Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

다음 실험의 전반적인 목표는 마우스 배아 줄기 세포에서 심근세포 분화에 필요한 중요한 시간적 조절을 확인하는 것입니다. 이는 먼저 96웰의 둥근 바닥판에서 배아체를 형성하여 두 번째 단계로 EB 형성을 표준화함으로써 달성됩니다. 단백질 또는 화학 조절제는 미리 결정된 시간 경과에 걸쳐 EBS에 추가되며, 이를 통해 검사 중인 경로를 일시적으로 제어할

다음으로, 다양한 신호 변조 방식의 유도 효율을 결정하기 위해 Beating EBS를 수동으로 정량화합니다. 형성된 박동 EBS 비율과 행잉 드롭 방법을 사용한 확인에 기초하여 심근세포 분화를 위한 필수 신호 전달 경로의 시간적 요구 사항을 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 행잉 드롭과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 노동 집약적인 절차를 표준화 및 단순화하고 정량화를 위한 간단한 판독을 허용한다는 것입니다.

이 방법은 줄기세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 원하는 세포 유형으로 분화를 지시하는 필수 신호 응고를 식별하는 것과 같은 이 절차를 시작하는 데 도움이 될 수 있습니다. 백혈병 억제 인자를 보충한 마우스 ES 세포 배지가 있는 10cm 세포 배양 플레이트에 있는 Gro 마우스 배아 줄기 세포. ES 세포가 50-70% 합류점에 도달하면 사용할 준비가 된 것입니다.

ES 매체를 제거하고 5ml의 멸균 PBS로 세포를 한 번 헹굽니다. 각 플레이트에 0.05% 트립신 EDTA 2밀리리터를 첨가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 3-5분 동안 배양합니다. 다음으로, 플레이트당 3ml의 ES 배지로 EDTA의 트립을 소멸시키고 세포를 50ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.

3분 동안 분당 1000회전으로 회전합니다. 원심분리 후, supinate를 제거하고 원하는 양의 EB 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포 수를 세고 세포를 5 곱하기 10으로 10 밀리리터 당 3 개의 세포로 희석합니다.

멀티채널 피펫을 사용하는 EB 배지에서 세포를 포함하는 EB 배지 100마이크로리터를 96개의 둥근 바닥 웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 필요한 96개의 웰 플레이트의 수는 실험의 조건 수와 시점에 따라 달라집니다. 96개의 둥근 바닥 웰 마이크로타이터 플레이트를 가습된 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에 넣어 심장 발생을 위한 주요 신호 전달 경로의 중요한 시간 창을 식별합니다.

특정 신호 전달 경로의 조절제는 ES 세포에 추가됩니다. 96개의 둥근 바닥 웰 플레이트에는 다양한 시점에서 각 웰에 매체로 희석된 신호 변조기를 추가합니다. 각 96웰 플레이트에 있는 웰의 절반은 각 처리 시작 시점에 사용됩니다.

차량 제어는 각 시점에 대해 다른 48개의 웰에 추가됩니다.서로 다른 정지 지점에서, 우리는 매체를 변경하여 각 웰에서 신호 변조기를 세척할 것이며, 다른 정지 시점에서 배아체가 파괴되는 것을 방지하기 위해 이 작업을 수행할 때 세심한 주의를 기울여야 합니다. 웰의 EB 매체를 변경하여 변조기를 세척합니다. 96웰 플레이트를 약 10도 각도로 기울이고 멀티채널 피펫으로 웰에서 매체를 부드럽게 제거합니다.

그런 다음 48시간 이상의 처리를 위해 각 웰에 조절제가 없는 EB 배지를 다시 추가합니다. 원하는 정지 시간까지 이틀에 한 번씩 새로운 조절제가 보충된 EB 매체를 교체하십시오. EBS 세포를 96웰 플레이트로 옮겨 유도한 지 7일 후, 현미경으로 EB 수축을 조사합니다.

계약된 EBS가 있는 우물을 긍정적인 것으로 점수를 매겨 서로 다른 치료 시간 경과에 대해 계약된 EBS의 비율을 구합니다. 96개의 웰 플레이트 실험에서 확인된 심장 발생에 대한 신호 전달의 시간 창은 매달린 EB 액적을 만들기 위해 매달린 액적으로 만든 EBS에서 확인할 수 있습니다. 먼저 나중에 비말의 수차를 방지하기 위해 3-4 밀리리터의 PBS를 첨가하여 페트리 접시를 준비하십시오.

다음으로, 밀리리터당 4개의 세포에 대해 2.5 곱하기 10의 최종 밀도로 준비된 ES 세포 현탁액을 박테리아 접시에 부어 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 ES 세포 20마이크로리터 방울을 페트리 접시의 거꾸로 된 뚜껑에 추가합니다. 개별 방울이 서로 닿지 않도록 하십시오.

일반적으로 뚜껑 하나에는 최대 80방울까지 들어갈 수 있습니다. 그런 다음 섭씨 37도의 이산화탄소 5% 인큐베이터에서 48시간 동안 PBS 인큐베이트가 들어있는 페트리 접시의 뚜껑을 다시 열어 EB가 형성될 수 있도록 합니다. 48시간 후, 각 뚜껑에 물방울이 매달려 형성된 EBS를 3ml의 EB 배지로 씻어냅니다.

EBS 뚜껑 두 개를 새 페트리 접시에 넣습니다. 4일째에 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 페트리 접시를 4일 동안 배양하고 현탁액의 EBS를 일반적으로 0.2% 젤라틴으로 코팅된 6개의 웰 플레이트로 옮깁니다. 30개의 EBS는 매달린 액적이 만들어진 후 7일 후에 96개의 웰 플레이트 실험에서 확인된 기간 동안 각 웰 인큐베이트 신호 조절기로 전달됩니다.

EB 수축을 위해 현미경으로 EBS를 관찰하십시오: 96웰 플레이트의 둥근 바닥 웰에서 자란 ES 세포는 4일째에 형성된 EB의 대표적인 이미지에서 볼 수 있듯이 EBS를 형성합니다. ES 심장 형성의 중요한 시점은 차량 대조군과 비교할 때 신호 조절자에 의해 치료되는 EBS의 수축 비율이 가장 높은 시간대입니다. 여기에 표시된 것은 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 분화 10일째에 등쪽 모르핀으로 처리된 ES 세포에서 형성된 심근세포의 자발적으로 수축하는 초점입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 ES 심장 발생에서 주요 신호 경로의 창인 중요한 시간 조절을 효율적으로 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.