바인딩 메커니즘을 결정하기 위해 가변 농도 등온 적정의 열량의 데이터 세트를 수집

이 절차의 전반적인 목표는 거대분자와 그 리간드의 결합을 설명하는 올바른 물리적 모델을 식별하고 관련 열역학적 매개변수를 결정하는 것입니다. 이것은 먼저 광범위한 투석을 통해 거대분자의 원액을 준비함으로써 달성됩니다. 그런 다음 관심 리간드를 최종 투석 완충액에 용해시키고 모든 성분의 농도를 두 번째 단계에서 측정합니다.

거대분자 및 리간드 샘플은 일련의 서로 다른 농도로 조심스럽게 희석됩니다. 다음으로, 일련의 등온 적정 열량계 또는 ITC 실험을 리간드와 단백질의 여러 농도에서 수행하여 절차의 마지막 단계에서 일련의 ITC 등온선을 생성합니다. 일련의 실험에 대한 전반적인 분석은 서로 다른 물리적 모델을 사용하여 수행되며 전체적으로 가장 잘 일치하는 모델이 올바른 것으로 식별됩니다.

오늘은 단백질 분자가 리간드를 결합하는 방법과 같은 생물물리학적 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있는 방법을 보여 드리고 이 프로토콜이 시작되기 전에 엔트로피, 엔트로피 및 연관 상수와 같은 결합 매개변수를 정확하게 측정할 수 있습니다. 이 시연에 사용된 고분자는 면역 GLYCOSIDE N 6 프라임, 미묘한 전이효소 I 또는 C 6 프라임인 관심 단백질을 정제하고 4리터의 투석 완충액을 준비하고 섭씨 4도로 냉각 I.To. 다음으로 소량의 고분자 용액을 투석합니다.

이 경우, 5 밀리리터의 400 마이크로 몰 AAC C 6 프라임, 1.3 리터의 투석 완충액 중 1 개의 눈은 섭씨 4 도에서 사용됩니다. 이것은 차가운 방이나 냉장고에서 수행할 수 있으며 8시간마다 새 버퍼로 교환하고 총 3회 투석할 수 있습니다. 최종 투석 용액을 저장합니다.

0.45미크론 셀룰로오스 필터를 통해 최종 투석 용액 750ml를 여과하고 섭씨 4도에서 보관합니다. 현재 러닝 버퍼라고 하는 이 버퍼는 헹굼 및 희석제에 사용됩니다. 샘플의 경우 러닝 버퍼로 0.2 미크론 주사기 필터를 철저히 헹굽니다.

단백질 샘플을 적용하고 여과합니다. 단백질 용액을 보관하기 전에 원뿔형 튜브에 샘플을 부드럽게 채취하고 표준 단백질 분석으로 단백질 농도를 측정합니다. 이 경우 단백질 농도는 280나노미터에서 ABSORBENCE로 측정되고 효소 농도가 계산됩니다.

EXI 단백질체학 서버에서 생성된 소광 계수를 사용하여 장기 안정성을 극대화하는 방식으로 단백질을 저장합니다. AAC C six prime one eye는 섭씨 4도에서 보관해야 하며, 동결 및 해동 후 리간드와 러닝 버퍼를 용해한 후에도 활성을 유지하지 못하므로 섭씨 4도에서 보관해야 합니다. 이 시연을 위해 4mg의 아세틸 코엔자임 A를 200마이크로리터의 러닝 버퍼에 용해시켜 25밀리몰의 스톡 용액을 만들었습니다.

이 리간드는 ITC 샘플을 준비하는 데 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 78도에서 보관할 수 있으며, 먼저 AAC six prime one I.This에 대한 서면 프로토콜에 설명된 대로 64의 C 값을 얻기 위해 효소의 농도를 계산하여 192 마이크로몰의 농도에 해당합니다. 이 농도에서 거대분자의 2 밀리리터 용액을 준비하고, 여과 된 실행 완충액 FIA로 원액을 희석하고, 얼음물 수조에서 아세탈 코엔자임 용액을 희석한다. 아세탈 코엔자임 용액이 혼합되어 해동되면 거대분자 농도에 결합 부위 수에 10을 곱하여 리간드 용액의 농도를 부드럽게 계산합니다.

80 마이크로리터의 25 밀리몰 ACE 코엔자임 용액을 420 마이크로리터의 러닝 버퍼에 첨가하여 아세틸 코엔자임 용액을 제조하고 혼합합니다. 희석된 아세틸 코엔자임 ACE 용액을 피펫 주입 튜브로 옮기고 나머지 25 밀리몰 원액을 섭씨 영하 78도로 되돌려 보관합니다. a C six prime one eye와 미묘한 코엔자임, 원하는 실험 작동 온도보다 섭씨 1도 낮은 섭씨 19도에서 5분 동안 진공 상태에서 A 용액을 가스를 제거합니다.

주입 주사기를 설정하려면 프렘 장착 주사기 클램프가 홀더와 같은 높이가 될 때까지 주사기 홀더를 통해 주사기를 삽입합니다. 두 번째 주사기 클램프를 주사기 홀더 바닥에 단단히 밀착될 때까지 주입 주사기 위에 공급합니다. cl을 부드럽게 조입니다.amp 제공된 0.05인치 볼펜 육각 드라이브로.

그런 다음 주사기 홀더를 피펫 홀더에 넣습니다. 피펫 주입기를 주입 주사기에 부드럽게 밀어 넣고 플런저 팁이 주사기의 구멍에 직접 공급되는지 확인합니다. 완전히 삽입되면 주사기 홀더의 잠금 고리를 피펫 주입기에 나사로 고정합니다.

A a C six prime one eye protein 샘플 용액을 로드하기 전에 기기와 함께 제공된 세포 세척 시스템을 사용하여 최소 50ml의 러닝 버퍼로 샘플 셀을 세척합니다. 긴 바늘 2.5ml 유리 주사기로 흡인하여 샘플 셀에서 잔류 완충액을 제거합니다. 두 번째 깨끗하고 건조한 긴 바늘을 사용하여 가스 제거 진공 청소기에서 용액을 제거합니다.

2.5 밀리리터 주사기. 최소 1.8ml의 A a C six prime one eye 단백질 샘플을 주사기에 조심스럽게 추출합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.

주사기에 단백질 샘플이 로드되면 샘플 셀에 바늘을 삽입하고 세포 바닥을 부드럽게 만집니다. 바늘을 약 1mm 올리고 시료 셀 상단 위에 과도한 액체가 보일 때까지 시료를 세포에 부드럽게 주입합니다. 갇힌 기포의 셀을 씻어내려면 용액이 오버플로에 남아 있는지 확인하면서 바늘을 약 1cm 올리고 약 0.25ml의 용액을 신속하게 빼내어 주입합니다.

이제 오버플로 측면을 따라 바늘을 위쪽으로 부드럽게 밉니다. 샘플 웰에서 바늘은 선반에 부딪힐 것입니다. 선반이 실행 중인 용액의 원하는 높이를 나타내므로 이 선반 위의 모든 액체를 회수합니다.

주입 주사기를 로드하려면 플라스틱 튜브 팽창 주사기를 주입 포트에 부착하고 플런저 팁을 주입 포트 상단으로 내립니다. 이제 DGA 리간드 용액의 피펫 주입 튜브를 피펫 홀더 하단에 놓습니다. 주사기 팁이 주입 튜브의 바닥에 닿지 않는지 확인하고 소량이 적재 주사기의 튜브에 들어갈 때까지 용액을 주사기로 천천히 끌어당깁니다.

그런 다음 플런저 팁을 내려 주입 포트를 닫습니다. 이것은 close fill port 버튼을 클릭하여 수행됩니다. 그런 다음 적재 중에 갇혔을 수 있는 기포를 제거합니다.

purge refill 버튼을 클릭하여 퍼지하고 다시 채웁니다. 총 세 번 퍼지하고 다시 채웁니다. 퍼지 리필 과정이 완료되면 피펫 홀더에서 주입 튜브를 제거하고 실험실 티슈 페이퍼로 주사기 팁을 부드럽게 닦습니다.

이제 피펫 어셈블리의 주사기를 샘플로 내립니다. 바늘이 쉽게 구부러질 수 있으므로 주의하고 천천히 진행하십시오. 잠금 고리의 바닥을 눌러 주사기가 완전히 삽입되었는지 확인합니다.

주사기가 고정되면 원하는 작동 온도를 설정하고 예상되는 최대 분사 열 흐름보다 약간 큰 기준 전력을 선택합니다. 이 예에서는 섭씨 20도와 초당 20마이크로 칼로리가 각각 작동 온도와 기준 전력으로 사용됩니다. 그런 다음 원하는 주입량과 지연을 프로그래밍합니다.

여기서, 28회의 주입이 사용되며, 첫 번째 주입은 2마이크로리터의 부피와 62번째 지연을 갖고, 후속 주입은 10마이크로리터의 부피와 332번째 지연을 갖는 주입이 사용됩니다. 여기에 시연된 실험은 필요한 추가 곡선을 생성하기 위해 단일 농도에서 데이터 세트를 생성할 수 있는 기반을 제공합니다. 거대분자 및 리간드 농도를 감소시키면서 이 과정을 반복합니다.

모든 거대분자 및 리간드 샘플이 농도의 오류를 최소화하기 위해 동일한 원액에서 유래했는지 확인하십시오. 여기에 표시된 것은 3.86 밀리몰 리간드 아세틸 코엔자임 A를 192 마이크로몰의 마이크로 분자로 적정하여 생성된 원시 등온 적정 열량계 미량입니다. A: A, C, 6, 소수, 1.

Eye Integrated 값은 두 부위 순차 적합으로 결합 매개변수를 결정하는 데 사용되었습니다. 이 그래프는 ACE Coenzyme A 및 AAC C six Prime One Eye의 다양한 농도에 대해 ITC에 의해 생성된 등온선을 보여줍니다. 열린 원으로 표시되는 실험 데이터는 두 세트의 사이트 독립 모델과 두 사이트 순차 모델 모두에 적합했습니다.

두 사이트 순차 모델에서 더 나은 일치가 나타납니다. 사용된 단백질 농도는 첨부된 텍스트에 정의되어 있습니다. 이 절차를 수행할 때 농도 변화가 결과에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 희석을 매우 정확하게 하는 것이 중요합니다.