Scanning Electron Microscopy를 사용한 멤브레인 러플 형성의 정량화

외부 자극기는 세포를 활성화하고 다양한 세포 활동에 필수적인 3차원 원형 막 돌출 또는 막 주름 형성을 유도합니다.

멤브레인 러플 형성을 시각화하려면 바닥에 커버슬립이 포함된 멀티웰 플레이트로 시작하십시오. 커버슬립의 상단에는 배양된 대식세포가 있습니다.

이러한 대식세포를 세포를 활성화하는 자극제 분자로 처리하여 세포골격 재구성 및 막 돌출 형성을 촉진합니다. 세포에 고정액을 겹쳐서 단백질을 가교하고 세포 구조를 보존합니다.

완전한 탈수를 위해 알코올 농도를 증가시켜 고정된 대식세포를 치료합니다. 임계점 건조기를 사용하여 이러한 대식세포를 건조시켜 더 나은 이미징을 위해 물의 흔적을 제거합니다.

전도성 테이프를 사용하여 커버슬립을 주사 전자 현미경(SEM) 시편 홀더에 장착합니다. 스퍼터는 대식세포 함유 커버슬립을 얇은 금속 층으로 코팅하여 이미징 중 우수한 전자 전도성을 보장합니다.

커버슬립을 SEM 챔버에 놓습니다. 전자빔을 커버슬립에 집중시킵니다. 전자빔은 금속으로 코팅된 대식세포의 막에 부딪혀 막 표면에서 저에너지 2차 전자 생성을 일으킵니다.

3차원 돌출부는 막의 나머지 부분과 다르게 전자를 산란시켜 세포 표면의 이러한 특징을 강조합니다. 검출기는 다양한 세포 표면 영역에서 산란 된 전자를 수집하여 대비 이미지를 생성합니다.

SEM 이미지에서 대식세포는 표면에 밝은 원형 돌출부와 함께 더 어둡게 나타나 주름 장식 형성을 확인합니다.

고압멸균 겸자를 사용하여 멸균 유리 커버슬립을 24웰 플레이트의 웰에 배치하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 RAW 264.7 대식세포를 밀리리터당 10⁶ 세포의 밀도로 커버슬립에 시드하고 플레이트를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%의 가습 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.

다음날, 각 웰의 배지를 500마이크로리터의 신선한 완전 배지로 교체한 다음 DMSO와 같은 비히클 대조군 또는 EIPA와 같은 대피식세포 억제제로 대식세포를 30분 동안 전처리합니다. 다음으로, 막 주름을 촉진하기 위해 1마이크로몰 PMA 용액 또는 밀리리터당 100나노그램의 대식세포 콜로니 자극 인자와 같은 대식균 자극제로 세포를 30분 동안 처리합니다.

주사 전자 현미경을 위해 셀을 고정하려면 웰에서 배지를 흡인하고 얼음처럼 차가운 PBS로 커버슬립을 두 번 세척합니다. 그런 다음 커버슬립을 고정액에 실온에서 30분 동안 배양한 다음 섭씨 4도에서 하룻밤 배양합니다.

다음날, 세포 단층을 방해하지 않고