Name: 프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 마우스 태아 섬유아세포를 심근세포로 재프로그래밍하는 효율적인 방법을. GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1, miR-133 과발현과 TGF-β 신호 억제를 통해 7일 만에 수축하는 심근세포를 생성하고 심장 재생 의학에 활용합니다.

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이 연구는 Boettcher 재단의 웹 주의 생물 의학 연구 프로그램, 미국 심장 협회 과학자 개발 그랜트 (13SDG17400031), 콜로라도의 대학 학과 의학 뛰어난 초기 경력에서에서 기금에 의해 지원 되었다 학자 프로그램, 콜로라도 사단의 심장 Barlow Nyle 기부금의 대학 및 NIH R01HL133230 (캔사스)에. A.S.R 섬유 증 연구 및 번역 (CFReT)에 대 한 NIH/NCATS 콜로라도 CTSA 보조금 번호 TL1TR001081와 콜로라도 대학 컨소시엄에서 미리 박사 친목에 의해 지원 되었다. 이 연구는 암 센터 지원 그랜트 (P30CA046934), 피부 질환 연구 코어 그랜트 (P30AR057212), 그리고 콜로라도의 대학 Anschutz 의료 캠퍼스에서 Flow Cytometry 코어에 의해 또한 지원 되었다.

동물을 요구 하는 모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 UC 덴버 Anschutz 의료 캠퍼스에 의해 승인 되었다.
1입니다. MEFs의 격리
<ol><li>E13에서 임신 마우스 C57BL/6를 구입. 밤새 배.</li>
	<li>승인 된 IACUC 프로토콜에 따라 어머니를 안락사 (예: ~1.3 L/분 CO2 동물 죽은 나타날 때까지 다음 자 궁 경관 탈 구)</li>
	<li>70% 에탄올으로 어머니를 살포 하 고 복 부 구멍을 엽니다. 포함 된 배아 자 궁 경적을 제거 하 고 살 균 PBS로 10 cm 접시에.</li>
	<li>출시 배아 배아 삭에서 절 개를 확인 합니다. 10 cm 살 균 PBS 가진 접시를 청소 하는 배아를 전송 합니다. 철저 하 게 린스.</li>
	<li>간 아래 시체를 잘라내어 머리와 상체를 삭제. 내부 장기를 제거 하 고 삭제. 나머지 조직 살 균 PBS 가진 깨끗 한 10 cm 접시에 전송 하 고 Biosafety 수준 1 또는 2 캐비닛에 접시를 전송. 깨끗 하 고 마른 10 cm 접시에 모든 배아에서 조직을 결합 하 고 정밀한 조각으로 말하다.</li>
	<li>다진된 배아를 0.25 %trypsin / 1 mM EDTA의 6 mL를 추가 합니다. 조직 헤어 피 펫에 의해 여러 번 triturate. 40 분 5% CO2와 37 ˚C에서 품 어.</li>
	<li>성장 매체 (표 1)에 셀 resuspend 미디어의 볼륨은 수확 하는 배아의 수에 따라 조정 됩니다. 일반적으로, 약 1.2 배아 당 25 mL 성장 매체의 비율을 사용 합니다.</li>
	<li>플레이트 25 mL 15 cm 접시에 resuspended 셀의. 24 시간 후 미디어를 발음 하 고 각 플레이트에 신선한 성장 매체의 25 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>72 h, 후 각 15 cm 접시를 0.25 %trypsin / 1 mM EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다. 셀 문화 접시에서 분리 때 trypsin 15 mL 성장 매체를 비활성화 하 고 50 mL 폴리스 티 렌 원뿔 튜브에 세포를 수집 합니다. 실 온에서 160 x g 에서 3 분에 대 한 셀 원심 70 µ m 기 공 셀 스 트레이너를 통해 성장 매체 및 필터 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 동결 매체에서 2 백만 셀 aliquots에 MEFs를 동결 (10 %DMSO, 25 %FBS Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) / 높은 포도 당)-80 ° c.에 사용할 준비가 될 때까지 24 시간 및 저장소 후 액체 질소에 셀 전송. 참고: MEFs의 글로벌 유전자 발현은 프로 파일링 RNA 시퀀싱으로이 프로토콜을 사용 하 여 절연 (RNA-seq) 셀 인증 되도록. 인코딩 MEF 세포에서 RNA-seq 데이터 취득 번호 GSE93454에서 NIH 유전자 식 옴니 버스 (지 오)을 다운로드 했다. 우리가 사용 하는 MEFs에 대 한 RNA-seq 유전자 표현 데이터 취득 번호 GSE71405와 NIH GEO에 예금 되었다. 이러한 두 데이터 세트는 일반적인 유전자 기호에 따라 병합 했다. 식 데이터 다음 로그-변형 되었다 그리고 우리의 MEFs 및 인코딩 MEFs 식 데이터 scatterplot 생성 되었고 선형 회귀선 (그림 1A)와 맞는. MEFs이이 프로토콜을 사용 하 여 절연 분자로 다른 실험실에 의해 고립 된 그 유사 하다.</li>
</ol>2. 레트로 바이러스와 MEFs의 변환의 생산
참고:이 섹션의 모든 단계 됩니다 실행 한다 Biosafety 수준 2 캐비닛에. 때문에이 프로토콜 활용 retroviral 변환, 그 안전 주의 모든 바이러스 성 미디어 프로그래밍에 대 한 타임 라인에 대 한 적어도 20 분 그림 1B 를 참조에 대 한 10% 표 백제와 함께 포함 된 낭비 치료 등을 확인 합니다.
<ol><li>
백 금 전자 (PE) 셀 라인을 사용 하 여 레트로 바이러스의 생산
	<ol>
<li>상업적으로 이용 가능한 PE 셀 PE 매체 (표 1) 포함 blasticidin 그리고 puromycin 선택 마커 개 그-의 표현 되도록 유지 효율적인 retroviral 입자 생산36유류 그리고 env 유전자 . 1:4 또는 1:5 매 2 일에서 통행 세포. 이 retroviral 생산 수율 저하로 세포의과 밀을 방지 하기 위해 주의.</li>
		<li>-1 일에 씨앗 10 cm 접시에 성장 매체 (표 1) 16-20 h 당 약 5 x 106 세포 transfection 전에 (다른 표준 셀 문화 접시 크기에 대 한 밀도 도금 표 2 참조). 부드럽게 바위 요리 앞뒤로 여러 번와 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터도 도금 배포 되도록 신중 하 게 자리 (transfection 전에 최적의 도금 밀도 그림 1C 참조). 참고: 플레이트 PE 셀 선택 마커 생성된 retroviral 입자를 포함 하는 매체 MEFs 죽 일 하지 않습니다 있도록 transfection 이전 무료 매체 주의.</li>
		<li>당일 0, transfection에 대 한 DNA를 준비 합니다. 10 cm 접시 transfection 추가 재활 각 요소의 2 µ g-GATA4, Hand2, Tbx5, Mef2c 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m)-1.5 mL 튜브에. 참고: 다른 표준 셀 문화 접시 크기 transfect 하는 데 필요한 DNA의 양을를 표 2 를 참조 하십시오.</li>
		<li>별도 1.5 mL 튜브에 360 µ L 감소 된 혈 청 미디어를 추가 합니다. 36 µ L transfection 시 감소 된 혈 청 미디어를 직접 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 터치 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어. 참고: 감소 transfection 효율을 피하기 위해, 감소 된 혈 청 미디어에 직접 신중 하 게 transfection 시 약 추가.</li>
		<li>GHMT2m DNA 칵테일에 감소 된 혈 청 미디어/transfection 시 혼합물을 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 터치 하 고 15 분 동안 실 온에서 품 어. 와 동 하지 마십시오.</li>
		<li>PE 셀에 dropwise 반응 혼합물을 추가, 부드럽게 미디어에 대 한 10-15, 소용돌이 하 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기에. 참고: 제조 업체에 따라 PE 세포 생성 10의 평균 titer6 107 감염 단위/mL. 이 프로토콜 약 2 x 106 감염 단위/mL 24 h 6 x 106 감염 단위/mL 평균 4의 나에 대 한 48 h에 의해 생성 됩니다. 있으 나 transfection GFP/DsRed의 경우; transfection/변환 효율에 대 한 대리로도 사용할 수 있습니다. transfection 효율 48 h (그림 1C) 90%를 초과할 전망 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MEFs의 변환
	<ol>
<li>0 일에 콜라겐과 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터 2 h 이상에서 요리 코트.</li>
		<li>액체 질소 및 해 동에서 MEFs를 제거 합니다. 플레이트 0.2 x 106 세포 성장 매체에 60 m m 접시 당. 부드럽게 되도록 락 접시 도금 유통도 하 고 인큐베이터에 (다른 표준 셀 문화 접시 크기에 대 한 밀도 도금에 대 한 최적의 도금 밀도 및 표 2 에 대 한 그림 1C 참조). 참고: 이러한 도금 밀도 격리 된 MEFs;의 여러 일괄 처리를 통해 테스트 되었습니다. MEFs 디스플레이 크게 생존을 손상 하지 않는 셀 시드 밀도 조정 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>당일 1, 24 h 후 transfection 30 mL 주사기를 사용 하 여 PE 세포에 의해 생성 된 retroviral 매체를 수집. 50 mL 원뿔 관으로 0.45 μ m 기 공 크기 필터를 통해 매체를 전달 합니다. 6 µ g/mL의 최종 농도를 hexadimethrine 브 로마 이드 transfection 시 약을 추가 합니다. 신중 하 게 세포의 변위를 방지 하기 위해 문화 접시의 벽에 pipetting 미디어 여 PE 셀에 10 mL 신선한 성장 매체를 추가 합니다.</li>
		<li>MEFs에서 매체를 발음 하 고 각 접시에 갓 수확된 retroviral 매체의 4 mL를 추가 합니다. 인큐베이터에 MEFs를 반환 합니다. 무력화 retroviral 입자 바이러스 매체 접촉 모든 재료를 10% 표 백제를 추가 합니다.</li>
		<li>하루 2, 48 h 후 transfection, 2.2.2, 2.2.3 단계를 반복 합니다. PE 셀 retroviral 매체의 2nd 컬렉션 다음 삭제 됩니다. 참고: 20 분 이상 원치 않는 레트로 바이러스를 무력화 폐기 PE 셀에 10% 표 백제를 추가 합니다.</li>
		<li>3 일에 MEFs에서 매체를 발음 하 고 보충 4 mL iCM 매체 (표 1) 0.5 µ M를 포함 하는 TGF-β, A-83-01 유형 I 수용 체 억제제. 2 일 마다 A-83-01을 포함 하는 iCM 매체를 보충. 참고: 변환 제어로 GFP를 사용 하는 경우 식 예정입니다 90% 초과이 시간 포인트 (그림 1C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 심장 마커 Cytometry
<ol><li>하루 9에서 aspirate 매체 죽은 세포와 파편 제거를 1 x PBS를 가진 MEFs와 세척 (1x) 재설정.</li>
	<li>37 ˚C에서 5 분 동안 0.25 %Trypsin / EDTA 1 mL를 추가 합니다. 가벼운 현미경을 사용 하 여 셀을 확인 하 고 흔들어 접시; 셀 연결 된 남아 있으면 세포 분리 될 때까지 5 더 분 37 ˚C에서 품 어.</li>
	<li>70 µ m 기 공 셀 스 트레이너를 통해 5 %FBS 필터를 포함 하는 1 x PBS에 세포를 씻어.</li>
	<li>실내 온도 펠 릿에서 aspirate 액체에 3 분 동안 160 x g 에서 원심. 참고: 셀 수확량 증가, 약 50 µ L 액체를 셀 펠 릿 위에 둡니다.</li>
	<li>1 %BSA 포함 하는 500 µ L 1 x PBS를 가진 세포를 씻어.</li>
	<li>얼음에 0.2 mL/1 백만 셀과 셀 20 분 고정 솔루션을 수정.</li>
	<li>1 x 얼음 파 마/워시 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 제조업체의 해결책은 10 배 이다.</li>
	<li>4 ° C에서 5 분 동안 160 x g 에서 세포를 원심 하 고 상쾌한 발음.</li>
	<li>추가 시간 3.7-3.8 단계를 반복 합니다. 2차 세척 후 다음 단계를 직접 진행 또는 하룻밤 4 ° C에서 세포를 유지.</li>
	<li>5% 염소 혈 청 및 실 온에서 30 분 동안 파 마/워시 버퍼 x 1 혈 청 당나귀의 100 µ L를 차단 합니다.</li>
	<li>희석된 주 항 체의 100 µ L를 추가 합니다. 참고:이 프로토콜에 대 한 셀은 표시 마우스 분 T (1: 200) 그리고의 비율 척도를 α-actinin (1: 200) 마우스 세포 심장 sarcomere의 주요 구성 요소에 대 한 긍정적인. 실 온에서 1 h에 대 한 1 차적인 항 체를 품 어.</li>
	<li>160 x g 4 ° C에서 5 m에서 세포를 원심, 상쾌한, 발음 및 차가운 파 마/워시 버퍼 2 배를 씻어.</li>
	<li>희석된 이차 항 체의 100 µ L를 추가 합니다. 참고:이 프로토콜에 대 한 셀 안티 마우스 647 nm 이차 항 체 (1: 200)으로 표시 했다. 이차 항 체는 이상 끝 튜브 회전자에 실 온에서 45 분을 품 어. 호 일에 튜브를 배치 하 여 빛 으로부터 세포를 보호 합니다.</li>
	<li>160 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심, 상쾌한, 발음 및 차가운 파 마/워시 버퍼 2 배를 씻어.</li>
	<li>PBS에서 1 %BSA 1 mL을 추가 하 고 즉시 FACS를 수행. 참고: 앞으로 대 쪽 분산형 점도 FACS를 수행할 때 가능한 세포를 먼저 게이트를 생성 합니다. 또는 셀을 수정 하기 전에 상용 라이브/죽은 세포 얼룩을 사용 하 여 라이브 식별 하 고 죽은 세포 인구를.</li>
</ol>4입니다. 재설정된 MEFs Immunostaining
<ol><li>주 14에서에서 aspirate 매체 MEFs와 세척 (1x) 얼음 처럼 차가운 PBS x 1 mL 1 재설정. 참고: immunostaining에 대 한 프로그래밍 수행 되었다 항 체 솔루션 볼륨을 최소화 하기 위해 12 잘 판에. 24 잘 접시도 사용할 수 있습니다; 단순히 반 모든 볼륨을 다음.</li>
	<li>발음 및 실 온에서 10 분 동안 500 µ L 2 %paraformaldehyde 셀을 수정.</li>
	<li>발음 하 고 3 번 1 mL 1 x PBS (5 분 실 온에서 세척 당)를 가진 셀을 씻어.</li>
	<li>500 µ L 0.2 %permeabilization 시 약 PBS에 실 온에서 15 분 동안 셀 permeabilize</li>
	<li>발음 하 고 500 µ L 10% 말 혈 청 PBS에 실 온에서 30 분 동안에 차단 합니다.</li>
	<li>발음 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 희석된 주 항 체의 500 µ L로 품 어. 참고:이 프로토콜에 대 한 셀 마우스 분 T 또는 α-actinin (각 1:400) 되었고 공동으로 표시 Connexin 43 (1:400) 또는 분 나 (1:400).</li>
	<li>1 차적인 항 체를 발음 하 고 1 mL 1 x PBS (실 온에서 세척 당 5 분)와 세 번 씻어.</li>
	<li>발음 하 고 실 온에서 1 시간 동안 500 µ L 희석된 이차 항 체와 함께 품 어. 참고:이 프로토콜에 대 한 셀은 표시 반대로 마우스 555 nm 이차 항 체 (1:800) 분 T α-actinin를 인식 하 고 반대로 토끼 488 nm 이차 항 체 (1:800) Connexin 43 나 Troponin I. 인식 하, 핵 물 했다 Hoechst (1:10, 000)입니다. 빛에서 어둠 속에서 배양 하 여 세포를 보호 합니다.</li>
	<li>이차 항 체를 발음 하 고 1 mL 1 x PBS (실 온에서 세척 당 5 분)와 세 번 씻어. 빛 으로부터 세포를 보호 하 고 4 ° c.에 저장을 호 일에 접시 포장</li>
	<li>이미지는 3 채널 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여입니다.</li>
</ol>5. 칼슘 이미징
참고: 경우 10 배 확대에서 이미징, 표준 셀 문화 요리와 접시는 칼슘 이미징에 적합. 높은 확대에 이미징 셀 유리 coverslips 또는 유리 하단 접시에 도금 될 필요 합니다.
<ol><li>중간 발음 및 2 mL (6 잘 플레이트)에 대 한 수정 Tyrode의 솔루션 (140 m m NaCl, KCl, 1.8 m m CaCl2, 5mm 1 m m MgCl2, 포도 당 10 mM, 10 mM HEPES, 0.1 %BSA, 및 1 %pyruvate, pH 7.4) 추가 Fura-2 오전 5 µ M를 포함 하 고 0.1% Pluronic F-127 (D14 t를 구타 하 o d 20) iCMs입니다. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어 참고: 형광 표시기의 냉각을 방지 하기 위해 빛 으로부터 세포를 보호 합니다.</li>
	<li>Fura-2의 디 에스테 르 화 수 있도록 실 온에서 30 분 동안 2 mL Tyrode의 솔루션에 세포를 씻어 오전.</li>
	<li>이미지 회전 디스크 confocal 현미경 검사 법 340 nm 및 380 nm Slidebook 5.5 캘리포니아2 + 이미징 소프트웨어를 사용 하 여. 실 온에서 이미지를 수행 합니다.</li>
	<li>칼슘 과도 340 형광 강도의 비율을 사용 하 여 계산는 380에서 형광 강도에 nm nm.</li>
	<li>원하는 경우, 1 또는 2 µ M isoproterenol 또는 10 µ M iCMs 치료 Nifedipine 칼슘 기준선 칼슘 과도 영상 후 처리를 조작 하. 셀 및 이미지에 화합물을 로컬로 추가 합니다.</li>
</ol>

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<li>Mathison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+reprogramming+to+transdifferentiate+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+adenoviral+vectors%3A+Implications+for+clinical+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

현재 연구 직접 프로 거리 신호 통로의 억제와 함께 요소를 프로그래밍 하는 GHMT2m의 배달을 통해 기능 iCMs에 섬유 아 세포를 재 설 정할 고효율 전략을 설명 합니다. Cytometry, immunofluorescent 이미징, 이미징, 및 셀 카운트, 우리는이 프로토콜에 대부분 셀의 표시 치고 칼슘을 사용 하 성공적인 프로그래밍 받 다 고 CM 혈통 운명 채택. 우리는 반대로 거리의 추가 화합물 TGF-β 유형 포함 나 수용 체 억제제 약 6-fold 박동 iCMs 나타내는 혼자, GHMT2m와 변환에 비해 수 증가 생성 하는 A-83-01 이전 나타났습니다. 프로 거리 신호 심장 프로그래밍에 강한 생 장벽입니다. 이 시스템 따라서 약 cardiomyogenesis;를 관리 하는 메커니즘을 조사 하기 위해 심사 무력화 수 있습니다, A-83-01 함께 작은 분자의 추가 cardiomyogenesis의 부정적인 레 귤 레이 터를 밝히기 수 있습니다. 반대로, GHMT2m 혼자 하는 작은 분자의 추가 cardiomyogen...

허 혈 성 심장 질환은 미국1에서 죽음의 주요 원인. 약 800000 미국인 경험을 첫 번째 또는 재발 성 심근 경색 (MI) 당 년1. 미, 다음 cardiomyocytes (CMs) 및 심장 섬유 증, 활성화 된 심장 섬유 아 세포에서의 죽음 심장 기능2,3손상. 미 다음 심장 마비의 진행 성인 CMs4,5의 가난한 재생 용량 때문 돌이킬 아니다. 현재 임상 치료 질병의 진행을 느리게 하 고 미래의 심장 이벤트6,7,,89의 위험을 감소, 아무 치료 반대로 질병의 진행 하는 무 능력 때문 CMs 후 경색10를 다시 생성 합니다. 새로운 세포 치료 치료 환자 닉 실망 하 떠오르고 있다, 지금까지 미 다음 마음에 줄기 세포를 제공 하는 임상 시험 결정적이 아닌 재생 잠재적인11,12, 나타났습니다. 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
먼저 다카하시 & 야 마나카, 시연 4 녹음 방송 요인의 overexpression에 의해 섬유 아 세포에서 파생 하는 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 생성 세포 치료19에 새로운 돌파구를 문을 열었습니다. 이 세포는 모든 3 개의 세균 층19로 분화 할 수 있다 그리고 CMs의 많은 수를 생성 하기 위한 몇 가지 매우 효율적인 방법을 이전 표시 되었습니다20,21. HiPSC 파생 된 CMs (엉덩이-CMs) cardiomyogenesis를 공부 하는 강력한 플랫폼을 제공 하 고 상해를 따르는 마음을 고치기를 위한 중요 한 의미를 가질 수 있습니다. 그러나, 현재 기형종 형성22의 문제로 인해 변환 장애물을 직면 하는 엉덩이 CMs 그리고 그들의 미 성숙한 성격 프로 arrhythmogenic23을 수 있습니다. HiPSCs로 섬유 아 세포를 프로그래밍 직접 다른 세포 유형으로 섬유 아 세포를 프로그래밍에 관심을 촉발 시켰다. 것 외. 시연 심장 혈통, 직접 프로그래밍에 섬유 아 세포 결과에 GATA4, Mef2c, 및 Tbx5 (그리니치 표준시)의 그 overexpression 이기는 하지만 낮은 효율24. 프로그래밍 효율 Hand2 (GHMT)25의 추가 함께 개선 되었습니다. 이러한 초기 연구 이후 많은 출판물을26,27,,2829, 요인 추가 전사와 재활 요소 칵테일 변경 증명 하고있다 chromatin 한정자30,31, microRNAs32,33또는34 향상을 리드 하는 작은 분자 프로그래밍 효율 및 성숙 유도 cardiomyocyte 같은 셀 (iCMs ).
여기 우리는 높은 효율 iCMs 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)에서 생성 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 우리 이전 보여주었다 GHMT 칵테일 1 미르와 미르-133 (GHMT2m)의 추가 함께 크게 개선 하 고 더욱 향상 프로-거리 경로 변형 성장 인자 (TGF-β) β 신호를 포함 하 여 신호 또는 관련 단백질 키 니 아 제 (바위) 신호 통로 저해35. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리 보여 심장 분 T (cTnT)를 표현 하는 세포의 약 60%, 약 50% α-actinin, 표현 및 높은 구타 셀 수 빠르면 하루 11 프로그래밍 요소와 치료의 변환에 따라 관찰 될 수 있다 TGF-β와 내가 입력 수용 체 억제제 A-83-01. 또한, 이러한 iCMs 갭 정션 단백질 connexin 43 등을 표현 하 고 자연 스러운 수축 및 칼슘 과도. 이전 연구에 비해 효율을 프로그래밍 향상을 표시이 심장 후 경색에 남아 있는 생 세포 인구에서 CMs를 재생성을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>Charles River's Laboratory</td><td>027</td><td>MEF 분리용</td></tr><tr><td>Platinum E(PE) 세포</td><td>Cell Biolabs, INC</td><td>RV-101</td><td>레트로바이러스 생산용</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Gibco</td><td>SH30022. iCM</td><td>, PE 및 성장 매체의 FS 구성</td></tr><tr><td>요소 매체 199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>iCM 매체의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>소 태아 혈청</td><td>쌍둥이 자리</td><td>100106</td><td>iCM, PE 및 성장 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>기증자 말 혈청</td><td>쌍둥이 자리</td><td>100508 500</td><td>iCM 매체의 구성</td></tr><tr><td>요소 MEM 필수 아미노산, 50X</td><td>Life Technologies</td><td>11130051</td><td>iCM의 구성 요소 미디어</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 용액, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td>iCM 미디어 구성 요소 및 칼슘 이미징</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>iCM 미디어</td></tr><tr><td>구성 요소 MEM 비타민 솔루션, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11120-052</td><td>iCM 미디어 구성 요소</td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린-셀레늄</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>iCM 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>iCM 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>iCM, PE 및 성장 매체의 구성</td></tr><tr><td>요소 GlutaMAX (L-글루타민 보충제)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>iCM, PE 및 성장 매체의 구성</td></tr><tr><td>요소 Blasticidin-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td>PE 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>PE 배지</td></tr><tr><td>0.25% 트립신/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>배양 접시에서 세포 분리용</td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>R& D Systems - Tocris</td><td>2939/10</td><td>TGF-&beta를 억제하도록 세포를 치료합니다. 신호 전달 - 고효율 재프로그래밍을 촉진합니다. 0.5 &마이크로에서 사용; M</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>85190</td><td>A-83-01 및 Freeze Medium</td></tr><tr><td></td><td>SureCoat Cellutron</td><td>SC-9035</td> 성분의 희석 및 보관<td>용 MEF 플레이트용</td></tr><tr><td>코팅 접시 FuGENE 6 Transfection 시약</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Transfection 시약</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Media</td><td>Gibco</td><td>11058-021</td><td>Transfection 시약</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-GATA4</td><td></td><td></td><td>플라스미드 함유 리프로그래밍 인자</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Hand2</td><td></td><td></td><td>플라스미드 함유 재프로그래밍 인자</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Mef2c</td><td></td><td></td><td>플라스미드 함유 재프로그래밍 인자</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Tbx5</td><td></td><td></td><td>플라스미드 함유 재프로그래밍 인자</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-1</td><td></td><td></td><td>플라스미드 함유 재프로그래밍 인자</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-133</td><td></td><td></td><td>리프로그래밍 인자</td>pBabe-X</tr><tr><td>GFP</td><td></td><td></td><td>플라스미드 함유 리프로그래밍 인자</td></tr><tr><td>폴리브레네(헥사디메트린 브로마이드)</td><td>시그마</td><td>H9268-5G</td><td>바이러스 유도용. 6 &micro의 농도에서 사용하십시오. g/mL</td></tr><tr><td>진공 필터 + 병(0.22 &마이크로; m 모공)</td><td>Nalgene</td><td>&nbsp; 569-0020&nbsp;</td><td>미디어 필터링용</td></tr><tr><td>주사기</td><td>Bd Vacutainer Labware&nbsp;</td><td>309654</td><td>바이러스 여과</td></tr><tr><td>0.45 &마이크로를 위해; m 필터</td><td>Celltreat</td><td>229749</td><td>바이러스 여과용</td></tr><tr><td>70 &마이크로; m 세포 여과기</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>352350</td><td>MEF 분리 및 유세포 분석용</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm 솔루션</td><td>BD</td><td>554722</td> 유세포 분석 perm/wash buffer<td>용 세포의 고정 및 투과화용</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD</td><td>554723</td><td>세포 세척용 유세포 분석</td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td>세포 세척용</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>VWR</td><td>0332-100g</td><td>유세포 분석 및 칼슘 이미징용</td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>시그마&nbsp;</td><td>G9023</td><td>유세포 분석 세포 차단용</td></tr><tr><td>동키 세럼</td><td>시그마</td><td>D9663-10mg</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>마우스 트로포닌 T</td><td>Thermo Scientific</td><td>ms-295-p</td><td>1:400 IF, 1:200 유세포 분석</td></tr><tr><td>마우스 &alpha;-actinin</td><td>Sigma</td><td>A7811L</td><td>1:400 IF, 1:200 유세포 분석</td></tr><tr><td>Rabbit Connexin 43</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6219</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>토끼 트로포닌 I</td><td>PhosphoSolutions</td><td>2010-TNI</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>62249</td><td>1:10000 IF</td></tr><tr><td>Alexa 488, 토끼</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td>1:800</td></tr><tr><td>IF Alexa 555, 마우스</td><td>Life Technologies</td><td>A-21422</td><td>1:800</td></tr><tr><td>IF Alexa 647, 마우스</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td>1:200 유세포 분석</td></tr><tr><td>27색 ZE5 유세포 분석기&nbsp;</td><td>FACS용</td> <td>Bio-RAD</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148-500mg</td> IF Triton X-100 Promega H5142<td>용 세포 고정용</td></tr> IF EVOS&trade<tr><td></td><td></td><td></td><td>용 세포의 투과화</td></tr><tr><td>용; FL 컬러 이미징 시스템</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMEFC4300</td><td>For IF</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020-5000</td><td>칼슘 이미징</td></tr><tr><td>KCl VWR</td><td></td><td>395</td><td>칼슘 이미징 CaCl</td></tr><tr><td>2</td><td>Fisher</td><td>C614-500</td><td>칼슘 이미징</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>VWR</td><td>97061-352</td><td>칼슘 이미징</td></tr><tr><td>글루코스</td><td>시그마</td><td>G7528-250g</td><td>칼슘 이미징</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H4034-500g</td><td>칼슘 이미징</td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>칼슘 이미징</td></tr><tr><td>Fluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250g</td><td>칼슘 이미징</td></tr><tr><td>Nifedipine</td><td>Sigma</td><td>N7634-1G</td><td>iCM에서의 붕괴 칼슘 과도 상태 - 10 & 마이크로; M</td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>시그마</td><td>I6504-1g</td><td>iCMs에서 칼슘 과도 현상 증가 - 1-2 &마이크로에서 사용; M</td></tr><tr><td>Marianas Spinning Disk 컨포칼 현미경</td><td>3i</td><td></td><td>칼슘 이미징</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Decon Laboratories</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL 원뿔형 튜브</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>227261 15mL 원뿔형 튜브</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>188271 15cm 세포 배양 접시</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>10cm 세포 배양 접시</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>60mm 세포 배양 접시</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 세포 배양 접시</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>657160&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>12 웰 세포 배양 플레이트</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>665180&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 세포 배양 플레이트</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>662160&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

프로 거리 신호 억제 유도 cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 potentiates

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

다른 하나의 체세포 형식의 트랜스-차별화 모델링 하 고 인간의 질병 치료 엄청난 잠재력이 있다. 이전 연구 결과 나타났습니다 그 마우스 배아, 피부, 및 심장 섬유 아 세포 기능 유도 cardiomyocyte 같은 세포 (iCMs)로 재설정 될 수 있습니다 cardiogenic 녹음 방송 요인 Mef2c, GATA4, Hand2 등의 overexpression 통해 고 Tbx5 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보. 그러나, 이러한 이전 연구는 상대적으로 낮은 효율을 나타났습니다. 부상 다음 심장 기능을 복원 하기 위해 심장 프로그래밍 제어 메커니즘 효율과 성숙 iCMs의 향상을 해명 한다.
우리는 이전 프로 거리 신호를 크게 저해 재활 효율을 증가 입증. 여기, 우리는 최대 60%의 재활 효율을 달성 하는 방법 선발. 또한, cytometry, immunofluorescent 이미징 및 칼슘 이미징 재활 효율과 재설정된 섬유 아 세포의 성숙 척도를 포함 하는 여러 가지 방법을 설명 합니다. 여기 상세한 프로토콜을 사용 하 여, 기계 연구 수 이루어져야 심장 프로그래밍의 긍정적이 고 부정적인 레 귤 레이 터를 결정. 이러한 연구는 재활 효율성과 성숙, 인간의 심장 질환 치료 소설 세포 치료로 이어질 수 있는 홍보 하는 대상으로 수 신호 경로 식별할 수 있습니다.

그림 1B에서 위에 설명 된 재활 전략을 사용 하 여, 약 심장 분 T를 표현 하는 세포의 70%와 심장 α-actinin, cytometry 하루 9에 의해 계량을 표현 하는 세포의 약 55 %iCMs 생성 GHMT2m의 변환에 따라 (그림 2A , B). 또한, 대부분의 세포 표현 심장 분 T, 분, 그리고 심장 α-actinin으로 갭 정션 마커 Connexin 43 하루 14 다음 변환 (그림 2C , D)에. 높은 확대와 함께 영상 잘 정의 된 sarcomere 구조 형성 및 간격 접속점 사이 인접 셀 (흰색 화살표, 그림 2D) 형성을 보여준다. 또한, 자발적 수축 및 칼슘 과도 iCMs ...

여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

이 방법은 심장 재프로그래밍 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 어떤 경로가 심근 발생을 촉진하거나 복구하는지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이전에 발표된 방법보다 더 높은 효율성으로 기능적 유도 심근세포를 생성할 수 있다는 것입니다. 이러한 화학성 심장 질환은 심근세포의 손실과 심장 기능 장애를 초래합니다.따라서 이 기술은 섬유아세포를 기능적 유도 심근세포로 전환함으로써 높은 복구에 도움이 될 수 있습니다. 레트로바이러스 생산을 시작하려면 PE 배지에서 백금 E 또는 PE 세포를 성장시킵니다. 생물 안전 레벨 2 캐비닛에 있는 10CM 접시에 있는 선택 마커로 보충하십시오.이틀에 한 번씩 세포가 1-4 또는 1-5 정도로 희석됩니다. 계획된 형질주입 하루 전, 10CM 배양 접시에 10ML의 성장 배지에 PE 세포를 파종한 다음 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔듭니다. 세포가 고르게 분포할 수 있도록 접시를 인큐베이터에 조심스럽게 넣고 24시간 동안 배양합니다.트랜스펙션 당일, 1.5ML 튜브에 GHMT2M 칵테일을 첨가합니다. 그런 다음 360마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 별도의 1.5ML 튜브에 추가합니다. 그런 다음 36마이크로리터의 transfection 시약을 감소된 혈청 배지에 추가하고 튜브를 부드럽게 튕겨 혼합합니다.실내 온도를 5분 동안 배양합니다. 이 단계에서 사용되는 트랜스펙션 시약은 플라스틱에 결합합니다. transfection 효율을 피하려면 transfection 시약을 환원된 혈청 배지에 직접 피펫팅하고 피펫 팁을 튜브 벽에 접촉하지 마십시오.그런 다음 GHMT2M DNA 칵테일을 포함하는 튜브에 환원된 혈청 배지 형질주입 시약 혼합물을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 튕겨 섞고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 마지막으로 형질주입 반응 혼합물을 PE 세포에 적하적으로 첨가합니다.10-15초 동안 접시를 부드럽게 휘젓습니다. 형질주입된 세포를 섭씨 37도에서 16-20시간 동안 배양합니다. 이제 60MM 접시에 콜라겐을 코팅하고 섭씨 37도에서 최소 2시간 동안 배양합니다.그런 다음 갓 해동한 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 콜라겐이 코팅된 접시에 분배합니다. 그리고 60MM 접시당 4ML의 최종 부피에 성장 배지를 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔들어 인큐베이터에 넣으십시오.MEF를 도금할 때 셀을 균일하게 도금하는 것이 중요합니다

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 / β - catenin Wnt와 cardiogenic 유도하는 동안 BMP 신호 활성화를위한 중요한 시간 윈도우를 식별하는 마우스 ES 세포 기반 분석의 사용을 설명합니다. 방법은 안정 cardiogenic 효율성을 단정 표준화된 플랫폼을 제공하고, 다른 세포 lineages의 연구에 적용됩니다.

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

여기에서는 폴리시스트로닉 구조에서 Gata4, Tbx5 및 Mef2c의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 iCM을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 효율성과 품질이 향상된 비교적 균질한 재프로그래밍된 세포 집단을 생성하며 향후 iCM 재프로그래밍에 대한 연구에 유용합니다.

Gata4, Mef2c 및 Tbx5의 최적 비율을 표현하는 폴리 시스 트론 구조를 사용하여 유도 된 심근의 향상 발전

여기에 표시된 것은 탈세포화된 심장 조직에서 세포외 기질 미세 구조를 시각화하는 방법입니다.

침연 (macerated) 조직의 전자 현미경을 스캔하면 세포 외 매트릭스를 시각화하기

이 프로토콜은 높은 수율, 순도 및 생존력을 가진 성체 마우스 심근세포의 재현 가능한 분리 및 장기 배양을 위한 단계별 방법을 설명합니다.

격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

여기에 설명된 프로토콜은 최소 전사 인자 세트의 과발현을 통해 마우스 배아 섬유아세포에서 혈액 프로그램의 유도를 자세히 설명합니다. 이 기술은 조혈, 혈액 질환 및 조혈 줄기 세포 이식에 대한 향후 연구를 위한 플랫폼을 제공하기 위해 인간 시스템으로 변환될 수 있습니다.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 - 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

이 원고는 Gata4, Hand2, Mef2c 및 Tbx5의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 다양한 재프로그래밍된 심장 아형의 생성 및 정량화를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

이 프로토콜에서, 우리는 심근 세포 분화 및 정제를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하는 방법에 대해 설명하고 정교하게, 그리고 더 나아가, Rho 관련 단백질 키나아제 억제제와 함께 이식 효율을 개선하는 방법에 대해 마우스 심근 경색 모델에서 전처리.

로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화

이 프로토콜은 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하는 전사 인자 GATA2, GFI1B 및 FOS의 발현을 강제함으로써 인간 진피 섬유아세포에서 혈생 프로그램의 유도를 입증한다.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

우리는 여기에 설명, Tg의 설립 및 응용 프로그램 (Myh6-cre)1Jmk / J /Gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)(CAG-GCaMP3)(αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 아래라고함) 심장 재프로그래밍 평가를 위한 마우스 리포터 라인. 마우스 균주로부터 분리된 신생아 심장 섬유아세포(NCFs)는 유도된 심근세포(iCM)로 변환되어 칼슘(Ca2+) 플럭스를 통해 iCM의 재프로그래밍 효율과 기능성 성숙을 편리하고 효율적으로 평가할 수 있습니다.

GCaMP3 리포터와 심장 특정 칼슘 플럭스를 측정하여 심장 재프로그래밍의 체외 평가

배우세요 마우스 태아 섬유아세포를 심근세포로 재프로그래밍하는 효율적인 방법을. GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1, miR-133 과발현과 TGF-β 신호 억제를 통해 7일 만에 수축하는 심근세포를 생성하고 심장 재생 의학에 활용합니다.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

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