Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

다음 실험의 전체적인 목표는 마우스 배아 줄기세포의 심근세포 분화에 필요한 핵심적인 시간적 조절 기전을 확인하는 것입니다. 이를 위해 먼저 96-웰 라운드 바텀 플레이트에서 배아체(embryonic bodies)를 형성하여 EB 형성을 표준화하고, 두 번째 단계로 정해진 시간 과정에 따라 단백질 또는 화학적 조절제를 EB에 첨가하여 조사 대상 경로의 시간적 조절을 수행합니다.

다음으로, 다양한 신호 조절 방식의 유도 효율을 결정하기 위해 박동하는 EBS를 수동으로 정량화합니다. 형성된 박동하는 EBS의 백분율과 행잉 드롭(hanging drop)법을 이용한 확인을 통해, 심근세포 분화에 필수적인 신호 전달 경로의 시간적 요구 사항을 보여주는 결과가 도출됩니다. 행잉 드롭과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 노동 집약적인 과정을 표준화하고 단순화하여 정량화를 위한 직접적인 판독이 가능하다는 점입니다.

이 방법은 원하는 세포 유형으로의 분화를 유도하는 필수 신호 전달 체계를 식별하는 것과 같이 줄기세포 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 백혈병 억제 인자가 첨가된 마우스 ES 세포 배지를 사용하여 10 centimeter 세포 배양 플레이트에서 마우스 배아줄기세포를 배양하십시오. ES 세포의 합류도가 50-70%가 되면 사용할 준비가 된 것입니다.

ES 배지를 제거하고 멸균된 PBS 5 mL로 세포를 한 번 헹굽니다. 각 플레이트에 0.05% trypsin EDTA 2 mL를 넣고 37°C에서 3~5분 동안 배양합니다. 그다음, 플레이트당 3 mL의 ES 배지를 넣어 trypsin EDTA를 중화시키고 세포를 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.

분당 1000회 회전 속도로 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 원하는 양의 EB 배지로 세포 펠렛을 재부유시킵니다. 세포 수를 측정하고 세포 농도가 5 × 10³ cells/mL가 되도록 희석합니다.

멀티 채널 피펫을 사용하여, 세포가 포함된 EB 배지 100 µL를 96웰 라운드 바텀 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 첨가합니다. 필요한 96웰 플레이트의 수는 실험 조건 및 시점의 수에 따라 달라집니다. 심장 발생의 핵심 신호 전달 경로에 대한 결정적인 시간 범위를 확인하기 위해, 96웰 라운드 바텀 마이크로타이터 플레이트를 습도가 유지되는 37 °C, 5% CO2 배양기에 넣습니다.

특정 신호 전달 경로의 조절제를 ES 세포에 첨가합니다. 96원형 바닥 웰 플레이트의 각 웰에 배지로 희석한 신호 조절제를 다양한 시점에 첨가합니다. 각 96웰 플레이트의 웰 중 절반은 각 처리 시작 시점에 사용됩니다.

각 시간대별로 나머지 48개 웰에 대조군 차량(vehicle control)을 추가합니다. 서로 다른 중단 시점에 각 웰의 배지를 교체하여 신호 조절제(signaling modulators)를 씻어내는데, 이때 배아체(embryonic bodies)가 흐트러지지 않도록 각 중단 시점마다 세심한 주의를 기울여야 합니다. 서로 다른 중단 시점에 EB 배지를 교체하여 조절제를 씻어냅니다. 96웰 플레이트를 약 10도 각도로 기울인 다음, 멀티채널 피펫을 사용하여 웰에서 배지를 조심스럽게 제거합니다.

그 후 48시간 이상의 처리가 필요한 경우에는 각 웰에 조절제가 포함되지 않은 EB 배지를 다시 추가합니다. 원하는 종료 시점까지 2일마다 신선한 조절제가 보충된 EB 배지로 교체합니다. ES 세포를 96웰 플레이트로 옮겨 EB 형성을 유도한 지 7일째 되는 시점에 현미경으로 EB 수축 정도를 관찰합니다.

각 처리 시간 경과에 따른 EBS 수축 비율을 구하기 위해, 수축하는 EBS가 있는 웰을 양성으로 판정합니다. 96-웰 플레이트 실험을 통해 확인된 심장 형성 신호 전달 시간 창은 매달린 방울법으로 제작한 EBS에서 검증할 수 있으므로, 매달린 EB 방울을 제작합니다. 먼저, 나중에 방울이 변형되는 것을 방지하기 위해 페트리 접시에 3~4 mL의 PBS를 추가하여 준비합니다.

다음으로, 최종 밀도가 2.5 × 10⁴ cells/mL로 준비된 ES 세포 현탁액을 접근이 용이하도록 박테리아 디쉬에 붓습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 페트리 디쉬의 뒤집힌 뚜껑 위에 ES 세포 20 µL 방울을 떨어뜨립니다. 이때 개별 방울들이 서로 서로 닿지 않도록 주의합니다.

일반적으로 뚜껑 하나당 최대 80개의 방울을 배치할 수 있습니다. 그 다음, PBS가 담긴 페트리 접시 위에 뚜껑을 다시 덮고 37°C, 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하여 EB가 형성되도록 합니다. 48시간 후, 각 뚜껑의 매달린 방울에서 형성된 EB를 3 mL의 EB 배지로 씻어 내립니다.

EBS 뚜껑 두 개를 새로운 페트리 접시에 옮깁니다. 페트리 접시를 37 °C, 5% CO₂ 배양기에서 4일 동안 배양하고, 4일째에 부유 상태의 EBS를 0.2% Gelatin 코팅된 6-well 플레이트로 옮깁니다. 각 well에 30개의 EBS를 옮긴 후, 96-well 플레이트 실험에서 확인된 기간 동안 신호 조절제를 처리하며, 이는 현탁 방울(hanging droplets) 생성 7일 후까지 진행합니다.

현미경으로 EBS를 관찰하여 EB 수축 여부를 확인합니다. 96웰 플레이트의 라운드 바닥 웰에서 배양된 ES 세포는 이 대표 이미지의 4일 차 형성된 EB와 같이 EBS를 형성합니다. ES 세포의 심근 분화에 있어 결정적인 시점은 차량 대조군과 비교했을 때 신호 조절제 처리 시 수축하는 EBS의 비율이 가장 높게 나타나는 시간 구간입니다. 여기에는 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 분화 10일 차에 도르살 모르핀(dorsal morphine) 처리된 ES 세포로부터 형성되어 자발적으로 수축하는 심근세포 초점이 나타나 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 ES 세포의 심장 형성 과정에서 주요 신호 전달 경로의 핵심적인 시간적 조절 창을 효율적으로 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.