뇌 절편에 있는 신경 세포의 동시 광학 및 전기 생리학적 모니터링

류 챔버의 메쉬 그리드 위에 폭기된 인공 뇌척수액 또는 aCSF를 관류하는 것으로 시작합니다.

형광 단백질 발현 뉴런이 포함된 뇌 절편을 옮기고 백금 유선 장치로 고정합니다.

정렬을 위해 메쉬 그리드를 회전합니다.

다중 채널 프로브를 슬라이스 쪽으로 내립니다.

형광 단백질 시각화를 위해 필터 큐브를 조정합니다.

슬라이스를 회전하여 프로브를 정렬합니다.

조직 표면 아래의 프로브 높이를 조정합니다.

이제 aCSF를 관류하고 형광 표지된 뉴런에 초점을 맞춥니다.

고배율 대물렌즈를 사용하여 조직에 초점을 맞추고 여기광을 조정합니다.

적절한 광 필터를 사용하여 뉴런의 형광을 관찰합니다.

대물 렌즈를 조정하여 패치 피펫을 위한 공간을 만들고 양압을 가합니다.

다음으로, 피펫을 뉴런 근처에 배치하여 멤브레인 딤플을 형성합니다.

마지막으로 약한 흡입을 가하여 멤브레인 밀봉을 만든 다음 강한 흡입을 가하여 멤브레인을 파괴하고 표적 뉴런에서 전기 기록을 얻습니다.

생체 외 뇌 조직 슬라이드에 다중 채널 프로브를 배치하려면 분당 3-6밀리리터로 기포가 있는 실험용 ACSF를 관류하고 관심 영역을 포함하는 뇌 절편을 현미경 관류 챔버의 메쉬 그리드로 옮깁니다. 백금 하프로 뇌 조각을 고정합니다. 다중 채널 프로브의 원위 끝에 있는 전극 접촉 선이 PL 표면에 거의 수직이 되도록 메쉬 그리드를 회전합니다.

광시야 조명과 마이크로 매니퓰레이터의 미세 제어 하에서 다중 채널 프로브를 슬라이스 표면 쪽으로 내립니다. 피질 구심성신경의 축삭 말단에서 발현되는 형광 리포터 단백질의 시각화를 위해 적절한 필터 큐브를 결합합니다.

필요한 경우 슬라이스를 회전하여 프로브를 PL 표면에 더 정확하게 정렬합니다. 프로브를 슬라이스 평면 바로 위에 배치하고 x축을 따라 최종 목표 위치에서 200마이크로미터 짧게 배치하고 기록되는 조직 영역 외부에 적어도 하나의 채널을 남겨둡니다. 천천히 프로브를 세로 축을 따라 슬라이스에 삽입합니다.

조직의 손상을 최소화하려면 날카로운 끝이 조직 표면 아래에서 볼 수 있는 범위까지만 프로브를 전진시키십시오. 실험용 ACSF 소스를 백에 담긴 대조군 용액으로 전환하고 표적 패치 클램프 기록을 위해 형광 표지 세포를 식별합니다. 조리개를 가장 작은 직경으로 제한하고 다중 채널 프로브와 대물 렌즈 사이의 접촉을 피하도록 주의하면서 고출력 수침 대물렌즈를 맞춥니다. 조직에 초점을 맞춥니다.

다중 채널 프로브에 인접하지만 겹치지 않는 조직 영역 위에 빛을 중앙에 둡니다. Cre 의존성 형광 마커를 발현하는 세포의 이미징을 허용하기 위해 적절한 필터 세트를 사용합니다. 대물 렌즈를 올려 패치 피펫을 내릴 수 있는 충분한 공간을 만듭니다.

패치 피펫에 내부 용액을 넣고 전극 홀더에 장착합니다. 1밀리리터 주사기를 사용하여 약 0.1밀리리터 공기에 해당하는 양압을 가합니다. 패치 피펫을 용액 속으로 내려 시각적 안내에 따라 팁에 초점을 맞추고 표적 세포에서 전체 세포 기록을 얻습니다.