Name: 컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: 배우세요 Culex quinquefasciatus 배아 미세 주입 기술로 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 수행하는 방법을. 이 프로토콜은 64-82%의 배아 생존률과 61% 이상의 생식계 돌연변이율을 달성하여 유전적 벡터 제어 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 O.S.A.로 향하는 UCSD 스타트업 펀드에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

1. C. 퀸케파시아투스 식민지 사육
<ol><li>버그 기숙사 케이지에 C. 퀸케파시아투스 성인의 여러 식민지를 설정합니다. 참고 : 식민지는 코넬 대학에서 박사 로라 해링턴에 의해 제공되었다20. 컬렉스 모기를 사육하기 위한 상세한 프로토콜은 다른문헌(21)에서찾을 수 있다.<ol>
<li>12:12 시간 :야간 주기와 30 %의 습도에서 25 ± 1 °C에서 모기를 유지합니다.</li>
		<li>케이지에 심지와 설탕 용액 용기를 도입하거나 설탕 용액으로 면공을 포화시켜 20% 설탕 용액 광고 리비툼을 제공합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모기가 혈액 공급 전에 적어도 3 일 동안 짝짓기를 허용(그림 2A).</li>
</ol>2. C. 퀸케파시아투스 전 분담 단계 배아의 수집
<ol><li>3-6일 후 백과사전 후, 합성 막을 통해 구형 소 혈액식의 1-2mL을 여성에게 제공하고 혈액 공급 시스템에서 약 40°C로 가열한다(도2B). 컬렉스 모기에 사용할 수 있는 대체 혈액 공급 프로토콜도 있습니다(예: 참조 참조21). 참고: C. 퀸케파시아투스는 조류 혈액을 선호하는 것으로 알려져 있습니다. 일부 실험실은 혈액 식사 소스21,22,23에대한 마취 라이브 조류 또는 조류혈액을사용합니다. 그러나 이 기능이 여러 세대에 걸쳐 선택되면 소 혈액이나 작은 설치류를 먹도록 식민지를 훈련/선택할 수 있습니다.<ol>
<li>여성이 혈액 공급 후 최소 3 일 동안 휴식을 허용하여 미세 주입 실험에 대한 oviposition을 유도하기 전에 oogenesis 및 계란 성숙을 겪게됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배아 미세 주입의 날에, 유기적으로 주입 된 oviposition 물와 oviposition 컵을 만들. oviposition 물은 토끼 대변 (50 g/L), 분해 잔디 (4.5 g/L), 또는 물고기 음식 (25 g/L)을 5 일 이상 동안 물에서 발효하여 만들어야한다24,25.</li>
	<li>oviposition 컵을 케이지에 넣고 전체 케이지를 어두운 위치(그림 2C)에놓습니다.</li>
	<li>30분마다 달걀 뗏목을 마시러 컵을 확인하세요.<ol>
<li>달걀 뗏목이 있는 경우 페인트 브러시로 뗏목을 수거하여 젖은 필터 용지에 놓습니다(그림2D, E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. C. 퀸케파시아투스 전 분비전 배아의 정렬
<ol><li>뗏목을 누르고 잘게 다듬은 페인트 브러시와 집게(그림 2E)를사용하여 개별적으로 계란을 따로 뗏목에서 계란을 분리합니다.</li>
	<li>유리슬라이드(그림 2F)의상단에 배치된 양면 스티커 테이프의 얇은 스트립에 개별 계란을 정렬합니다.</li>
	<li>정렬하는 동안, 쉽게 접근성을 위해 동일한 방향으로 각 계란의 전방 측면을 가리킬 수 있습니다. 참고: 양면 스티커 테이프가 없는 대체 계란 정렬 방법은 이전에 발표된 나소니아 vitripennis 태아 미세 주입프로토콜(26)에서찾을 수 있다.</li>
	<li>할로카본 오일 믹스로 달걀을 덮습니다. 참고: 할로카본 믹스는 두 개의 할로카본 시약과 물(9:1:20, 할로카본 700 : 할로카본 27 : 초순수 수)를 부드럽게 혼합한 다음 할로카본 오일의 수포화를 용이하게 하기 위해 25°C에서 하룻밤 동안 혼합물을 배양함으로써 미리 준비할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 미세 주입을위한 바늘 준비
<ol><li>유리 마이크로피펫 풀러를 사용하여 알루미노실리케이트 모세관 유리 바늘을 생성합니다.<ol>
<li>바늘 풀러의 사용자 설명서의 지침에 따라 알루미노실리케이트 모세관 유리를 바늘 풀러에 넣습니다. 참고: 석영과 보로실리케이트 모세관 바늘도 사용할 수 있지만, 이 실험을 위해 알루미노실리케이트는 상대적인 경제성과 내구성 때문에 선호됩니다.</li>
		<li>열을 516으로 설정하고, 속도는 100으로, 70으로 지연하고, 97로 당기고, 바늘 풀러에 500으로 압력을 가합니다.</li>
		<li>풀러의 지시에 따라 바늘 풀러를 활성화하고 추가 바늘에 필요한 대로 반복합니다. 참고: 주입 과정에서 바늘이 막히거나 실수로 파손되기 때문에 단일 실험을 위해 추가 바늘을 당기는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50° 각도에서 회전 다이아몬드 연마판에 당겨진 바늘 끝을 부드럽게 터치하여 바늘 끝을 구부립니다. 참고: 바늘을 베벨링하면 유체가 흐를 수 있도록 하는 동시에 배아로 쉽게 침투할 수 있는 선명한 팁을 만듭니다. 적절한 바늘의 예는 이전 제에서 볼 수 있습니다26.</li>
	<li>페트리 접시에 모델러의 점토 라인에 담아 바늘을 뽑아 서 보관하십시오. 참고: 바늘 팁에 대 한 최고의 품질을 보장 하기 위해, 바늘 은 신선 하 게 당겨 하 고 가능한 한 주입의 시간에 가까운 beveled 해야 합니다.</li>
</ol>5. 사출 혼합물을 적재
<ol><li>게놈 변형 시약(예를 들어, 200 ng/μL sgRNA 및 200 ng/μL Cas9 혼합물)으로 구성된 사출 혼합물을 준비하거나 선호하는 사출 용액을 얼음위에 보관한다. 참고 : 이 믹스는 계란이 놓일 때까지 기다리는 동안 준비 될 수 있습니다. Cas9 및 sgRNA 생산 및 미세 주입에 대한 준비에 대한 자세한 내용은 이전 간행물27,28,29,30에서확인할 수 있다.</li>
	<li>마이크로 로더 팁을 사용하여 주입 바늘에 주입 혼합물 2 μL을 적재합니다.</li>
</ol>6. 미세 주입 설정
<ol><li>전자 마이크로 인젝터에 연결된 마이크로 조작기 설정에 채워진 주입 바늘을 놓습니다.</li>
	<li>복합 현미경의 단계에 정렬 된 계란을 포함하는 유리 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>미세 조작기 및 복합 현미경을 사용하여 바늘을 정렬하여 25-35 ° 각도로 배아의 후방 끝을 목표로합니다.</li>
</ol>7. 배아 미세 주입(그림 2G)
<ol><li>조심스럽게 배아에 바늘을 삽입하고 배아의 부피의 약 10 %의 양으로 혼합물을 주입 (계란의 크기에 따라 700-800 pL). 참고: 주입 할 때, 계란은 약간 팽창해야하지만, 너무 많은 액체가 주입되는 경우, 계란이 파열 될 수 있습니다, 또는 세포질 액체가 누출 될 수 있습니다.</li>
	<li>한 번에 약 20개의 알을 주입한 다음 중단하고 배아 회복 절차를 수행합니다. 참고 : 주입하는 동안, 나막히거나 휴식 바늘의 높은 기회가있다. 바늘을 통해 흐르는 주입 유체의 부족에 의해 결정 될 수있는 나막이가 발생하는 경우, 전자 마이크로 인젝터에 깨끗한 기능으로 바늘을 청소하거나 바늘을 재veveling시도. 두 단계 모두 작동하지 않으면 준비된 계란이 촉촉하게 유지되도록하면서 새 바늘로 빠르게 변경하십시오.</li>
</ol>8. 배아 회복 및 부화
<ol><li>계란을 5분 이상 방해받지 않고 둡니다. 주입 후 20분 이내에 깨끗한 페인트브러시(그림 2H)로가볍게 칫솔질을 하여 할로카본 오일을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>페인트 브러시를 사용하여 계란을 부드럽게 들어 올려 두 번 증류된 물 한 잔에 넣습니다(그림2I). 수면에 알을 보관하십시오.</li>
	<li>부화(그림 2J)에대한 7 일 동안 매일 계란을 확인합니다.</li>
	<li>정상적인 애벌레 양육절차(21)를따르십시오.</li>
</ol>9. 게놈 수정을 위한 검열
<ol><li>스테레오스코프(도2K)를사용하여 돌연변이 표현형을 위해 주입된 모기를 선별한다.<ol>
<li>쉽게 인식할 수 있는 표현형이 없는 돌연변이를 검증하고, PCR 증폭, T7 엔도누클레스 I 분석, 및 표적영역(31)의서브클링에 의한 시퀀싱에 의해 서열된다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>발아성 내의 유전성 돌연변이를 검출하기 위하여 주입된 개별 사이 추가 십자가를 설치합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC. , Available from: 
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 <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020).</li>
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</ol>

모기 벡터 제어를 위한 유전자 조작된 공구를 생성하기 위한 최근 노력으로, 일반적인 모기 질병 벡터를 위한 배아 미세 주입 프로토콜을 개발하고 최적화할 필요가 있습니다. Aedes와 Anopheles 모기를 위해 방법이 개발되었지만 Culex를 위해 특별히 설계된 프로토콜은 최소한으로 탐구되었습니다. 일반적으로 모기 배아 주입 프로토콜은 3가지 일반적인 단계로 나눌 수 있다: 1) 배아 수집 및 준비, 2) 배아 주입, 및 3) 후 주사 회복. 돌연변이를 성공적으로 생성하려면 세 단계 모두 대상 종에 최적화되어야 합니다. 배아 미세 주입을 위한 이 수정된 프로토콜은 Culex 모기의 성공적인 게놈 공학을 위해 특정합니다.
배아 수집을 극대화하는 것은 배아 미세 주입 프로토콜에서 일반적인 병목 현상입니다. 단기간에 수집된 계란의 수를 늘리기 위해 모기는 혈액 식사 후 2-3일 동안 oviposition 기판에서 제한되었다. C. 퀸케파시아투스는 포유류 의 근원 또는 포유류 혈액으로 수유하는 막반대로 조류 혈액 원을 선호하는 경향이 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 그러나, 많은 연구원은 혈액 공급에 대 한 라이브 조류 또는 조류 혈액의 신뢰할 수 있는 소스를 취득 하는 어려움, 그래서 실험실 주식 더 접근 가능한 혈액 소스에 피드에 적응 될 수 있습니다. 또한 C. 퀸케파시아투스 및 대부분의 다른 컬렉스 벡터에 대한 oviposition 신호를 제공하기 때문에 배강기기류에 영양이 풍부한 물을 사용하는 것도 중요합니다. 영양이 풍부한 물을 생성하는 많은 방법이 있으며, 미세 주입을 위해 적절한 수의 계란을 보장하기 위해 실험실 간에 최적화해야 할 수도 있습니다. 예를 들어,이 방법은 5 일 이상 탈온 화 된 물에 발효 토끼 대변으로 가장 성공적이었지만, 다른 연구자들은 영양 공급원으로 잔디 또는 생선 음식과 더 많은 성공을 거두었으며 일부는증류수(21)로도더 많이 성공했습니다.
컬렉스 모기가 뗏목에 계란을 낳기 때문에 계란을 수집하는 것은 매우 간단합니다. 달걀은 페인트 브러시로 뗏목 전체를 스푸핑하여 수집할 수 있습니다. 계란 분리는 더 복잡하지만 성공적인 주입에 필수적입니다. 달걀은 페인트 브러시 또는 집게로 달걀 사이에 부드러운 하방 압력을 가하여 뗏목에서 조심스럽게 분리 할 수 있습니다. 몇 가지 연습으로, 여러 사용자가 안정적으로 계란 뗏목에서 단일 계란을 분리 할 수 있었다. 각 계란을 분리한 후, 계란은 양면 끈적끈적한 테이프에 동일한 방향으로 정렬되어 미세 주입 중에 계란을 안정시킵니다. 계란은 테이퍼 후방 끝에 주입되고 할로카본 오일을 첨가하면 조작 중에 계란을 촉촉하게 유지합니다.
미세 주입 중 배아 손상을 제한하려면 주사 바늘이 적절한 강도여야하며 적절한 각도로 베브해야합니다. 50° 각도에서 10초 동안 구겨진 알루미노실리케이트 바늘은 최상의 결과를 보였지만, 보로실리케이트와 석영 바늘은 내구성이 낮고 더 비싸더라도 효과가 있을 수 있습니다. 또한, 적절한 바늘 베벨링은 Cas9 및 sgRNA 혼합물의 더 나은 흐름을 용이하게하고 배아로 쉽게 침투할 수 있도록 선명한 지점을 만듭니다. 많은 경우에, beveling신속 하 게 막힌 된 바늘을 대체 하는 시간과 노력을 지출 하는 대신 막힌 된 바늘을 해결 하는 효율적인 방법.
주입 후, 계란은 깨끗한 페인트 브러시로 부드럽게 닦아 할로카본 오일이 즉시 제거되는 동안 적어도 5 분 동안 방해받지 않도록 유지해야합니다. 할로카본 오일을 제거한 후 주입된 계란을 물에 배치하여 부화할 수 있으며, 이는 일반적으로 주입 후 3일 이내에 발생합니다. 연습과 계란의 충분한 수로, 이 프로토콜은 C. quinquefasciatus에 있는 일관된 체세포 및 생식선 돌연변이를 달성할 수 있고 그밖 Culex 모기에 쉽게 적응할 수 있어야 할 충분히 다재다능합니다.

C. 퀸케파시아투스는일반적으로 남부 집 모기로 알려져 있으며, 웨스트 나일 바이러스 (WNV), 일본 뇌염, 세인트 루이스 뇌염 및 동부 말 뇌염을 포함한 수많은 병원균의 유능한 벡터입니다. 특히, 1999년 뉴욕에서 처음 발견된 이래, WNV는 미국 대륙 전역의 주요 벡터 매개 질병이 되었으며, 1999년과 2018년 사이에 약 2,300명의 사망자가 발생하고 2008-2019년 사이에 4,500건 이상의 말사례가보고되었습니다. 또한 북미에서 발견되는 최소 23종의 조류종은 WNV3의결과로 복구할 수 없는 것으로 분류된 최소 12종의 WNV 감염의 영향을 받았습니다. WNV가 인간, 말 및 조류 집단에 미치는 영향은 벡터의 기회적 공급 행동 때문입니다. 일반적으로 조류는 WNV의 주요 호스트이며 인간과 말은 부수적이거나 막다른 호스트입니다. C. quinquefasciatus에 의해 벡터된 몇몇 병원체는 조류 말라리아 기생충, Plasmodium 유물과같은 조류를 감염합니다. 하와이에서 C. 퀸케파시아투스는 조류 말라리아의 주요 벡터이며 많은 토착 조류 종4,5의멸종을 일으켰습니다.
C. quinquefasciatus에의해 전달되는 질병을 통제하기 위하여는, 연구원 및 벡터 통제 기관은 살충제 응용 프로그램 6과 같은 일반적으로 확립된 모기 인구 통제 공구를 이용했습니다6,그러나, 이러한 방법은 종 특정이 아닌 비용이 많이 들고, 많은 C. quinquefasciatus 인구6,7,8,9에서높은 살충제에 대한 저항이 높기 때문에 제한된 효과를 갖는다. Wolbachia-기반인구 통제 전략과 같은 다른 제어 기술은 최근10,11에서 개발되었지만, Wolbachia 감염과 관련된 피트니스 비용은 이벡터(12)에대한 이 접근법의 타당성을 제한한다. 또한 Aedes aegypti13, 14, 아노펠레스 감비아(15) 및 아노펠레스 스네이16과같은 다른 모기 종에서 개발된 유전자 기반 조절 방법이 있는데, 병원균 내성 모기17,18,19의개발을 포함하여, 재구성도구가 설계되는 경우 C. quinquefasciatus를 위해 개발될 수 있다. 이 종을 위해 개발. 그러나, C. quinquefasciatus 생물학은 이 벡터에서 유사한 유전 기술의 발달을 어렵게 만든 그밖 Aedes 및 Anopheles 모기 벡터와 크게 다릅니다. CRISPR 기반 게놈 엔지니어링 기술이 등장하면서 정밀 게놈 엔지니어링은 점점 더 사소하고 저렴하며 적응력이 뛰어나므로 다양한 종에서 새로운 유전 적 도구가 개발되었습니다.
CRISPR 기반 기술로 돌연변이를 생성하기 위해, 원하는 loci에 보완되는 Cas9 단백질 및 합성 가이드 RNA(sgRNA)의 혼합물은 전 blastoderm 단계 배아로 마이크로인주사된다. C. quinquefasciatus 암컷이 떠다니는 뗏목구조(그림 1)에부착된 그룹으로 알을 낳기 때문에 개별 계란, Aedes 및 Anopheles 모기의 특성, 배아 미세 주사는 이 종에서 점점 더 복잡해지고 있습니다. 컬렉스 애벌레는 또한수면(도 1)과접촉하는 각 계란의 전방 측에서 나타나므로 난자 방향 사후 조작이 이 종에서 중요하다. 여기에서 우리는 C. quinquefasciatus 태아로 Cas9 단백질 및 sgRNA의 미세 주입을 위해 디자인된 상세한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 적시에 계란 수집 및 계란 생존을 위한 열쇠인 특정 단계를 통해 배아 생존 및 게놈 돌연변이 비율을 향상하기 위하여 Culex 생물학에 유일한 특성을 수용하기 위하여 디자인되었습니다.

<table><tbody><tr><td>9 oz 투명 플라스틱 애완 동물 컵</td><td>Karat</td><td>C-KC9</td><td>곤충 사육 및 계란 수집</td></tr><tr><td>알루미노실리케이트 유리 모세관 튜브 1mm(외경) X 0.58mm(내경)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>미세 주입, 붕규산 및 석영 바늘도 사용할 수 있지만 우리는 알루미노실리케이</td></tr>트 <tr><td>Blood</td><td>Colorado Serum Company</td><td>31025</td><td>를 선호했습니다.군체는 이 혈액 공급원에 적응하는 데 여러 세대가 걸렸습니다. 다른 혈액 공급원도 마찬가지로 적절할 것입니다. 혈액 공급원 선택에 대한 프로토콜 노트를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>4F2222</td><td>NLS</td></tr><tr><td>PNABio</td><td>CP01</td><td>미세 주입</td>화합물 현미경을 사용한 곤충 사육 케이지<td>Cas9 단백질</td></tr><tr><td></td><td>Olympus BX41</td><td></td><td>미세 주입, 배아 주입용</td></tr><tr><td>다이아몬드 연마판(0.7u - 2.0u 팁 크기)</td> <td>Sutter Instruments</td><td>104E</td><td>미세 주입, 베벨러</td></tr><tr><td>DNase/RNase-Free 증류와 함께 사용 Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>Scotch</td><td>B084NVQGXD</td><td>Microinjection, 배아 정렬</td></tr><tr><td>Femtojet 4x 또는 4i 프로그래밍 가능한 microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Femtotips Microloader tips Fisher</td><td>Scientific</td><td>E5242956003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>미세주입, 배아 채취</td></tr><tr><td>세미 팁 페인트 브러시</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td>미세주입, 배아 정렬</td></tr><tr><td>할로카본 오일 27</td><td>시그마-알드리치</td><td>H8773</td><td>미세주입, 배아 정렬</td></tr><tr><td>할로카본 오일 700</td><td>시그마-알드리치</td><td>H8898</td><td>미세주입, 배아 정렬</td></tr><tr><td>Hemotek</td><td>Hemotek</td><td>PS5</td><td>라인 유지보수</td></tr><tr><td>Microelectrode Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td>Microinjection, needle beveling</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 또는 P-2000</td><td>Microinjection, 바늘 당기는</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Microinjection, 배아 정렬</td></tr><tr><td>Non-Dry 모델링 Clay</td><td>Jovi</td><td>B0025Z71IM</td><td>Microinjection, 바늘 저장</td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>올림푸스</td><td>SZ51</td><td>미세 주입, 배아 정렬용</td></tr><tr><td>설탕</td><td>도미노</td><td></td><td>20% 설탕 용액 성인 설탕 공급원.</td></tr><tr><td>T7 엔도뉴클레아제 I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td>미세주입 재료 준비</td></tr><tr><td>TOPO TA 클로닝 키트</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>K451020</td><td>미세주입 재료 준비</td></tr><tr><td>초미세 팁 집게</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td>미세주입, 배아 정렬</td></tr></tbody></table>

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

컬렉스 퀸케파시아투스는 조류 말라리아, 웨스트 나일 바이러스(WNV), 일본 뇌염, 동부 말 뇌염, 림프성 필라리아증 및 세인트 루이스 뇌염과 같은 다양한 벡터 매개 질병의 벡터입니다. 특히, 조류 말라리아는 수많은 풍토성 섬 조류 종의 멸종에 중요한 역할을하고있다, WNV는 미국에서 중요한 벡터 매개 질병이되고있다 동안. C. quinquefasciatus 생물학에 대한 추가 통찰력을 얻고 그들의 유전 통제 공구 상자를 확장하기 위하여, 우리는 이 종에 있는 게놈 공학을 위한 더 효율적이고 적당한 방법을 개발해야 합니다. 그러나, Culex 모기, 특히 그들의 계란 뗏목에 특유의 몇몇 생물학 특성은, 게놈 공학에 필요한 미세 주입 절차를 능력을 발휘하기 어렵게 만들었습니다. 이러한 과제를 해결하기 위해, 우리는 Culex 모기의 독특한 특성과 관련된 기술적 장애물을 완화하는 데 초점을 맞춘 최적화 된 배아 미세 주입 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 절차는 C. quinquefasciatus에서 성공적인 미세 주입에 필수적인 계란 수집, 달걀 뗏목 분리 및 기타 취급 절차에 최적화 된 방법을 보여줍니다. CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술과 결합될 때, 이 절차는 우리가 고급 게놈 공학을 수행하고 이 중요하지만 현재 연구되지 않는 질병 벡터에서 유전 통제 기술을 개발하는 데 필요한 사이트 특정, 효율적이고 유전성 생식선 돌연변이를 달성할 수 있게 합니다.

이전에 발표된 실험에서 이 방법은 어두운 안료의 발달에 중요한 유전자의 체세포 및 생식선 돌연변이를 성공적으로 생성하기 위해 사용되었다, 흰색 (CPIJ005542)30 (표 1). CRISPR/Cas9 생성된 체세포 돌연변이는 주입된 개별의 pupal 단계 눈에서 착색의 손실을 위한 검열에 의해 득점되었다 (G0). 체세포 돌연변이는 일반적으로 모든 세포가 돌연변이 표현형을 가지고 있지만 일부하지만 모조 표현형으로 존재하였다. 예를 들어, 백색 유전자의 체세포 돌연변이는 색소 침착이 결여된 표현형과 야생형 색소형 표현형30을가진 옴마티디아의 혼합물을 초래하였다. 그러나 백색 유전자의 생식선 돌연변이가 있었을 때, 그러나, 차세대(G1)는전체 백색 눈 표현형을 승계하였다. 생식선 돌연변이 율은 모자이크 G0 개인을 교차하고 완전히 흰색 눈 자손에 대한 점수 (G1)에의해 결정되었다. 이러한 실험으로 인해 64%에서 82%의 배아 생존율뿐만 아니라 37%에서 57%의 체세포 돌연변이 발생율 및 &gt;61% 생식선 돌연변이 발생률(표1)을초래하였다. 동일한 유전자에서 다중 로시를 표적으로 하는 sgRNAs를 멀티플렉스함으로써, 체세포 및 생식선 돌연변이 발생률은 86%(표1)만큼상향 증가했다. 또한, 여러 세대에 걸쳐 백색 돌연변이의 가능한 동질주들이 실험실에 성공적으로 보관되어 왔습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> 그림 1: C. 퀸케파시아투스 달걀 뗏목과 단일 계란 형태. 도르살(A),측면(B),및 복부(C)C quinquefasciatus 계란 뗏목의 전망. C. 퀸케파시아투스 암컷은 수면을 더 구근 전방으로 만지는 구근 전방으로 알을 낳고,수면(D)에서더 뾰족한 후방을 가리킨다. A- 전방; P-후방이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> 그림 2: 미세 주입에 의한 C. 퀸케파시아투스 돌연변이를 만들기 위한 타임라인입니다. C. 퀸케파시아투스 식민지 제제 및 미세 주입을 위한 배아 수집의 타임라인(A-D). 수집된 계란은 동일한방향으로 정렬되고 할로카본오일(F)으로덮여 있습니다. 계란은 그 때 주입(G)할로탄소 오일(H)를제거하기 전에 최소 5 분 동안 휴식을 허용한다. 그런 다음 계란은 부화(J)를위해 깨끗한 수원(I)으로옮겨지고 돌연변이 표현형(K)을검사합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">생존</td>
			<td colspan="3">체세포 모자이크 (G0)</td>
			<td>생식선 돌연변이 발생 (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>합계(%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>합계(%)</td>
			<td>G1 돌연변이 (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 백색을 표적으로 하는 단 하나 및 멀티플렉스 gRNA로 주입된 태아의 생존 그리고 돌연변이 비율. 테이블은30의 허가하에 다시 인쇄됩니다.

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구와 함께 작동하도록 최적화된 Culex quinquefasciatus 태아를 위한 미세 주입 절차를 기술합니다. 이 기술은 이 저학질병 벡터에 있는 유전 기술을 구축하는 데 사용될 수 있는 사이트 특정, 유전성, 생식선 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

배아 미세주입 기술은 수많은 유전자 기반 벡터 제어 도구의 개발을 위한 길을 열었습니다. 수많은 곤충 종들이 이미 잘 발달된 프로토콜을 가지고 있지만, Culex quinquefasciatus는 상대적으로 연구가 부족한 상태로 남아 있습니다. 이 미세주입 프로토콜은 난자 채취, 난자 뗏목 분리 및 주입 후 절차를 포함하여 Culex quinquefasciatus의 고유한 생물학적 특성을 수용하도록 특별히 설계되었습니다.이 방법은 관심 있는 모든 Culex 종에 적용할 수 있으며 유전자 기능을 연구하거나 Culex 종에 대한 유전자 기반 제어 기술을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 뗏목에서 알을 분리하는 것으로 시작하십시오. 집게나 붓을 사용하여 뗏목을 누르고 개별 알을 떼어냅니다.유리 슬라이드 상단에 놓인 양면 접착 테이프의 얇은 스트립에 계란을 정렬하고 각 계란의 앞쪽이 같은 방향을 가리키도록 노력합니다. 할로카본 시약을 물과 부드럽게 혼합하고 혼합물을 섭씨 25도에서 밤새 배양하여 할로겐 탄소 혼합물을 준비합니다. 정렬된 계란을 할로카본 오일 혼합물로 덮습니다.미세 주입용 바늘을 생성하려면 제조업체의 지침에 따라 알루미노실리케이트 모세관 유리를 바늘 풀러에 넣습니다. 열을 560으로, 속도를 100으로, 지연을 70으로, 당기기를 97로, 압력을 500으로 설정합니다. 그런 다음 니들 풀러를 활성화하십시오.당긴 바늘 끝을 회전하는 다이아몬드 연마판에 약 10초 동안 50도 각도로 부드럽게 터치하여 바늘 끝을 비스듬히 만듭니다. 당기고 비스듬한 바늘을 페트리 접시에 있는 모델러의 점토 선에 삽입합니다. 게놈 변형 시약으로 구성된 주입 혼합물을 준비하고 얼음에 보관하십시오.마이크로로더 팁을 사용하여 2마이크로리터의 주입 혼합물을 주입 바늘에 로드합니다. 채워진 주사바늘을 전자 마이크로인젝터에 연결된 마이크로매니퓰레이터에 넣고 정렬된 계란이 있는 유리 슬라이드를 복합 현미경의 스테이지에 놓습니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 25-35도 각도로 배아의 뒤쪽 끝을 조준하도록 정렬합니다.바늘을 배아에 조심스럽게 삽입하고 배아 부피의 약 10%의 양으로 혼합물을 주입합니다. 한 번에 20개의 난자를 주입한 다음 배아 회수 절차를 중단하고 수행합니다. 주입 후 20분 이내에 깨끗한 붓으로 가볍게 솔질하여 계란의 할로겐화 오일을 조심스럽게 제거합니다.붓으로 계란을 들어 올려 이중 증류수 한 컵에 넣고 계란이 표면에 닿지 않도록 주의하십시오. 앞으로 7일 동안 매일 알이 부화하는지 확인하고 정상적인 유충 사육 절차를 따르십시오. 입체경을 사용하여 주입된 모기에서 돌연변이 표현형을 스크리닝합니다.이 방법은 짙은 눈 색소 침착의 발달에 중요한 유전자의 체세포 및 생식계열 돌연변이를 성공적으로 생성하는 데 사용되었습니다. CRISPR-Cas9 생성 체세포 돌연변이는 주사를 맞은 개인의 동공 단계 눈에서 색소 침착 소실을 스크리닝하여 점수를 매겼습니다. 체세포 돌연변이는 일반적으로 모자이크 표현형으로 존재했으며, 전부는 아니지만 일부 세포가 돌연변이 표현형을 가지고 있습니다.생식계열 돌연변이 비율은 모자이크 G 제로 개체를 교배하고 완전히 흰 눈을 가진 자손당 점수를 매겨 결정되었습니다. 이러한 실험은 배아 생존율 64-82%, 체세포 돌연변이 유발 비율 37-57%, 생식세포 돌연변이 유발 비율 61% 이상을 나타냈다. 동일한 유전자의 여러 유전자 자리를 표적으로 하기 위해 sgRNA를 multiplexing함으로써 체세포 및 생식세포 돌연변이 유발 비율이 최대 86%까지 증가했습니다.또한, 여러 세대 동안 백색 돌연변이의 생존 가능한 동형접합 스톡이 실험실에 성공적으로 보관되었습니다.생존율과 돌연변이 유발 속도를 최적화하려면 미세주입을 시도하기 전에 할로카본 오일, 주사액 및 바늘을 포함한 모든 재료를 적절하게 준비해야 합니다. 이를 통해 보다 간소화되고 집중적인 미세주입 공정이 가능합니다.

embryo-microinjection-techniques-for-efficient-site-specific

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오에서는 Nijole Jasinskiene는 뎅그열 발열에 대한 벡터 아르 유전자 변형 Aedes aegypti 모기를 생성하기 위해 사용된 방법을 보여줍니다. 정확하게, microinjection의 바늘을 준비하는 배아를 d​​essicating, 그리고 microinjection을 수행하기위한 기술은 증명됩니다.

트렌스 제닉 모기를 구하는 A. aegypti의 태아의 Microinjection

이 비디오에서는 마이크로주입을 통해 Anopheles 배아에서 phiC31 매개 부위 특이적 전이유전자 통합을 시연합니다. 이 방법은 연구 및 산업 응용을 위해 원하는 유전자를 숙주 시스템에 도입하는 데 도움이 됩니다.

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지중해초파리(medfly) Ceratitis capitata(Diptera: Tephritidae)는 전 세계 농업 해충입니다. 이 식물의 생물학에 대한 깊은 이해는 메드플라이 개체군을 통제하여 경제적 영향을 줄이는 데 중요합니다. 배아 미세주입(embryo microinjection)은 이 종에서 생식세포 형질전환(germ-line transformation)과 역유전학(reverse genetics) 연구를 모두 가능하게 하는 근본적인 도구입니다.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

Microinjection Nasonia vitripennis 배아의 생성 상속 게놈 수정 하기 위한 필수적인 방법입니다. 여기에 설명 된 microinjection 그리고이 유기 체에서 미래 게놈 조작에 크게 용이 하 게 한다 Nasonia vitripennis 배아의 이식에 대 한 자세한 절차가입니다.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

CRISPR/Cas9는 비모델 유기체에서 유전자 기능을 특성화하는 데 점점 더 사용됩니다. 이 프로토콜은 주입 믹스 준비에서 모기 배아를 획득하고 주입하는 것뿐만 아니라 주입 된 모기와 원하는 돌연변이에 대한 자손을 후면, 교차 및 선별하는 방법에 이르기까지 Culex pipiens의녹아웃 라인을 생성하는 방법을 설명합니다.

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이 프로토콜은 태아 수집, 주사, 곤충 사육 및 식별뿐만 아니라 관심있는 돌연변이의 선택 : 모래 파리에 CRISPR / Cas9 표적 돌연변이 발생의 단계를 자세히 설명합니다.

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곤충 우사회성의 많은 특성은 식민지 내 의사 소통과 노동 분업에 의존합니다. 미세 주입 및 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 통한 개미 배아의 주요 조절 유전자의 유전자 조작은 진사회적 곤충의 이타적 행동의 본질에 대한 통찰력을 제공합니다.

개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

미세 주입 기술은 모기의 게놈에 외인성 유전자를 소개하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 제임스 실험실에서 DNA 구조를 Anopheles 감비아아에 미세 주입하여 변형된 모기를 생성하는 방법을 설명합니다.

아노펠레 감비아에 배아를 위한 미세 주입 방법

이 논문은 초파리의 phiC31 인테그라제 매개 형질전환효소를 예로 들어 형질전환파리를 생성하기 위한 중요한 단계인 배아 미세주입에 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

초파리의 형질전환을 위한 배아 미세주입

배우세요 Culex quinquefasciatus 배아 미세 주입 기술로 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 수행하는 방법을. 이 프로토콜은 64-82%의 배아 생존률과 61% 이상의 생식계 돌연변이율을 달성하여 유전적 벡터 제어 연구에 활용됩니다.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

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