Name: 바인딩 메커니즘을 결정하기 위해 가변 농도 등온 적정의 열량의 데이터 세트를 수집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 배우세요 등온 적정 열량측정법(ITC)을 사용하여 대분자와 리간드의 결합 모델을 식별하고 열역학적 매개변수를 추출하는 방법을. 이 기법은 생화학 및 생물물리화학 연구에서 분자 상호작용을 정밀하게 분석하는 데 필수적입니다.

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이 작품은 캐나다 보건 연구소 연구 (CIHR), 국립 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC), 그리고 CIHR 교육 교부금 장학금 (LF)를 지원했습니다. 우리는 AAC를위한 교수 제라드 D. 라이트 (맥매스터 대학, 캐나다) (6) - II의 표현이 플라스미드 감사합니다.

1. 재고 솔루션을 준비 <ol><li> 관심 macromolecule 정화. (다른보고로이 경우에는 aminoglycoside N - 6' - acetyltransferase - II는 (AAC6' - II), 격리됩니다. 13) </li><li> 투석 버퍼의 4리터를 준비합니다. (이 경우에는 우리는 25 MM 4 사용 - (2 - 히드록시 에틸) - 1 - piperazineethanesulfonic 산 (HEPES, MW 238.3 g / 몰), 2 MM ethylenediaminetetraacetic 초산 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), MW 292.2)를 포함, 산도 7.5에서.) </li><li> AAC (6 ') - II 샘플 (400 μm의에서 5 ML)을 사용 투석 버퍼 (3 X 1.3 L)에 dialyzed해야 단백질 Dialyze. 최종 투석 솔루션은 기계를 씻어하고 샘플을 희석하기 위해 보관됩니다. </li><li> 0.45 μm의의 셀룰로오스 필터를 통해 최종 투석 솔루션을 필터, 4 ° C.에 저장된 '실행 버퍼'로 불리는 것입니다 </li><li> 실행 버퍼 철저히 씻어서되었습니다 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터 단백질 솔루션입니다. 표준 검정 (브래드 포드, 로리, 등) 또는 UV 흡광도를 사용하여 단백질의 최종 농도를 측정합니다. 장기 안정성을 극대화하기 위해 단백질을 저장합니다. (AAC (6의 경우) - II 동결 융해 후 활동을 유지하지 않습니다 ') - II,이 4 저장 ° C. AAC (6 의미')합니다. </li><li> 버퍼를 실행에 4.0 MG를 용해하여 아세틸 보조 효소의 25 MM 주식 솔루션 (AcCoA, 리간드, MW 809.57)의 200μL를 준비합니다. -78 ° C에서 프리즈 사용할 때까지. </li><li> 모든 단백질과 리간드 샘플 농도 무작위 표본 - 투 - 샘플 변동을 최소화하기 위해, 동일한 주식 솔루션에서 발생한해야합니다. 전체 변수 - C 세트에 걸쳐 단백질 농도에 대해 하나의 보정 계수는 분석 조정됩니다. 10 </li></ol> 2. 준비 ITC 샘플 <ol><li> 2 ML의 최종 볼륨 64 C - 값으로 효소 솔루션을 희석. (AAC (6 ') - II의 경우에는이 192 μm의에 해당합니다.) </li><li> 빨리 얼음물에 리간드 (AcCoA) 재고 솔루션을 녹여. </li><li> 0.5 AcCoA 솔루션의 ML보다 10 배 농축 후이 경우에 단백질의 바인딩 사이트의 수를, 버퍼를 실행 420 μL에 AcCoA 주식 솔루션의 80 μL를 diluting을 4 MM. 준비 피펫 작성 튜브로 전송합니다. 신속 -78 ° C.에 AcCoA 주식 솔루션을 반환 </li><li> 온도 1 5 분 데가스 단백질과 진공에 따라 솔루션 ° C 원하는 실행 온도 이하 (19 ° C). </li></ol> 3. 주사기 14 설정 <ol><li> 미리 장착된 주사기 클램프는 홀더와 같은 높이가 될 때까지 주사기 홀더를 통해 사출 주사기를 삽입합니다. </li><li> 그것이 단단히 주사기 홀더의 하단에 반대 누를 때까지 주입 주사기를 통해 두 번째로 주사기 클램프 피드. 부드럽게 제공된 0.050 "공 포인트 16 진수 드라이브와 클램프를 조입니다. </li><li> 피펫 홀더에 주사기 홀더 플레이스. </li><li> 부드럽게 분사 주사기로 피펫 주입기를 슬라이드. 플런저 팁이 주사기의 구멍에 직접 공급되어 있는지 확인하십시오. 일단 완전히 삽입, 피펫 주입기에 주사기 홀더의 고정 칼라를 나사. </li></ol> 4. 샘플 셀 14 로딩 <ol><li> 버퍼를 실행하는 50 ML 최소 샘플 세포를 세척하고, 오랜 needled 2.5 ML 유리 주사기를 사용하여 남아있는 액체를 제거합니다. </li><li> 천천히 청결하고 건조하게 오래 needled 2.5 ML 주사기로 단백질 샘플 솔루션의 1.8 ML 최소 그려. 모든 거품을 소개하지 않도록주의하십시오. </li><li> 조심스럽게 샘플 세포에 바늘을 삽입하고 부드럽게 세포의 땅에 닿으면. 약간 팁을 올려 (~ 1mm)과 초과 액체 샘플 세포의 맨 위에 표시됩니다 때까지 부드럽게 셀에 AAC (6 ') - II 솔루션을 주입. </li><li> 오버플로의 액체 유지를 확보하면서 천천히 1cm에 대해 바늘을 올립니다. 신속하게 철회 및 샘플 세포에 갇혀있는 거품을 제거하는 솔루션의 소량 (~ 0.25 ML)를 주입. </li><li> 모든 솔루션 오버플로우를 제거합니다. 이것은 부드럽게 샘플 셀로 오버플로우의 측면을 따라 바늘을 슬라이딩에 의해 이루어진다. 주사기 팁이 난간에 타격을 줄 것으로 예상된다, 이것은 실행 솔루션을위한 욕망의 높이입니다. 이 라인 위에 앉아 모든 액체를 제거합니다. </li></ol> 5. 주사 주사기를 로딩하고 실행 14 시작 <ol><li> 입력 포트에 플라스틱 튜브 로딩 주사기를 연결합니다. </li><li> 입력 포트의 상단에 낮은 플런저 팁. </li><li> 피펫 홀더의 하단에있는 피펫 작성 튜브 AcCoA 솔루션을 놓습니다. 주사기 팁은 충전 튜브의 아래쪽을 만지지 않습니다. </li><li> 작은 금액은 로딩 주사기의 튜브를 입력하기 전까지 천천히 주사기에 솔루션을 그립니다. </li><li> 닫기 채우기 포트 버튼 플런저 팁을 클릭을 낮추는 방법으로 채우기 포트를 닫습니다. 모든 기포를 제거하기 위해 정리 -&gt; 리필 버튼을 3 번 클릭하여 정화 및 리필은 로딩하는 동안 갇혀있다가 수. </li><li> 피펫 홀더에서 작성 튜브를 제거하고 부드럽게 주사기 팁 닦으십시오. </li><li> 샘플 셀로 피펫 조립 및 부드럽게 낮은 주사기를 가져가라. 주사기 쉽게 구부 수 서서히 진행, 훌륭한 치료가 필요하는 것입니다. 주사기가 완전히 옷깃을 잠금의 기반 아래로 눌러 삽입되었는지 확인하십시오. </li><li> 원하는 실행 온도를 (이 경우 20 ° C에서) 설정하고 (이 경우 20μcal/sec)를 예상되는 최대 사출 열 흐름보다 약간 큰 참조 전원을 선택합니다. </li><li> 원하는 분사 볼륨 및 지연 프로그램. (이 경우에는, 28 주사이 고용되었습니다. 첫 번째 주사는 60의 지연 2 μL의 볼륨을했다. 모든 후속 주사는 330의 지연 10 μL의 볼륨을했다.) </li></ol> 6. 후속 실행 <ol><li> 모든 후속 실행에 2,4,8,16의 요소에 의해 AAC (6 ') - II 및 AcCoA의 농도를 감소하면서, 단계 2-5를 반복하고, 32. </li></ol> 7. 데이터 분석 <ol><li> 전세계적으로 바인딩 매개 변수의 하나의 설정 등온선을 모두 맞는 맞는 프로 시저를 사용하여로 이전 10 설명했다. </li></ol> 8. 대표 결과 대표 데이터는 그림 1에 표시됩니다. 등온선의 모양은 농도에 따라 달라질 것입니다. 선명 전환이 높은에 대한 예상되는 C - 값 (즉, 높은 단백질과 리간드의 농도) (그림 2). AAC (6 ') - II의 경우, 두 사이트 순차 모델 조절 stoichiometries와 동일, 독립 사이트의 두 세트를 설명하는 하나보다 더 잘 맞는를 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. AAC (6 ') - II (192 μm의)에 AcCoA의 적정 (3.86 ㎜)에 의해 만들어진 등온선. A) 원시 ITC 추적. B) 2 사이트 순서에 맞게 (와 바인딩 매개 변수 (사각형) 결정에 사용되는 통합 값 -). <img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> AcCoA에 대한 그림 2. ITC의 등온선은 다양한 농도에서 AAC (6 ') - II에 titrated. 실험 데이터 (오픈 원가) 2 세트 - 오브 - 사이트 독립적인 모델 (점선 마젠타) 및 2 현장 연속 모델 (고체 파란색)에 맞는. 2 - 사이트 sequentional 모델은 분명히 더 나은 전반적인 계약을 제공합니다. 고용 농도) 6 μm의, 0.25 MM, B) 12 μm의, 0.25 MM, C) 24 μm의 0.5 MM, D) 48 μm의, 1.0 MM, E) 96 μm의, 1.9 MM, 그리고 F) 196 μm의,되었다 각각 AAC (6 ') - II 및 AcCoA에 대한 3.86 MM.

<ol><li>Cliff, M. J., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2002+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).</li>
<li>Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2003+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2004%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2005%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).</li>
<li>Okhrimenko, O. ksana, J, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2006+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).</li>
<li>Bjelic, S., Jelesarov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2007+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).</li>
<li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).</li>
<li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).</li>
<li>Capaldi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+X-Ray+Structure+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+Ileal+Bile+Acid-Binding+Protein+Reveals+the+Presence+of+Binding+Sites+on+the+Surface+of+the+Protein+Molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule.</a> Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).</li>
<li>Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+Protein+Binding+Mechanisms+by+Variable-c+ITC%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC.</a> ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).</li>
<li>Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -a, Wright, G. D., Berghuis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+aminoglycoside+6%27-N-acetyltransferase%3A+defining+the+GCN5-related+N-acetyltransferase+superfamily+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold.</a> Structure. 7, 497-507 (1999).</li>
<li>Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Mechanism+of+the+GCN5-Related+Chromosomal+Aminoglycoside+Acetyltransferase+AAC%286%27%29-Ii+from+Enterococcus+faecium%3A+Evidence+of+Dimer+Subunit+Cooperativity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity.</a> Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).</li>
<li>Wright, G. D., Ladak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+characterization+of+the+chromosomal+aminoglycoside+6%27-N-acetyltransferase+from+Enterococcus+faecium%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).</li>
<li>MicroCal. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ITC+Data+Analysis+in+Origin%22">ITC Data Analysis in Origin</a>. , 7 edn, MicroCal. (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

가변 C 피팅이 분석 부분은 이전에 자세하게 설명 10했습니다. 여기 우리는이 접근 방식에 적합한 가변 - C 데이터 세트를 수집 실용적인 측면을보고합니다. 그것은 모든 단백질과 리간드 샘플이 동일한 주식 솔루션에서 도출되는 중요합니다. 따라서 충분한 재고 솔루션 실험 시리즈 전체를 완료하는 데 처음에 준비하는 것이 중요합니다. 이것은 AAC의 비율 (6 &#39;) - II를 보장하고 AcCoA 모든 실험 중 일정 및 샘플 - 투 - 샘플 기준 농도 임의의 변동을 줄일 수 있습니다. 이 경우에는 많은주의가 리간드의 처리에 촬영해야합니다. 그것이 주식 솔루션은 시간이 매우 짧은 기간 동안 액체 상태 것이 중요하므로 AcCoA는 솔루션에서 화학적으로 불안정합니다. 해당 금액이 주식 솔루션에서 aliquoted되면 주가는 즉시 refrozen해야합니다. 이것이 완료되지 않으면 다음 AcCoA은 시간이 지남에 따라 저하 수 있으며 농도는 나중에 실행에 해결되지 ...

<table><tbody><tr><td>Acetyl c&amp;#8211;nzyme A (AcCoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2056</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 2 투석 튜브</td><td>Spectrum Labs</td><td>132678</td><td></td></tr><tr><td>멸균 주사기 필터 (0.2 &amp;mu;m)</td><td>VWR international</td><td>281445-477</td><td></td></tr><tr><td>셀룰로오스 질산염 막 필터 (0.45 &amp;mu;m)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>7184-004</td><td></td></tr><tr><td>VP-ITC</td><td>MicroCal</td><td>VP-ITC</td><td>측정에 사용된 미세열량계</td></tr><tr><td>ThermoVac</td><td>MicroCal</td><td>USB Thermo Vac</td><td>온도 조절 탈기 장치</td></tr></tbody></table>

바인딩 메커니즘을 결정하기 위해 가변 농도 등온 적정의 열량의 데이터 세트를 수집

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

등온 적정의 열량 (ITC)는 일반적으로 호스트 macromolecule에 리간드의 바인딩과 관련된 열역학적 파라미터를 결정하는 데 사용됩니다. ITC는 호스트 / 리간드 상호 작용을 공부에 대한 일반적인 spectroscopic 방법을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 공개 또는 두 구성 요소가 상호 작용할 때 흡수 열을 직접 측정 및 외인성 기자가 필요하지 않습니다. 따라서 바인딩 엔탈피 및 협회 상수 (카)가 직접 ITC 데이터에서 얻은되며, entropic 기여를 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 등온선의 모양이 C - 가치와 관련된 기계론의 모델에 따라 달라집니다. C - 값으로 정의 C = N [P] tKa 어디로 [P] t는 단백질 농도이며, 여기서 n은 호스트 내에서 리간드 바인딩 사이트의 번호입니다. 대부분의 경우, 특정 리간드에 대해 여러 개의 바인딩 사이트가 아닌 동등하고 ITC는 개별 바인딩 사이트에 대한 열역학적 바인딩 매개 변수의 특성을 허용합니다. 이것은 그러나 올바른 바인딩 모델을 사용해야합니다. 다른 모델은 동일한 실험 데이터를 끼워 넣을 수있는 선택이 문제가 될 수 있습니다. 우리는 이전에이 문제가 C - 값 몇 가지의 실험을 수행하여 피할 수 것으로 나타났습니다. C - 값이 다른에서 얻은 여러 등온선은 별도의 모델을 동시에 맞게됩니다. 올바른 모델은 다음 전체 변수 - C의 데이터 세트에 걸쳐 적합의 장점을 기반으로 식별됩니다. 이 과정은 aminoglycoside 내성 유발 효소 aminoglycoside N - 6&#39; - acetyltransferase - II (AAC (6 &#39;) - II) 여기에 적용됩니다. 우리의 방법론은 어떤 시스템에 적용할 수 있지만,이 전략의 필요성은 더 allostery 또는 cooperativity를 보여주는 macromolecule - 리간드 시스템 시연, 그리고 다른 바인딩 모델은 동일한 데이터에 본질적으로 동일한 맞는를 제공하면됩니다. 우리의 지식, 상용 그런 시스템은 없습니다. AAC (6 &#39;) - II는 두 subunits 사이 cooperativity을 보여주는이 활성화된 사이트를 포함하는 호모 - 이합체입니다. 그러나 C - 값이 하나에서 얻은 ITC 데이터는 적어도 두 가지 모델이 두 세트 - 오브 - 사이트 독립적인 모델과 두 사이트를 연속 (협동) 모델 똑같이 잘 맞지 수 있습니다. 위의 설명과 같이 C - 가치를 변화를 통해, 그것은 AAC에 대한 올바른 바인딩 모델 (6 &#39;) - II는 두 사이트를 순차적으로 결합 모델입니다 설립되었습니다. 여기에, 우리는 ITC의 실험을 수행할 때 가변 C 분석에 적합한 데이터 세트를 얻기 위해 이동해야하는 단계를 설명합니다.

ITC는 호스트에 리간드의 바인딩을 연구를위한 강력한 도구입니다. 복잡한 시스템에서 그러나, 몇 가지 모델은 동일하게 데이터를 맞을 수 있습니다. 방법은 여기에 설명된 것은 복잡한 시스템에 적합한 바인딩 모델을 명료하게하다와 해당 열역학적 파라미터를 추출하는 수단을 제공합니다.

등온 적정 열량계(Isothermal titration calorimetry, ITC)는 리간드의 호스트 결합과 관련된 열역학적 파라미터를 결정하는 데 흔히 사용됩니다...

이 절차의 전반적인 목표는 거대분자와 리간드의 결합을 설명하는 적절한 물리적 모델을 식별하고, 그와 관련된 열역학적 파라미터를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 광범위한 투석을 통해 거대분자의 스톡 용액을 준비함으로써 달성됩니다. 그 다음, 관심 대상인 리간드를 최종 투석 버퍼에 녹이고, 두 번째 단계에서 모든 구성 성분의 농도를 결정합니다.거대분자와 리간드 시료를 여러 가지 다른 농도로 주의 깊게 희석합니다. 다음으로, 리간드와 단백질 모두를 여러 농도로 설정하여 일련의 등온 적정 열량 측정법(isothermal titration calorimetry, ITC) 실험을 수행하며, 절차의 마지막 단계에서 일련의 ITC 등온선을 생성합니다. 일련의 실험 결과에 대해 다양한 물리적 모델을 사용하여 전역 분석(global analysis)을 수행하며, 전체적으로 가장 잘 일치하는 모델을 정답으로 식별합니다.오늘은 단백질 분자가 리간드와 어떻게 결합하는지와 같은 생물물리학적 질문에 답하는 데 도움이 되고, 엔트로피, 엔탈피 및 결합 상수와 같은 결합 파라미터의 정확한 측정값을 제공할 수 있는 방법을 보여드리겠습니다. 본 프로토콜을 시작하기 전에, 관심 단백질을 정제하십시오. 본 시연에서 사용된 거대분자는 immuno GLYCOSIDE N six prime, a subtle transferase one I 또는 a C six prime one I입니다. 우선, 4 L의 투석 버퍼를 준비하여 4 °C로 냉각하십시오. 다음으로, 소량의 거대분자 용액을 투석하십시오.이 경우, 4°C에서 1.3L의 투석 완충액에 400 µM AAC C six prime, one eye 5 mL를 넣습니다. 이 작업은 저온실이나 냉장고에서 수행할 수 있으며, 8시간마다 신선한 완충액으로 교체하여 총 3회 투석합니다. 최종 투석 용액을 보관하십시오.최종 투석액 750 milliliters를 0.45 micron 셀룰로오스 필터로 여과하여 4 °C에서 보관하십시오. 이제 러닝 버퍼(running buffer)라고 지칭하는 이 버퍼는 세척액 및 희석액으로 사용됩니다. 샘플의 경우, 0.2 micron 시린지 필터를 러닝 버퍼로 충분히 세척하십시오.단백질 샘플을 도포하고 여과합니다. 단백질 용액을 보관하기 전, 원심분리관(conical tube)에 샘플을 조심스럽게 수집하고 표준 단백질 분석법으로 단백질 농도를 결정합니다. 본 실험에서는 280 nanometers에서의 흡광도(ABSORBENCE)로 단백질 농도를 측정하고 효소 농도를 계산합니다.EXI 단백질체 서버에서 생성된 소멸 계수를 사용하여, 단백질을 장기 안정성을 최대화하는 방식으로 보관하십시오. AAC C six prime one eye는 동결 및 해동 후 활성이 유지되지 않으므로 4 °C에서 보관해야 합니다. 다음으로 리간드와 러닝 버퍼를 용해하십시오. 본 시연에서는 4 mg의 acetyl coenzyme A를 200 µL의 러닝 버퍼에 용해하여 25 mM 스톡 용액을 제조하였습니다.이 리간드는 ITC 샘플을 준비할 준비가 될 때까지 -78 °C에서 보관할 수 있습니다. 먼저, AAC 6'1 I의 서면 프로토콜에 설명된 대로 C 값 64를 얻기 위한 효소 농도를 계산하십시오. 이는 192 µM의 농도에 해당합니다. 여과된 러닝 버퍼로 스톡 솔루션을 희석하여 이 농도의 거대분자 용액 2 mL를 준비하십시오. acetal co-enzyme a를 얼음물 배스에서 해동하십시오. acetal co-enzyme a 용액이 해동되면 부드럽게 혼합하십시오. 거대분자 농도에 결합 부위 수를 곱한 후 다시 10을 곱하여 리간드 용액의 농도를 계산하십시오.25 millimolar ACE co-enzyme A stock solution 80 microliters를 running buffer 420 microliters에 첨가하고 혼합하여 acetyl co-enzyme A 용액을 준비합니다. 희석된 acetyl co-enzyme ACE 용액을 피펫 충전 튜브로 옮기고, 남은 25 Millimolar stock solution은 보관을 위해 minus 78 degrees Celsius로 되돌립니다. 희망하는 실험 작동 온도보다 1 degree Celsius 낮은 19 degrees Celsius에서 진공 상태로 a C six prime one eye 및 acetyl co-enzyme A 용액의 가스를 5분 동안 제거합니다.주입용 시린지를 설치하려면, 미리 장착된 시린지 클램프가 홀더와 같은 높이가 될 때까지 시린지 홀더를 통해 시린지를 삽입하십시오. 두 번째 시린지 클램프를 주입용 시린지에 끼워 시린지 홀더 바닥에 단단히 밀착될 때까지 밀어 넣으십시오. 제공된 0.05 inch 볼포인트 육각 드라이브를 사용하여 클램프를 조심스럽게 조이십시오.다음으로, 시린지 홀더를 피펫 홀더에 장착합니다. 피펫 인젝터를 주입용 시린지 안으로 조심스럽게 밀어 넣어 플런저 팁이 시린지의 구멍에 직접 맞물리도록 합니다. 완전히 삽입되면 시린지 홀더의 잠금 칼라를 피펫 인젝터에 돌려 고정합니다.A a C six prime one eye 단백질 시료 용액을 로딩하기 전, 기기에 제공된 셀 세척 시스템을 사용하여 시료 셀을 최소 50 milliliters의 running buffer로 세척하십시오. 긴 바늘이 달린 2.5 milliliter 유리 주사기를 사용하여 시료 셀에서 잔류 버퍼를 흡입하여 제거하십시오. 깨끗하고 건조한 두 번째 긴 바늘을 사용하여 탈기 진공 장치에서 용액을 제거하십시오.2.5 milliliter 주사기. A a C six prime one eye 단백질 샘플을 최소 1.8 milliliters 이상 조심스럽게 주사기에 흡입합니다. 공기 방울이 생기지 않도록 주의하십시오.주사기에 단백질 샘플을 채운 후, 바늘을 샘플 셀에 삽입하고 셀 바닥에 살짝 닿게 합니다. 바늘을 약 1mm 들어 올린 다음, 샘플 셀 상단 위로 여분의 액체가 보일 때까지 샘플을 셀 내로 천천히 주입합니다. 셀 내에 갇힌 기포를 제거하려면, 오버플로 부분에 용액이 남아 있는지 확인하면서 바늘을 약 1cm 들어 올린 후, 약 0.25 milliliters의 용액을 빠르게 흡입했다가 다시 주입합니다.이제 니들을 오버플로우 측면을 따라 조심스럽게 위로 밀어 올립니다. 샘플 웰에서 니들이 턱에 닿게 됩니다. 이 턱이 전개액의 목표 높이를 나타내므로, 턱 위의 모든 액체를 뽑아냅니다.주입용 시린지를 채우기 위해, 플라스틱 튜브 블로팅 시린지를 충전 포트에 부착하고 플런저 팁을 충전 포트 상단까지 내립니다. 이제 DGA 리간드 용액이 담긴 피펫 충전 튜브를 피펫 홀더 바닥에 배치합니다. 시린지 팁이 충전 튜브 바닥에 닿지 않는지 확인하고, 용액이 로딩 시린지의 튜브로 소량 유입될 때까지 시린지로 용액을 천천히 흡입합니다.다음으로, 플런저 팁을 내려 충전구를 닫습니다. 이는 충전구 닫기 버튼을 클릭하여 수행합니다. 그런 다음 로딩 과정에서 유입되었을 수 있는 기포를 제거합니다.퍼지 리필(purge refill) 버튼을 클릭하여 퍼지 및 리필을 수행합니다. 퍼지와 리필을 총 3회 반복합니다. 퍼지 리필 과정이 완료되면 피펫 홀더에서 충전 튜브를 제거하고 실험용 티슈로 시린지 팁을 부드럽게 닦아냅니다.이제 피펫 어셈블리의 시린지를 샘플 내부로 내립니다. 바늘이 쉽게 휠 수 있으므로 주의하여 천천히 진행하십시오. 잠금 칼라(locking collar)의 바닥 부분을 눌러 시린지가 완전히 삽입되었는지 확인하십시오.주사기가 고정되면, 원하는 작동 온도를 설정하고 예상되는 최대 주입 열흐름보다 약간 높은 기준 전력을 선택하십시오. 이 예시에서는 작동 온도와 기준 전력으로 각각 20 °C와 20 µcal/s를 사용합니다. 그런 다음 원하는 주입 부피와 지연 시간을 프로그래밍하십시오.여기서는 총 28회의 주입이 수행되며, 첫 번째 주입량은 2 µL이고 62번째 딜레이를 가집니다. 이후의 주입량은 10 µL이며 332번째 딜레이를 가집니다. 여기서 제시된 실험은 추가적인 곡선 생성에 필요한 단일 농도의 데이터 세트를 구축하는 기초를 제공합니다. 고분자 및 리간드의 농도를 낮추어 이 과정을 반복하십시오.농도 오차를 최소화하기 위해 모든 고분자 및 리간드 시료가 동일한 스톡 용액에서 유래했는지 확인하십시오. 여기에 3.86 millimolar 리간드 acetyl coenzyme A를 192 micromolar의 미세 분자 A A C six prime one에 적정하여 얻은 가공되지 않은 등온 적정 열량 측정 트레이스가 표시되어 있습니다.두 부위 순차 결합 피팅(two site sequential fit)을 통해 결합 파라미터를 결정하기 위해 적분된 눈 값을 사용하였습니다. 이 그래프는 다양한 농도의 ACE Coenzyme A와 AAC C six Prime One Eye의 ITC로 생성된 등온 곡선을 나타냅니다. 빈 원으로 표시된 실험 데이터는 두 세트의 부위 독립 모델(two sets of sites independent model)과 두 부위 순차 모델(two site sequential model) 모두에 피팅되었습니다.두 사이트 순차 모델(two site sequential model)에서 더 나은 일치도가 관찰됩니다. 사용된 단백질 농도는 함께 제공된 텍스트에 정의되어 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 농도 변화가 결과에 급격한 영향을 미칠 수 있으므로 희석을 매우 정확하게 하는 것이 중요합니다.

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연구

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생물학

적당한 바인딩 동질성과 생물 학적 시스템에 대한 바인딩을 열역학을 모니터하는 등온 적정의 열량의 사용에 대한 일반적인 프로토콜이 제공됩니다.

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효소 활동의 열 안정성은 쉽게 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 측정 됩니다. 대부분 단백질 안정성 분석 실험은 현재 측정 단백질 전개, 사용 하지만 효소 활동에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. ITC의 효소 활동의 안정성에 효소 수정 효과의 직접 측정을 수 있습니다.

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마이크로스케일 열영동은 낮은 재료 비용으로 결합 상수를 신속하게 획득한다. 표지 또는 라벨이 없는 마이크로스케일 열영동이 상업적으로 입수가능하거나; 그러나, 라벨 없는 열영동은 형광 표지를 사용하여 수행될 수 있는 상호작용 측정의 다양성을 할 수 없다. 우리는 라벨이 붙은 열영동 측정을위한 프로토콜을 제공합니다.

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본 프로토콜은 샘플 준비, 실행 표준 및 샘플을 포함하여 DNA 압타머와 테트라사이클린 간의 결합의 연관성 및 해리 역학을 분석하고 결과 데이터를 해석하기 위한 등온 적정 열량측정법(ITC)의 사용을 설명합니다.

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배우세요 등온 적정 열량측정법(ITC)을 사용하여 대분자와 리간드의 결합 모델을 식별하고 열역학적 매개변수를 추출하는 방법을. 이 기법은 생화학 및 생물물리화학 연구에서 분자 상호작용을 정밀하게 분석하는 데 필수적입니다.

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