여러 고유 긴장 유학을위한 마이크로 유체 장치
November 9th, 2012
우리는 클린 룸이나 부드러운 리소그래피 필요없이 여러 독특한 변종에 유사한 동적 조건을 적용 할 수있는 마이크로 유체 장치를 생산하는 간단한 방법을 제시한다.
다음 방법의 전반적인 목표는 동일한 동적 조건에서 서로 다른 효모 균주에서 단일 세포의 거동을 이미지화하는 것입니다. 이것은 2개의 층 microfluidic 장치를 제작해서 달성됩니다, 또는 맨 아래 층은 다른 긴장의 각각을 따로따로 포함하고, 맨 위 층은 두번째 단계로 동적인 교류 조건을 제공할 것입니다. 다양한 효모 균주가 웰에 배치되고 장치가 닫히면 여러 개의 분리된 균주가 있는 단일 채널이 생성됩니다.
다음으로, Y 채널의 두 입력에서 유속을 제어하여 동적 매체 변화에 대한 세포 반응을 이미지화하면 동일한 동적 조건에 종속된 서로 다른 균주가 나타나고 웰 간에 교차 오염이 없음을 알 수 있습니다. 이 미세유체 장치는 다른 기존 시스템에 비해 몇 가지 주요 장점이 있습니다. 이를 통해 동일한 동적 조건에서 여러 개의 고유한 균주를 이미징할 수 있습니다.
또한 중요한 것은 특별한 장비 없이 모든 실험실에서 쉽게 제조할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 기아 통과에 대한 다양한 야생 동부 격리 동물의 반응을 따르는 방법에 대한 논의에서 비롯되었습니다. 원하는 마이크로채널 레이아웃을 시작, 그리기 또는 인쇄하여 확장할 수 있습니다.
다음으로, 유리 슬라이드를 스카치 테이프 층으로 덮습니다.원하는 채널 높이를 얻으려면 레이아웃 디자인을 평평한 표면에 놓고 슬라이드를 디자인 패턴 위에 정렬합니다. 이제 레이아웃에 따라 유리 슬라이드의 테이프를 조심스럽게 자릅니다. 유리 슬라이드의 모든 영역에서 스카치 테이프를 제거합니다.
마이크로 채널의 레이아웃에서 이를 수락합니다. 슬라이드를 섭씨 65도로 가열되는 오븐에 3분 동안 넣습니다. 그런 다음 에탄올로 부드럽게 청소하십시오.
PDMS의 기본 및 경화 성분을 제조업체에서 권장하는 대로 혼합합니다. 약 30ml의 PDMS 혼합물을 약 0.5cm 높이의 페트리 접시에 붓습니다. 필요한 경우 진공 상태에서 PDMS의 가스를 제거합니다.
패턴이 있는 스카치 테이프가 위를 향하도록 하여 유리 슬라이드를 PDMS에 담그십시오. PDMS 뒤에 패턴을 배치하면 슬라이드와 접시 사이에 기포가 형성되는 것을 방지하고 섭씨 65도에서 48시간 동안 바닥 경화를 통해 새로운 90mm 페트리 접시의 거품 수준을 사용하여 접시가 수평이 되도록 합니다. PDMS 믹스 3ml를 붓습니다.
이 단계는 사용 가능한 경우 스핀 코더에서 수행할 수 있습니다. DGA 및 치료법. 이제 생검 펀처를 사용하여 미세유체 장치의 흐름층을 원하는 크기로 부드럽게 잘라냅니다.
흐름 레이어의 입구와 출구에 대한 구멍을 만듭니다. 또한 두 번째 페트리 접시에서 비슷한 크기의 우물 층을 잘라내어 두꺼운 유리에 놓습니다. 디자인 레이아웃 위로 밉니다.
그런 다음 에탄올을 사용하여 레이아웃의 마이크로 채널과 정렬하여 웰을 펀칭하고 PDMS 층과 유리 커버 슬립을 모두 청소하고 자연 건조합니다. 다음으로, 유리 커버 슬립과 웰 레이어 PDMS를 비가역적 결합을 위한 표준 플라즈마 에칭기 또는 가역적 결합을 위한 휴대용 코로나 처리기로 처리합니다. 접착력을 유발하기 위해 커버 슬립 위에 웰 층을 조심스럽게 놓습니다.
기포를 부드럽게 문지릅니다. 적절한 주사기에 원하는 매체를 준비하고 주사기 펌프를 통해 나사산이 있는 tigon 튜브에 연결합니다. 세포 이미징용.
강점을 활용한다. 원하는 단계로 이동하여 배양물을 철저히 소용돌이치고 300마이크로리터를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 1마이크로리터의 con canna A를 PDMS 웰 층의 각 웰에 부드럽게 놓습니다.
A의 콘이 건조되는 동안 물을 부드럽게 피펫팅하여 각 우물에서 여분의 코나 A를 두 번 씻어냅니다. 포도당이 결핍된 300마이크로리터의 SC 배지로 균주를 두 번 세척합니다. 세포벽에서 잔류 포도당을 씻어내면 혈당을 적절하게 준수하는 데 도움이 됩니다.
와류 후, 세포는 약 0.5 마이크로리터의 세포 현탁액을 개별 웰로 철저히 피펫팅합니다. 풍부한 배지로 잔여 세포를 부드럽게 씻어냅니다. 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 다음 두 단계를 신속하게 수행해야 합니다.
선택적인 단계 플라스마로, 우물에 직접 부딪히지 않도록 주의하면서 칩과 웰을 처리하십시오. 그런 다음 입체경 아래에서 칩을 우물에 조심스럽게 놓고 둘 사이의 정렬에 세심한 주의를 기울입니다. 부드럽게 눌러 PDMS의 두 층을 접착합니다.
약 50마이크로리터의 풍부한 매체로 장치를 천천히 완전히 채우고 채널 내부에 기포가 남아 있지 않은지 확인합니다. 이제 튜브를 적절한 입구에 삽입하는 장치를 연결하고 미디어 흐름을 시작합니다. 튜브에 기포가 형성되지 않도록 주의하면 장치에 끼어 흐름을 파괴할 수 있습니다.
장치를 현미경 아래에 놓고 각각에서 적절한 이미징 지점을 찾습니다. 필요한 경우 1시간 또는 그 이상 동안 세포를 풍부하고 중간 정도의 흐름으로 유지하십시오. 복구를 허용합니다.
일정한 유량 설정으로 실험을 시작합니다. 펌프 A는 시간당 0.8밀리리터로, 펌프 B는 시간당 0.2밀리리터로 펌핑합니다. 매체의 경우 채널 너비의 80% 이상으로 흐릅니다.
상대 유속을 변경하여 장치의 조건을 동적으로 변경할 수 있습니다. 새로운 조건은 전체 채널을 따라 몇 초 내에 안정화되어 서로 다른 변형 간의 분리를 보여줍니다. 두 개의 구별 가능한 효모 균주가 대체 웰에서 이미지화됩니다.
이 실험에서는 웰 사이에 세포 누출이 없습니다. 두 균주 모두 전사 인자 MSN 2를 가지고 있으며, YFP로 태그가 지정되어 동적으로 변화하는 조건의 동시 효과를 테스트합니다. 두 입력 채널의 유속은 포도당 매체가 없는 단계를 생성하도록 변경되었습니다.
그 결과 MSN 2가 핵에 국소화되었습니다. 중요한 것은 단일 세포에서 핵 MSN 2 YFP 수준의 시간 추적을 분석 할 수 있다는 것입니다. 따라서 PDMS 미세유체 장치는 여러 유정에 동시 동적 조건을 적용하는 데 사용할 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안 장치를 조립하는 동안 세포가 건조되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 일단 마스터하면 이 기술은 소프트 리소그래피가 필요 없이 쉽게 수행할 수 있습니다.
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개요
이 연구는 미세 유체 장치를 사용하여 동일한 동적 조건에서 서로 다른 균주의 단일 효모 세포의 거동을 이미징하는 방법을 제시합니다. 이 장치는 여러 균주를 동시에 관찰할 수 있도록 하면서 교차 오염을 방지하도록 설계되었습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 미세 유체 공학
- 세포 이미징
- 효모 생물학
배경
- 다양한 생물학적 연구를 위해 동적 조건에서 세포 거동을 이해하는 것이 중요합니다.
- 기존 방법은 종종 클린룸 환경과 복잡한 제작 기술을 필요로 합니다.
- 이 연구는 실험적 성실성을 유지하면서 프로세스를 단순화하는 것을 목표로 합니다.
- 미세 유체 장치는 세포 연구를 위한 환경 조건을 정밀하게 제어할 수 있습니다.
연구 목적
- 여러 효모 균주의 이미징을 동시에 가능하게 하는 미세 유체 장치를 개발합니다.
- 교차 오염 없이 다른 균주에 동적 흐름 조건을 적용합니다.
- 환경 변화에 대한 효모 세포 반응에 대한 이해를 향상시킵니다.
사용된 방법
- 2층 미세 유체 장치의 제작.
- 장치의 별도의 우물에 서로 다른 효모 균주를 배치합니다.
- 제어된 유속을 통한 동적 흐름 조건의 적용.
- 매체 변화에 대한 세포 반응의 이미징.
주요 결과
- 장치는 다른 효모 균주 사이의 분리를 성공적으로 유지했습니다.
- 이미징은 동일한 동적 조건에서 효모 균주의 뚜렷한 반응을 보여주었습니다.
- 이 방법은 단순성과 효과성 측면에서 기존 시스템에 비해 장점을 보였습니다.
- 실험 동안 우물 사이에 교차 오염이 관찰되지 않았습니다.
결론
- 이 미세 유체 장치는 여러 효모 균주를 연구하기 위한 새로운 접근법을 제공합니다.
- 이 방법은 복잡한 설정 없이 제어된 실험이 가능합니다.
- 미래의 응용은 다른 세포 유형 및 실험 조건으로 확장될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Comparative analysis of multiple cell strains under identical dynamic conditions is critical for early discovery and target validation in biopharma R&D. This microfluidic device enables simultaneous, contamination-free imaging of distinct yeast strains, supporting robust hypothesis testing and mechanistic de-risking. Its accessible fabrication and dynamic control streamline workflows at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct comparison of cellular responses across multiple strains under controlled environmental shifts.
- Supports functional target validation by isolating strain-specific phenotypes in a shared dynamic context.
- Facilitates mechanistic de-risking by eliminating environmental variability as a confounder.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, contamination-free biological systems for downstream quantitative assays.
- Standardizes environmental exposure, enhancing reproducibility and assay reliability.
- Enables high-content imaging and multiplexed readouts for screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns experimental conditions for translational biomarker discovery when using disease-relevant yeast models.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent dynamic perturbations.
- Reduces risk of false positives by ensuring environmental uniformity across strains.
Pipeline & Workflow Integration
This device integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling parallel, quantitative analysis of multiple strains under synchronized dynamic conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by controlling environmental variables across strains.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for compound or genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and mechanistic continuity when relevant to yeast-based disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, easily manufactured platform adaptable to diverse strain panels and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in comparative studies.
- Operational Value: Simplifies device fabrication and standardizes experimental setup across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by enabling direct, quantitative strain comparisons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying strain-specific responses under uniform conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic assembly and quantitative cell imaging.
- Needs access to basic PDMS fabrication tools and standard microscopy infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of environmental flow parameters.
- Adaptable to other model systems with similar size and adherence properties.
- Practical limitations include throughput constraints and manual alignment steps.
