컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

배아 미세주입 기술은 수많은 유전자 기반 벡터 제어 도구의 개발을 위한 길을 열었습니다. 수많은 곤충 종들이 이미 잘 발달된 프로토콜을 가지고 있지만, Culex quinquefasciatus는 상대적으로 연구가 부족한 상태로 남아 있습니다. 이 미세주입 프로토콜은 난자 채취, 난자 뗏목 분리 및 주입 후 절차를 포함하여 Culex quinquefasciatus의 고유한 생물학적 특성을 수용하도록 특별히 설계되었습니다.

이 방법은 관심 있는 모든 Culex 종에 적용할 수 있으며 유전자 기능을 연구하거나 Culex 종에 대한 유전자 기반 제어 기술을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 뗏목에서 알을 분리하는 것으로 시작하십시오. 집게나 붓을 사용하여 뗏목을 누르고 개별 알을 떼어냅니다.

유리 슬라이드 상단에 놓인 양면 접착 테이프의 얇은 스트립에 계란을 정렬하고 각 계란의 앞쪽이 같은 방향을 가리키도록 노력합니다. 할로카본 시약을 물과 부드럽게 혼합하고 혼합물을 섭씨 25도에서 밤새 배양하여 할로겐 탄소 혼합물을 준비합니다. 정렬된 계란을 할로카본 오일 혼합물로 덮습니다.

미세 주입용 바늘을 생성하려면 제조업체의 지침에 따라 알루미노실리케이트 모세관 유리를 바늘 풀러에 넣습니다. 열을 560으로, 속도를 100으로, 지연을 70으로, 당기기를 97로, 압력을 500으로 설정합니다. 그런 다음 니들 풀러를 활성화하십시오.

당긴 바늘 끝을 회전하는 다이아몬드 연마판에 약 10초 동안 50도 각도로 부드럽게 터치하여 바늘 끝을 비스듬히 만듭니다. 당기고 비스듬한 바늘을 페트리 접시에 있는 모델러의 점토 선에 삽입합니다. 게놈 변형 시약으로 구성된 주입 혼합물을 준비하고 얼음에 보관하십시오.

마이크로로더 팁을 사용하여 2마이크로리터의 주입 혼합물을 주입 바늘에 로드합니다. 채워진 주사바늘을 전자 마이크로인젝터에 연결된 마이크로매니퓰레이터에 넣고 정렬된 계란이 있는 유리 슬라이드를 복합 현미경의 스테이지에 놓습니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 25-35도 각도로 배아의 뒤쪽 끝을 조준하도록 정렬합니다.

바늘을 배아에 조심스럽게 삽입하고 배아 부피의 약 10%의 양으로 혼합물을 주입합니다. 한 번에 20개의 난자를 주입한 다음 배아 회수 절차를 중단하고 수행합니다. 주입 후 20분 이내에 깨끗한 붓으로 가볍게 솔질하여 계란의 할로겐화 오일을 조심스럽게 제거합니다.

붓으로 계란을 들어 올려 이중 증류수 한 컵에 넣고 계란이 표면에 닿지 않도록 주의하십시오. 앞으로 7일 동안 매일 알이 부화하는지 확인하고 정상적인 유충 사육 절차를 따르십시오. 입체경을 사용하여 주입된 모기에서 돌연변이 표현형을 스크리닝합니다.

이 방법은 짙은 눈 색소 침착의 발달에 중요한 유전자의 체세포 및 생식계열 돌연변이를 성공적으로 생성하는 데 사용되었습니다. CRISPR-Cas9 생성 체세포 돌연변이는 주사를 맞은 개인의 동공 단계 눈에서 색소 침착 소실을 스크리닝하여 점수를 매겼습니다. 체세포 돌연변이는 일반적으로 모자이크 표현형으로 존재했으며, 전부는 아니지만 일부 세포가 돌연변이 표현형을 가지고 있습니다.

생식계열 돌연변이 비율은 모자이크 G 제로 개체를 교배하고 완전히 흰 눈을 가진 자손당 점수를 매겨 결정되었습니다. 이러한 실험은 배아 생존율 64-82%, 체세포 돌연변이 유발 비율 37-57%, 생식세포 돌연변이 유발 비율 61% 이상을 나타냈다. 동일한 유전자의 여러 유전자 자리를 표적으로 하기 위해 sgRNA를 multiplexing함으로써 체세포 및 생식세포 돌연변이 유발 비율이 최대 86%까지 증가했습니다.또한, 여러 세대 동안 백색 돌연변이의 생존 가능한 동형접합 스톡이 실험실에 성공적으로 보관되었습니다.

생존율과 돌연변이 유발 속도를 최적화하려면 미세주입을 시도하기 전에 할로카본 오일, 주사액 및 바늘을 포함한 모든 재료를 적절하게 준비해야 합니다. 이를 통해 보다 간소화되고 집중적인 미세주입 공정이 가능합니다.