PCR 후 DNA 앰플리콘의 아가로스 겔 전기영동: 멀티플렉스 PCR의 산물을 분석하고 PCR 반응 성공을 평가하는 방법

다중 중합효소 연쇄 반응으로 인해 생성된 DNA 앰플리콘(특정 길이의 증폭된 DNA 단편)을 분석하기 위해 PCR은 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 빗이 있는 주조 트레이를 조립하여 샘플 로딩을 위한 웰을 만듭니다.

형광 DNA 염료가 보충된 전기영동 완충액에 용해된 용융 아가로스인 적절한 농도의 용융 아가로스를 주조 트레이에 붓고 응고시킵니다.

용융된 아가로스는 중합되어 미세한 기공을 가진 3차원 겔을 형성합니다.

주조된 젤을 전기영동 탱크에 넣고 빗면이 음극 근처를 향하도록 합니다. 탱크에는 최적의 전도도를 유지하기 위해 겔 준비에 사용되는 전기영동 완충액이 포함되어 있습니다. 빗을 제거합니다.

샘플 이동을 모니터링하기 위해 로딩 염료 용액과 혼합된 PCR 산물 샘플을 웰로 옮깁니다. 정의된 길이의 DNA 사다리로 웰 하나를 로드합니다. 전기영동을 시작합니다.

균일한 간격의 음의 인산염 그룹을 가진 DNA 앰플리콘은 웰에서 겔로 양극을 향해 이동하고 더 큰 앰플리콘보다 짧은 앰플리콘의 높은 이동성으로 인해 길이에 따라 분리됩니다. 동시에, 겔의 양성 형광 DNA 염료는 반대 방향으로 이동하고 DNA 앰플리콘과 결합하여 염기 사이에 삽입됩니다.

전기영동 후 자외선을 사용하여 겔을 이미지화합니다. 성공적인 PCR을 위해 염료 삽입된 DNA 앰플리콘은 예상 앰플리콘 길이의 사다리에 가장 가까운 이산적인 형광 밴드로 나타납니다. 앰플리콘 수율은 형광 강도를 통해 추정할 수 있습니다.

제조업체의 권장 사항에 따라 1x TBE 완충액에 아가로스 겔 분말을 첨가하여 1.5(중량/부피) 퍼센트에 도달하고 가열하여 용해시킵니다.

주조하기 전에 용해된 젤 용액을 흐르는 물에 잠시 기울이십시오. 겔 용액 50마이크로리터당 형광 핵산 염료 50마이크로리터를 첨가하고 혼합합니다.

주조 트레이를 조립하고 수평을 맞춥니다. 샘플 수에 따라 빗을 추가합니다. 젤 용액을 캐스트에 붓고 굳을 때까지 기다립니다.

그 후, 겔이 포함된 캐스트를 겔 전기영동 시스템의 1x TBE 완충액에 담그십시오. 5마이크로리터의 PCR 산물과 2마이크로리터의 로딩 염료를 새 PCR 스트립에 혼합합니다. 5마이크로리터의 혼합물을 젤의 우물로 옮깁니다. 적어도 하나의 우물을 비워 두십시오. 참조를 위해 빈 우물에 5마이크로리터의 DNA 사다리를 추가합니다.

전극을 연결하고 젤을 110cm당 15볼트로 약 1시간 동안 실행합니다. UV 기반 겔 이미징 시스템을 사용하여 PCR 앰플리콘을 나타내는 여러 밴드의 존재를 확인합니다.