Name: Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 학습하세요 마우스 배아줄기세포를 이용한 심근세포 분화의 핵심 신호전달 경로 시간적 조절을 정량화하는 방법. 96웰 플레이트 표준화된 어세이로 심장발생 효율을 측정하고 재생의학 연구에 활용하세요.

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이 작품은 베테랑 어페어스와 NIH 보조금 5U01HL100398 및 1R01HL104040 지원했다.

1. 잘 microtiter 접시를 96 라운드 바텀를 사용하여 배아 바디 (EB) 형성 <ol><li> 난생과 보충 마우스 ES 세포 매체와 10cm의 세포 배양 접시에 마우스 ES 세포를 성장. </li><li> ES 세포는 (일반적으로 50~70%의 합류에서) 사용을위한 준비가되면, ES 미디어를 제거하고 멸균 PBS 5ml로 한 세포를 씻어. </li><li> 3 ~ 5 분 37 각 플레이트와 부화 플레이트 ° C에 2ml 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가, 3 ML ES 매체와 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)이 끄다. </li><li> 3 분 1,000 rpm으로 50ml 팔콘 튜브와 스핀에 세포를 전송합니다. </li><li> 뜨는 제거하고, resuspend 세포 펠릿 EB 미디어의 원하는 금액과 함께. </li><li> 휴대폰 번호를 카운트하고 EB 미디어 5 X10 3 셀 / ML로 세포를 희석. </li><li> 라운드 잘 microtiter 접시 - 96 각 우물에 세포를 포함 EB 미디어 100μl를 추가하는 멀티채널 피펫을 사용합니다. </li><li> 플레이스 96 - 인큐베이터에 둥근 잘 microtiter 접시. </li></ol> 2. cardiogenesis에 대한 주요 신호 경로 (S)의 중요한 시간 창을 확인 <ol><li> 각 96 예 일 0 일 1 일 2 일 3 일 4 우물의 등 반 등 다양한 시간 지점에서 ES 세포를 포함하는 96 - 웰 microtiter 플레이트의 각 우물에 특정 신호 경로 및 차량 제어 모듈 레이터 추가 - 잘 플레이트는 (48 웰스) 치료의 각 시작 시점에 사용됩니다. </li><li> 다른 정지 시간 지점에서 매 48 우물을위한 EB 미디어를 변경하여 모듈 레이터를 씻으십시오. 예를 들어, 하루 0부터 시작하는 ES 세포의 두 가지 일 치료를 위해 하루에 2 변조기를 씻으십시오. 더 이상 치료 48 시간보다 원하는 정지 시간이 지점까지 이틀 신선한 변조기와 보충 EB 미디어를 변경합니다. </li><li> 일 6.25 후 현미경 EB 수축을 검사합니다. 각기 다른 치료 시간 코스 EBS를 계약의 비율을 얻기 위해서는 긍정적인 사람으로 EBS를 계약으로 우물을 점수. </li><li> ES의 cardiogenesis에 대한 중요한 시간이 지점은 차량 제어에 비해 EBS는 신호 변조기에 의해 처리 계약의 높은 비율을 포함하는 시간 프레임입니다. </li></ol> 3. EBS에서 cardiogenesis에 대한 신호의 시간 창을 확인 매달려 방울로 만든 <ol><li> 증발을 방지하기 위해 PBS의 3-4 ML로 추가하여 배양 접시를 준비합니다. </li><li> 단계 1.1 ~ 1.5 2.5x10 4 셀 / ML 최종 세포 농도에서 ES 세포를 준비를 따르십시오. </li><li> 쉽게 접근할 세균 그릇에 세포 혼합물을 붓고. 멀티채널 피펫을 사용하여 거꾸로 뚜껑에 20 μl 방울 (약 500 세포를 포함) 추가합니다. 개인 방울 연락하는 것을 허용하지 않습니다. 일반적으로 하나의 뚜껑 80 방울까지 들어갈 수 있습니다. PBS를 포함하는 요리를 통해 다시 뚜껑을 플립. 인큐베이터에서 EB 형성을 허용 24 시간 또는 48 시간 동안 부화. </li><li> EB 미디어과 수영장 새로운 배양 접시에 EBS 2 뚜껑 3 ML 각 뚜껑에서 방울을 걸려에서 형성 EB를 씻으십시오. 10ml의 총 볼륨 EB 미디어를 추가합니다. </li><li> 0.2 % 일 4 젤라틴 코팅 6 - 잘 접시에 정지에 전송 EBS. 일반적으로 30 EBS는 각 잘으로 전송됩니다. 각 잘에 대한 2 ML 최종 볼륨을 얻을 EB 미디어를 추가합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트 실험에서 확인된 기간에 변조기 신호 품어. </li><li> RT - PCR 추가, immunostaining 등, 필요한 경우의 특징 수 일 7 cardiogenesis 후 현미경 EB의 수축을 관찰. </li></ol>

<ol><li>Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+a+source+of+regenerative+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes.</a> Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).</li>
<li>Foley, A. C., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+induction+by+Wnt+antagonists+depends+on+the+homeodomain+transcription+factor+Hex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex.</a> Genes Dev. 19, 387-396 (2005).</li>
<li>Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+biphasic+roles+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+cardiomyogenesis+and+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).</li>
<li>Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling%2C+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

매달려 드롭 방식 EB 형성과 체외의 차별화에 사용되는 종래의 방법을하고 있습니다. 그러나, 그것은 힘드는이며 물류 문제로 인해 실험 유연성을 제한합니다. 실험자의 기술이 달린 방울로 성공 EB 형성 및 조작하는 데있어 매우 중요합니다 같은 토큰에 의해 결과도 확인이 더 어렵습니다. 간단한 방법은 단일 단계 과정으로 둥근 바닥 96 - 웰 플레이트에 EBS를 형성하는 것입니다. 이 포맷은 표준으로 체외 차별에 수 있으며 EB 형성 및 다운 스트림 조작 (예 : 변조기 추가 또는 제거)의 용이성으로 인해 더 많은 실험 조건을 수용할 수 있습니다. 또한, 96 - 웰 플레이트 형식은 마우스 ES 세포에서 효율적인 심사 도구로 최적화할 수 있습니다.

<ul><li> 마우스 CGR8 세포는 주로 사용됩니다. </li><li> ES 매체 : 10 % 열 inactivated FBS와 보충 GMEM 미디어, 2 MM L - 글루타민, 2 - 메르 캅 토 에탄올 0.05 MM, 200 U / ML murine 평범한. </li><li> EB 매체 : 20 % 열 inactivated FBS와 IMDM 미디어를 준비, 1.6 MM L - 글루타민, 2 - 메르 캅 토 에탄올 0.08 MM, 그리고 1X 멤 비 필수 아미노산 솔루션입니다. </li></ul>

cardiogenic 유도 효율을 quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

pluripotent 줄기 세포의 분화는 밀접하게 여러 주요 신호 경로의 시간적 및 공간적 규정에 의해 제어됩니다. 의 이해에 장애물 중 하나는 분화의 효율을 주요 신호 이벤트의 변경 내용을 연관의 다양한 방법을하고 있습니다. 우리는 여기서 / β - catenin Wnt와 cardiogenic 유도하는 동안 BMP 신호 활성화를위한 중요한 시간 윈도우를 식별하는 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 기반 분석의 사용을 설명합니다. 96 - 웰 플레이트 형식으로 배아 기관 (EBS)을 계약에 대한 점수로, 우리는 신속하게 cardiogenic 효율성을 계량 및 / Wnt β - catenin 및 특정 변조기 트리 트먼트 다음 시간 코스 BMP 신호 활성화를위한 중요한 시간 창을 확인할 수 있습니다. 여기에 설명된 교장 선생님은 혼자 심장 유도에 한정되지 않고 여러 셀 lineages의 연구 방향으로 적용할 수 있습니다. 또한, 96 - 웰 형식은 더 높은 처리량, 더 정교한 실험 가설의 시험 수 있도록 자동화된 분석으로 개발할 수있는 잠재력이 있습니다.

우리는 / β - catenin Wnt와 cardiogenic 유도하는 동안 BMP 신호 활성화를위한 중요한 시간 윈도우를 식별하는 마우스 ES 세포 기반 분석의 사용을 설명합니다. 방법은 안정 cardiogenic 효율성을 단정 표준화된 플랫폼을 제공하고, 다른 세포 lineages의 연구에 적용됩니다.

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

다능성 줄기세포의 분화는 여러 핵심 신호 전달 경로의 시간적 및 공간적 조절에 의해 엄격하게 제어됩니다. 한 가지 난제는...

다음 실험의 전반적인 목표는 마우스 배아줄기세포의 심근세포 분화에 필요한 핵심적인 시간적 조절 기전을 규명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 96-웰 라운드 바텀 플레이트에서 배아체(EB)를 형성하여 EB 형성 과정을 표준화하고, 두 번째 단계로 정해진 시간 경과에 따라 단백질 또는 화학적 조절제를 EB에 첨가함으로써 조사 대상 경로의 시간적 제어를 수행합니다.다음으로, 다양한 신호 조절 체계의 유도 효율을 결정하기 위해 박동하는 EBS를 수동으로 정량화합니다. 박동하는 EBS의 형성 비율과 hanging drop법을 이용한 확인을 통해 심근세포 분화에 필수적인 신호 전달 경로의 시간적 요구 사항을 보여주는 결과를 얻습니다. hanging drop과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 노동 집약적인 절차를 표준화 및 단순화하여 정량화를 위한 직접적인 판독이 가능하다는 점입니다.이 방법은 원하는 세포 유형으로의 분화를 유도하는 핵심 신호 전달 응고 체계를 식별하는 것과 같이 줄기세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor)가 첨가된 마우스 ES 세포 배지를 사용하여 10cm 세포 배양 플레이트에서 마우스 배아줄기세포를 배양합니다. ES 세포의 합류도(confluence)가 50~70%에 도달하면 사용할 준비가 된 것입니다.ES 배지를 제거하고 멸균된 PBS 5 mL로 세포를 한 번 헹굽니다. 각 플레이트에 0.05% trypsin EDTA 2 mL를 첨가하고, 37 °C에서 3~5분 동안 배양합니다. 다음으로, 플레이트당 ES 배지 3 mL를 넣어 trypsin EDTA 반응을 중단시킨 후, 세포를 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.분당 1000회 회전 속도로 3분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후 상층액을 제거하고 원하는 양의 EB 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포 수를 측정하고 세포 농도가 5 × 10³ cells/mL가 되도록 희석합니다.멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 라운드 바텀 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 세포가 포함된 EB 배지 100 µL를 분주합니다. 필요한 96웰 플레이트의 수는 실험 조건 및 시점의 수에 따라 달라집니다. 심장 형성의 주요 신호 전달 경로에 대한 결정적인 시간 범위를 확인하기 위해, 96웰 라운드 바텀 마이크로타이터 플레이트를 습도가 유지되는 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에 배양합니다.특정 신호 전달 경로의 조절제를 ES 세포에 첨가합니다. 96-웰 라운드 바텀 플레이트의 각 웰에 배지로 희석한 신호 조절제를 다양한 시점에 첨가합니다. 각 96-웰 플레이트 웰의 절반은 각각의 처리 시작 시점에 사용됩니다.각 시점마다 나머지 48개 웰에 차량 대조군(vehicle control)을 추가합니다. 서로 다른 정지 시점에서, 배지를 교체하여 각 웰의 신호 조절제(signaling modulators)를 세척하며, 이때 배아체(embryonic bodies)가 흐트러지지 않도록 각별히 주의해야 합니다. 서로 다른 정지 시점에 맞춰, 웰의 EB 배지를 교체하여 조절제를 세척합니다. 96-웰 플레이트를 약 10도 각도로 기울이고 멀티채널 피펫을 사용하여 웰에서 배지를 조심스럽게 제거합니다.그 후, 48시간 이상의 처리가 필요한 경우 각 웰에 조절제가 없는 EB 배지를 다시 추가합니다. 원하는 종료 시점까지 이틀마다 신선한 조절제가 보충된 EB 배지로 교체하십시오. ES 세포를 96웰 플레이트로 옮겨 EBS가 유도된 지 7일째 되는 시점에 현미경으로 EB 수축 상태를 관찰합니다.각 처리 시간 경과별로 수축하는 EBS의 백분율을 구하기 위해, 수축하는 EBS가 있는 웰을 양성으로 판정합니다. 96-웰 플레이트 실험을 통해 확인된 심장 형성 신호 전달의 시간 창은 매달린 방울법(hanging droplet)으로 제작된 EBS에서 검증할 수 있으므로, 매달린 EB 방울을 제작합니다. 먼저, 나중에 방울이 변형되는 것을 방지하기 위해 페트리 접시에 3~4 mL의 PBS를 추가하여 준비합니다.다음으로, 최종 밀도가 2.5 × 10⁴ cells/mL가 되도록 준비한 ES 세포 현탁액을 접근이 용이하도록 박테리아 배양 접시에 붓습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 페트리 접시의 뒤집힌 뚜껑 위에 ES 세포 20 µL 방울을 떨어뜨립니다. 이때 개별 방울들이 서로 닿지 않도록 주의하십시오.일반적으로 덮개 하나당 최대 80방울까지 담을 수 있습니다. 그런 다음 덮개를 PBS가 들어 있는 페트리 접시 위로 다시 뒤집어 37 °C, 5% carbon dioxide 배양기에서 48시간 동안 배양하여 EB가 형성되도록 합니다. 48시간 후, 각 덮개의 매달린 방울에서 형성된 EBS를 3 mL의 EB 배지로 씻어 내립니다.두 개의 EBS 뚜껑을 새 페트리 접시에 옮깁니다. 페트리 접시를 37 °C, 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 4일 동안 배양합니다. 4일째에 부유 상태의 EBS를 일반적으로 0.2% Gelatin이 코팅된 6-웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에 30개의 EBS를 옮긴 후, 96-웰 플레이트 실험에서 확인된 기간 동안 신호 전달 조절제를 처리하여 배양합니다. 이는 현탁 방울(hanging droplets)을 만든 지 7일 후가 됩니다.현미경 하에서 EBS를 관찰하여 EB 수축 여부를 확인합니다. 96-웰 플레이트의 라운드 바텀 웰에서 배양된 ES 세포는 4일 차에 형성된 EB의 대표 이미지와 같이 EBS를 형성합니다. ES 세포의 심근 분화에 있어 결정적인 시점은 차량 대조군과 비교했을 때 신호 조절제 처리에 의해 수축하는 EBS의 비율이 가장 높은 시간 창을 의미합니다. 여기에는 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 분화 10일 차에 dorsal morphine 처리된 ES 세포로부터 형성된 자발적으로 수축하는 심근세포 초점이 나타나 있습니다.이 영상을 시청한 후, ES 심장 발생 과정에서 주요 신호 전달 경로의 결정적인 시간적 조절 창을 효율적으로 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

이 원고는 Gata4, Hand2, Mef2c 및 Tbx5의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 다양한 재프로그래밍된 심장 아형의 생성 및 정량화를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

여기 선물이 심장 생리학을 모방 하는 전기 및 기계적 자극을 사용 하 여 셀 인구를 교육 하기 위한 프로토콜. 이 전기 자극 치료 세포의 cardiomyogenic 잠재력을 강화 하 고 더 세포 치료, 질병 모델링 및 의약품 심사를 위한 유망한 전략 이다.

셀의 Cardiomyogenic 잠재력 향상을 동시 전기 및 기계적 자극

우리는 여기에 설명, Tg의 설립 및 응용 프로그램 (Myh6-cre)1Jmk / J /Gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)(CAG-GCaMP3)(αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 아래라고함) 심장 재프로그래밍 평가를 위한 마우스 리포터 라인. 마우스 균주로부터 분리된 신생아 심장 섬유아세포(NCFs)는 유도된 심근세포(iCM)로 변환되어 칼슘(Ca2+) 플럭스를 통해 iCM의 재프로그래밍 효율과 기능성 성숙을 편리하고 효율적으로 평가할 수 있습니다.

GCaMP3 리포터와 심장 특정 칼슘 플럭스를 측정하여 심장 재프로그래밍의 체외 평가

생쥐의 심근 경색 부위 주변의 초음파 유도 세포 전달은 안전하고 효과적이며 편리한 세포 이식 방법입니다.

심근 경색 마우스에서 초음파 유도 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 이식

레이저 천공과 미세 전극 어레이(MEA)의 조합은 배양된 일차 및 줄기 세포 유래 심근 세포의 활동 전위와 유사한 기록을 가능하게 합니다. 파형 모양은 표준 기록보다 테스트 화합물의 작용 모드에 대한 우수한 통찰력을 제공합니다. 패치 클램프와 MEA 판독값을 연결하여 향후 심장 안전 연구를 더욱 최적화합니다.

안전성 약리학의 예측 가능성을 높이기 위해 미세 전극 어레이에서 심근 세포의 레이저 유도 활동 전위와 유사한 측정

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝

이 프로토콜은 발달 중인 마우스 심장에서 심장 세포의 전기천공법 기반 형질전환(transgenesis)을 위한 상세한 방법론적 프레임워크를 제시합니다. 여기에 제공된 비디오 자산은 이 다재다능한 기술을 쉽게 배울 수 있습니다.

마우스 배아 심장에서 유전자 전달을 위한 효율적인 transgenesis 접근법

이 프로토콜은 악티노마이신 D 처리, RT-qPCR, 비선형 회귀분석을 사용하여 마우스 배아 줄기세포 내 유전자 간 및 유전자 내 강화자 RNA의 안정성과 반감기를 정량적으로 측정합니다. 위치별 정규화 전략이 eRNA 붕괴 역학을 맥락 의존적으로 정확하게 모델링하기 위해 도입됩니다.

마우스 배아 줄기세포에서 증강제 RNA 안정성의 최적화된 정량적 평가

학습하세요 마우스 배아줄기세포를 이용한 심근세포 분화의 핵심 신호전달 경로 시간적 조절을 정량화하는 방법. 96웰 플레이트 표준화된 어세이로 심장발생 효율을 측정하고 재생의학 연구에 활용하세요.

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

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