프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

이 방법은 심장 재프로그래밍 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 어떤 경로가 심근 발생을 촉진하거나 복구하는지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이전에 발표된 방법보다 더 높은 효율성으로 기능적 유도 심근세포를 생성할 수 있다는 것입니다. 이러한 화학성 심장 질환은 심근세포의 손실과 심장 기능 장애를 초래합니다.

따라서 이 기술은 섬유아세포를 기능적 유도 심근세포로 전환함으로써 높은 복구에 도움이 될 수 있습니다. 레트로바이러스 생산을 시작하려면 PE 배지에서 백금 E 또는 PE 세포를 성장시킵니다. 생물 안전 레벨 2 캐비닛에 있는 10CM 접시에 있는 선택 마커로 보충하십시오.

이틀에 한 번씩 세포가 1-4 또는 1-5 정도로 희석됩니다. 계획된 형질주입 하루 전, 10CM 배양 접시에 10ML의 성장 배지에 PE 세포를 파종한 다음 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔듭니다. 세포가 고르게 분포할 수 있도록 접시를 인큐베이터에 조심스럽게 넣고 24시간 동안 배양합니다.

트랜스펙션 당일, 1.5ML 튜브에 GHMT2M 칵테일을 첨가합니다. 그런 다음 360마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 별도의 1.5ML 튜브에 추가합니다. 그런 다음 36마이크로리터의 transfection 시약을 감소된 혈청 배지에 추가하고 튜브를 부드럽게 튕겨 혼합합니다.

실내 온도를 5분 동안 배양합니다. 이 단계에서 사용되는 트랜스펙션 시약은 플라스틱에 결합합니다. transfection 효율을 피하려면 transfection 시약을 환원된 혈청 배지에 직접 피펫팅하고 피펫 팁을 튜브 벽에 접촉하지 마십시오.

그런 다음 GHMT2M DNA 칵테일을 포함하는 튜브에 환원된 혈청 배지 형질주입 시약 혼합물을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 튕겨 섞고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 마지막으로 형질주입 반응 혼합물을 PE 세포에 적하적으로 첨가합니다.

10-15초 동안 접시를 부드럽게 휘젓습니다. 형질주입된 세포를 섭씨 37도에서 16-20시간 동안 배양합니다. 이제 60MM 접시에 콜라겐을 코팅하고 섭씨 37도에서 최소 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 갓 해동한 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 콜라겐이 코팅된 접시에 분배합니다. 그리고 60MM 접시당 4ML의 최종 부피에 성장 배지를 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔들어 인큐베이터에 넣으십시오.

MEF를 도금할 때 셀을 균일하게 도금하는 것이 중요합니다. 접시를 휘젓지 마십시오, 이는 고르지 않은 플레이팅을 유발할 수 있습니다. 대신 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔들고 조심스럽게 인큐베이터에 넣으십시오.

PE 세포 형질 주입 후 24시간 후에 30ML 주사기를 사용하여 세포에서 생성된 레트로바이러스 배지를 수집합니다. 레트로바이러스 매체의 첫 번째 컬렉션을 45마이크로미터 주입 크기 필터를 통해 50ML 원뿔형 튜브에 넣습니다. 그런 다음 PE 세포가 치환되지 않도록 주의하면서 접시 벽에 10ML의 신선한 성장 배지를 추가합니다.

섭씨 37도에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 다음으로 바이러스 상등액이 들어있는 50ML 원추형 튜브에 밀리리터 헥시딘 메스린 브로마이드 형질 주입 시약 7.2 마이크로 리터의 10MG를 추가합니다. 이제 MEF에서 배지를 흡인하고 갓 수확한 레트로바이러스 배지 4ML를 접시에 추가합니다.

섭씨 37도에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. PE 세포의 형질 주입 후 48시간이 지나면 레트로바이러스 배지를 채취하고 첫 번째 채취와 정확히 동일한 방식으로 형질 주입을 수행합니다. 레트로바이러스 배지의 두 번째 수집 후 PE 세포를 버리고 레트로바이러스 배지와 접촉하는 모든 재료에 10% 표백제를 첨가합니다.

배양 후 MEF에서 레트로바이러스 배지를 흡인하고 05 마이크로몰, TGF 베타 유형 1 수용체 억제제를 포함하는 ICM 배지 4ML를 첨가합니다. 더 사용할 때까지 이틀에 한 번씩 ICM 매체를 교체하십시오. 면역염색을 시작하려면 14일째부터 ICM 배지를 흡인하고 MEF를 재프로그래밍합니다.

그런 다음 12웰 플레이트의 웰당 1X 얼음처럼 차가운 PBS 1ML로 세포를 한 번 세척합니다. 다음으로 PBS를 흡인하고 500마이크로리터의 2%파라포름알데히드를 첨가하여 세포를 고정하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 파라포름알데히드를 흡인시킨 후 PBS 1ML로 세포를 3회 세척합니다.

PBS를 흡입한 후 500마이크로리터를 첨가합니다. 02%Triton X 100을 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다. Triton X 100의 흡인에 따라 실온에서 30분 동안 500마이크로리터의 10%호스 혈청으로 세포를 차단합니다.

다음으로, 말 혈청을 흡인하고 희석된 1차 항체 500마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 1차 항체를 흡인시킨 후 PBS 1ML로 3회 세척합니다.

PBS를 마지막으로 세척한 후 희석된 2차 항체 500마이크로리터를 추가합니다. 접시를 호일로 싸서 실온에서 1시간 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 마지막으로 2차 항체를 흡인하고 PBS 1ML로 3회 세척합니다.

플레이트를 호일로 싸서 이미징이 완료될 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다. 이 방법은 MEF를 심근세포로 변환하는 고효율 변환을 보여줍니다. 대표적인 유세포 분석 분석인 transduction 후 9일째를 추가하면 세포의 약 70%에서 활성화된 심장 트로포닌 T 발현이 나타납니다.

유사하게, 심장 알파 액티닌 발현은 GFP 형질 주입 대조군과 비교할 때 세포의 약 55%에서 관찰됩니다. 또한, 형질도입 2주 후에 수행된 심장 마커에 대한 면역 염색은 대부분의 세포가 트로포닌 I, 알파-액티닌 및 트로포닌 T를 발현하는 것을 보여주었습니다. 또한, 알파-액티닌 또는 트로포닌 T 및 Cx43과 함께 ICM을 공동 표지하면 인접 세포 사이의 간극연접이 형성됩니다.

GHMT2M 형질도입 및 A83O1 처리는 8일째까지 MEF의 일부를 박동 세포로 재프로그래밍합니다. 11일째에는 제곱센티미터당 약 10,000개의 박동 세포가 관찰됩니다. 자발적인 칼슘 과도 현상은 박동하는 심근세포에서 감지됩니다.

베타 아드레날린 작용제인 이소프로테레놀(isoproterenol)을 첨가하면 자발적인 칼슘 일시현상의 빈도가 크게 증가합니다. 대조적으로, L형 칼슘 채널 차단제 니페디핀의 선동은 칼슘 과도현상의 빈도를 현저히 감소시킨다. 이 비디오를 시청한 후에는 섬유아세포를 고효율로 기능적이고 유도된 심근세포로 재프로그래밍하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 프로토콜에 따라 RNA 염기서열분석 및 칩 염기서열분석을 포함한 다른 방법을 사용하여 심장 재프로그래밍 중에 전체 유전자 발현 및 염색질 상태와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 레트로바이러스로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 프로토콜을 수행하는 동안 생물 안전 레벨 2 캐비닛에서 작업하고, 개인 보호 장비를 착용하고, 모든 레트로바이러스 폐기물을 적절하게 처리하는 것과 같은 예방 조치를 항상 구현해야 합니다.