Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

안녕하세요, 저는 Agriculture and AgriFood Canada의 Tim Duso입니다. 이 비디오에서는 bio plex 기기를 사용하여 복잡한 임상 또는 환경 샘플에서 특정 미생물의 존재와 풍부도를 결정하기 위한 프로토콜을 시연합니다. 이 프로토콜은 종 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브에 화학적으로 결합된 형광 폴리스티렌 비드를 사용합니다.

범용 PCR 프라이머를 사용하여 샘플에서 앰플리콘을 생성하고 앰플리콘은 프로브 결합 비드에 하이브리드화됩니다. bio plex 기기에서는 두 가지 신호가 생성됩니다. 하나는 비드를 식별하고 다른 하나는 혼성화 신호를 정량화합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 빠르고 반(半)정량적인 방식으로 관심 미생물총(microbiota)의 프로파일을 결정하는 것입니다. 당사는 이 기술을 적용하여 질 면봉의 박테리아 프로파일을 확인하고 생성된 데이터를 사용하여 유산균 유기체의 분포가 줄어들고 Gardnerella, vais 및 apoian vae와 같은 다른 유기체가 질 면봉에서 검출되는 미생물총의 변화를 특징으로 하는 임상 상태인 세균성 질염을 진단합니다. 그러나 이 기술은 신속한 다중 분석이 바람직한 다른 미생물군에 적용될 수 있다는 점을 명심하는 것이 중요합니다.

절차의 작동 방식을 설명하는 것으로 시작하겠습니다. 미생물 프로파일은 단백질을 증폭하고 면봉의 DNA 추출물에 존재하는 모든 유기체에서 60의 유전자 샤페론을 코팅하여 생성됩니다. 보편적인 증폭 뇌관의 한개는 비오틴의 추가, 뿐 아니라 phospho 먹은 변경한 염기의 포함에 의해 변경됩니다.

5 프라임 말단에서 앰플리콘은 안티센스 가닥만 분해하는 T 7 엑손 뉴클레아제를 사용하여 단일 가닥으로 만들어집니다. 감 물가가 phospho ate 변경한 PCR 뇌관에 의해 보호되기 때문에, 잔여 물가에 상보적인 oligonucleotide probe는 형광 폴리스티렌 구슬에 공유 결합됩니다. 서로 다른 유기체를 검출하는 프로브가 포함된 각각의 고유한 비드 색상으로 단일 샘플에 최대 100개의 서로 다른 비드를 사용할 수 있습니다.

질 면봉에서 추출한 단일 가닥 PCR 산물은 모든 관심 유기체에 대한 프로브를 포함하는 프로브 결합 비드 혼합물에 혼성화됩니다. 연쇄상구균 딘 접합체를 통해 비오틴화된 프로브에 결합하는 형광 리포터 FICO ethin이 첨가됩니다. 마지막으로, 혼성화 혼합물은 루미넥스(luminex) 또는 바이오 플렉스(bio plex) 기기에서 분석되며, 이는 각 비드의 동일성 및 혼성화 신호를 개별적으로 검사합니다.

이 분석의 결과는 특정 미생물의 존재를 나타내며 혼성화 신호의 강도는 해당 유기체의 풍부함과 관련이 있습니다. 샘플에서 BV 관련 유기체의 존재는 bv를 진단하는 데 사용할 수 있습니다. 그랜드 스테인(Grand Stain)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 특정 미생물의 존재와 그 풍부함에 대한 정보가 생성된다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 연구 조교인 Jennifer Town이 Re를 약 20초 동안 소용돌이로 매달아 미세구를 매달아 놓는 것입니다. 400 마이크로 스피어의 마이크로 스피어를 1 분 동안 14, 000 번 G로 einor 튜브 원심 분리기로 옮기고 snat Resus를 제거하고 폐기합니다. 50마이크로리터의 0.1몰 MES pH 4.5에 마이크로스피어를 현탁합니다.

미세구에 capture oligo의 animo 하나를 추가하고 vortexing으로 혼합합니다. 2.5마이크로리터의 새로운 EDC 용액을 마이크로스피어에 추가합니다. 어두운 곳에서 30분 동안 실온에서 반응을 배양합니다.

앞서 준비한 EDC 용액을 버리고 물에 EDC 10밀리리터당 10mg의 새로운 샘플을 준비합니다. 위와 같이 2.5마이크로리터의 새로운 EDC 용액을 마이크로스피어에 추가로 추가하고 5초 동안 와류에 넣습니다. 어두운 곳에서 30분 동안 실온에서 다시 배양합니다.

14, 000 시간 G.For에 구슬 분리기를 resuspend하기 위하여 0.02%Tween 20 와동의 1개의 밀리리터를 추가해서 구슬을 세척하고, 상등액을 제거하고 폐기하십시오. 1ml의 0.1%SDS Resus를 첨가하여 비드를 다시 세척합니다. 100마이크로리터의 te buffer에 비드를 매달아 놓습니다.

혈구 세포분석기(hemo cytometer)에서 비드를 열거하여 스톡 농도를 결정합니다. 각 비드를 마이크로리터당 100개의 비드의 최종 농도로 희석하여 마이크로스피어 마스터 믹스를 준비하고, 분석의 원하는 플렉스에 따라 커플링된 비드를 풀링하고, 마이크로스피어 마스터 믹스를 어두운 곳에서 4도에 보관합니다. 이 혼합물은 이러한 조건 하에서 보관하는 경우 몇 달 동안 저장할 수 있으며 각 샘플에 대한 PCR 제품을 생성할 수 있습니다.

PCR이 완료된 직후 phospholate 및 biotin modified five prime prime set 세트를 포함합니다. 각 PCR 튜브에 2마이크로리터의 T 7 엑소뉴클레아제를 첨가하여 실온에서 40분 동안 배양합니다. 이 배양이 끝나면 12.5 마이크로 리터의 0.5 몰 E-D-T-A-P-H 8.0을 혼합하여 첨가합니다.

이것은 총 약 64.5 마이크로 리터의 단일 가닥 PCR 산물을 제공합니다. Resus Bend 마이크로스피어 마스터 믹스와 피펫. einor 튜브에 적당량을 분주합니다.

튜브에 뚜껑을 닫고 수조 소닉카에서 2분 동안 초음파 처리합니다. 17마이크로리터의 단일 가닥 PCR 산물을 로우 프로파일 96의 적절한 웰에 분배합니다. 웰 플레이트는 각각에 33 마이크로 리터의 Resuspended Sonicated bead mixture를 추가합니다.

실리콘 덮개와 탭으로 접시를 잘 덮으십시오. 5 분 동안 95 도, 10 분 동안 60 도, 60 도 파악 또는 5 분 동안 60 도의 프로그램을 가진 thermocycler로 판을 온화하게 끼워넣으십시오. 끝내고 프로그램을 시작하십시오.

신선한 연쇄상구균 Aden FICO Ethin 용액을 만드십시오. 웰당 25마이크로리터가 필요합니다. 연쇄상구균과 FICO 에틴을 줄기를 밀리리터당 1밀리그램으로 희석하여 만듭니다.

밀리리터당 50-20마이크로그램 중 1개, tmac 버퍼 1배. Thermocycler가 60도 파악 단계에 도달하면, 뚜껑을 열고, 실리콘 덮개를 제거하고 각각에 연쇄상 구균 din FICO ethin 해결책을 직접 추가하십시오. 실리콘 덮개를 교체하고 열순환기 뚜껑을 닫고 프로그램을 재개하십시오.

프로그램이 완료되면 플레이트를 꺼내 바이오 플렉스 기계로 빠르게 옮겨 읽습니다. 플레이트는 10분 이내에 읽어야 합니다. 60도에서 플레이트를 읽습니다.

바이오 플렉스가 이 온도로 예열되었는지 확인하십시오. 이것은 시간 0에서 단일 개인의 세로 샘플의 해당 그램 염색 및 루미넥스 프로파일의 결과를 보여줍니다. 그람 염색은 bv의 임상 진단과 일치하며, 이는 Gardner Relic, vais 및 Apoian Vae를 포함한 BV 관련 유기체에 대한 양성 혼성화 신호를 보여주는 Fiveplex Luminex 분석에 의해 확증됩니다.

락토바실러스 이너스(Lactobacillus Iners)도 시간이 지남에 따라 낮은 수준으로 검출됩니다. 이 개체는 그램 염색에서 볼 수 있듯이 BV 미생물총(microbiota)에서 정상 미생물총(microbiota)으로 전환됩니다. 이 동일한 샘플에 대한 Luminex 분석은 Gardnerella Vaginalis 풍부도가 최고조에 달했다가 감소하는 반면 락토바실러스 iners는 증가하여 최종 시점까지 지배적인 유기체가 되는 것을 보여줍니다.

이 방법을 프로파일링하여 미생물총(microbiota)을 사용하면 특정 유기체의 존재 여부와 그 풍부도에 대한 정보가 생성됩니다. 이 방법은 염기서열 기반이기 때문에 심층 염기서열분석 분석을 통해 프로브 설계를 수행할 수 있으며, 차세대 염기서열분석 분석법으로 식별된 미생물을 상대적으로 저렴한 방식으로 샘플에서 추적할 수 있습니다. 이 동영상을 시청하면 Luminex 또는 Bio Plex 기기를 사용하여 샘플에서 미생물 프로파일을 생성하는 방법을 잘 이해할 수 있었을 것입니다.

올리고뉴클레오티드 프로브를 형광 비드에 연결하고, 임상 또는 환경 샘플에서 단일 가닥 알리콘을 생성하고, 하이브리드화를 수행하고, Luminex 또는 Bio Plex 기기에서 결과를 결정하는 방법을 보여드렸습니다. 실험에 행운을 빕니다.