하나씩 고착 콜로니를 처리해야 하지만 동일한 바이알에 최대 10개의 콜로니를 넣을 수 있습니다. 식민지를 섭씨 4도에서 7일 동안 방치합니다.

일주일 후, 정착액을 제거하고 약 1.5 밀리리터의 0.15 몰 나트륨을 사용하여 농업 식민지를 두 번 씻습니다. pH 7.2로 케이팅하고 세척 후 15분 동안 흔들지 않고 얼음 위에서 배양합니다. 이 세척 후 두 번 더 씻으십시오.

100 밀리몰 모노 포타슘 포스페이트, pH 6.0에서 10 밀리몰 염화 마그네슘으로 구성된 1.5 밀리리터의 X OS 버퍼를 사용하여 세척 후 5 분 동안 얼음에서 배양합니다. 다음으로, 동일한 바이알을 사용하여 여기와 이 프로토콜의 서면 부분에 나열된 오스뮴 처리 및 세척을 수행합니다. 그런 다음 다시 동일한 바이알을 사용하여 다음 날 아침 일찍 여기와 함께 제공되는 서면 프로토콜에 나열된 단계적 탈수를 수행합니다.

여기와 함께 제공되는 서면 프로토콜에 표시된 대로 스퍼 시약을 준비합니다. 즉시 농업 블록을 10 분 동안 5 회 세척하고 각각 1.5 밀리리터의 100 % 실온 에탄올로 세척하십시오. 마지막 에탄올 세척 후 농업 블록이 덮여 있도록 충분한 에탄올만 제거합니다.

방목 피펫을 사용하여 약 0.5ml의 스퍼 시약을 바이알에 넣고 15분 동안 저속으로 바퀴에서 회전합니다. 회전 후 실온에서 바이알을 30분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 용액을 완전히 제거하십시오.

그런 다음 농업 블록을 덮기 위해 1.5ml의 스퍼 시약을 추가합니다. 다시 말하지만, 실온에서 15분 동안 바퀴에 달린 바이알을 회전시키고 30분 동안 그대로 둡니다. 이 세척을 반복하십시오.

세 번 더 단계를 밟습니다. 마지막 30분이 지나면 박차 시약을 제거하고 새 박차 시약을 추가하여 블록을 덮습니다. 농업 블록을 4시간 동안 실온에 두십시오.

박차 시약을 교체하고 밤새 회전시킵니다. 다음 날 아침, 스퍼 시약을 교체하고 다음 날까지 바이알을 회전시켜 두십시오. 다음 날 아침, 박차 시약을 번호가 매겨진 실리콘 몰드에 넣어 몰드 바닥을 덮습니다.

다음으로 농업 블록을 금형에 넣고 섭씨 60도에서 4시간 동안 배양합니다. 4시간 후, 더 많은 박차와 시약으로 금형을 마무리하고 밤새 섭씨 60도에서 배양합니다. 단면화를 위해 금형에서 블록을 제거합니다.

Wild S Visia 효모 군집의 중심을 통과하는 단면의 광 현미경 사진의 예가 여기에 나와 있습니다. 이 효모는 나무 삼출물에서 분리된 야생형 균주입니다. 군체는 절편 전에 YNA 배지에서 6일 동안 배양되었습니다.

이 이미지에서 asai, pseudo hyphy 및 ovoid yeast는 쉽게 구별할 수 있으며 기본 한천을 침입하는 군체의 영역도 분명합니다. 열린 화살표는 대표적인 아사이족 채워진 화살표를 나타내고, 대표적인 난형 식물 세포를 나타내고, 채워진 화살촉은 길쭉한 세포와 si의 사슬을 나타냅니다. 이 이미지는 효모 SH 1 0 2 0 및 W 3 0 3.Background의 실험실 균주의 얇은 부분에서 추출한 전자 현미경 사진의 예입니다.

군체는 절편 전에 YNA 배지에서 6일 동안 배양되었습니다. 이미지는 포자화된 세포의 빈도가 높은 군체의 영역을 보여줍니다. 화살표는 포자 벽의 이중층 구조를 나타냅니다.

파트 A에서는 파트 B의 이미지에 겹쳐진 15개의 직사각형으로 구성된 그리드가 있는 4일 군집의 단면을 보여줍니다.각 직사각형에서 포자 관련 세포의 빈도는 파트 A에 표시된 15개의 직사각형에 해당하는 15개의 막대와 접목됩니다.데이터는 파트 C에서 4개의 독립적인 4일 군체의 평균 및 표준 오차입니다. 4개의 독립적인 8일 군체에 대한 평균 및 표준 오류가 표시됩니다. 이 기술을 마스터하면 하루 종일, 하루에 한 번에서 세 시간씩 2주 만에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 절차에 따라 블록이 마르지 않도록 솔루션을 즉시 추가해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

면역 전자 현미경 검사와 같은 다른 방법은 발달 후 특정 단백질을 발현하는 세포의 분포를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 통해 포자 세포의 패터닝뿐만 아니라 크로체 CCI 군체의 유사 균사 세포의 패터닝도 볼 수 있었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 절단을 위해 효모 군체를 삽입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 프로토콜에 사용되는 많은 현미경 시약이 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 흄 후드를 사용하고 보호복을 착용하고 시약을 적절하게 폐기하는 것을 잊지 마십시오. 좋아요, 그게 다입니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 행운을 빕니다.