Scanning Electron Microscopy를 사용한 멤브레인 러플 형성의 정량화

외부 자극기는 세포를 활성화하고 다양한 세포 활동에 필수적인 3차원 원형 막 돌출 또는 막 주름 형성을 유도합니다.

멤브레인 러플 형성을 시각화하려면 바닥에 커버슬립이 포함된 멀티웰 플레이트로 시작하십시오. 커버슬립의 상단에는 배양된 대식세포가 있습니다.

이러한 대식세포를 세포를 활성화하는 자극제 분자로 처리하여 세포골격 재구성 및 막 돌출 형성을 촉진합니다. 세포에 고정액을 겹쳐서 단백질을 가교하고 세포 구조를 보존합니다.

완전한 탈수를 위해 알코올 농도를 증가시켜 고정된 대식세포를 치료합니다. 임계점 건조기를 사용하여 이러한 대식세포를 건조시켜 더 나은 이미징을 위해 물의 흔적을 제거합니다.

전도성 테이프를 사용하여 커버슬립을 주사 전자 현미경(SEM) 시편 홀더에 장착합니다. 스퍼터는 대식세포 함유 커버슬립을 얇은 금속 층으로 코팅하여 이미징 중 우수한 전자 전도성을 보장합니다.

커버슬립을 SEM 챔버에 놓습니다. 전자빔을 커버슬립에 집중시킵니다. 전자빔은 금속으로 코팅된 대식세포의 막에 부딪혀 막 표면에서 저에너지 2차 전자 생성을 일으킵니다.

3차원 돌출부는 막의 나머지 부분과 다르게 전자를 산란시켜 세포 표면의 이러한 특징을 강조합니다. 검출기는 다양한 세포 표면 영역에서 산란 된 전자를 수집하여 대비 이미지를 생성합니다.

SEM 이미지에서 대식세포는 표면에 밝은 원형 돌출부와 함께 더 어둡게 나타나 주름 장식 형성을 확인합니다.

고압멸균 겸자를 사용하여 멸균 유리 커버슬립을 24웰 플레이트의 웰에 배치하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 RAW 264.7 대식세포를 밀리리터당 10⁶ 세포의 밀도로 커버슬립에 시드하고 플레이트를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%의 가습 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.

다음날, 각 웰의 배지를 500마이크로리터의 신선한 완전 배지로 교체한 다음 DMSO와 같은 비히클 대조군 또는 EIPA와 같은 대피식세포 억제제로 대식세포를 30분 동안 전처리합니다. 다음으로, 막 주름을 촉진하기 위해 1마이크로몰 PMA 용액 또는 밀리리터당 100나노그램의 대식세포 콜로니 자극 인자와 같은 대식균 자극제로 세포를 30분 동안 처리합니다.

주사 전자 현미경을 위해 셀을 고정하려면 웰에서 배지를 흡인하고 얼음처럼 차가운 PBS로 커버슬립을 두 번 세척합니다. 그런 다음 커버슬립을 고정액에 실온에서 30분 동안 배양한 다음 섭씨 4도에서 하룻밤 배양합니다.

다음날, 세포 단층을 방해하지 않고 부드럽게 세척한 다음 커버슬립을 500마이크로리터의 0.1몰 카코딜레이트나트륨에 15분 동안 배양합니다. 500마이크로리터의 증류수로 2회 세척한 후, 매번 세척할 때마다 10분 동안 배양하면서 등급이 매겨진 에탄올 시리즈의 500마이크로리터로 커버슬립을 두 번 세척합니다.

임계점 건조를 수행하려면 커버슬립을 임계점 건조기에 넣고 100% 에탄올로 덮은 다음 전원 버튼을 누르고 이산화탄소 탱크를 엽니다. 온도가 섭씨 30도로 떨어질 때까지 냉각 버튼을 약 0초 동안 누릅니다. 그런 다음 챔버 창에 거품이 나타날 때까지 채우기 버튼을 누릅니다.

그런 다음 퍼지 배기 가스에서 에탄올 냄새가 사라질 때까지 퍼지 버튼을 누릅니다. 그런 다음 온도가 섭씨 0도로 떨어질 때까지 냉각 버튼을 다시 누릅니다. 채우기 및 제거 버튼을 다시 눌러 끕니다. 그런 다음 이산화탄소 탱크를 닫습니다. Cool 버튼을 다시 눌러 끈 다음 Heat 버튼을 누릅니다. 온도를 섭씨 42도로, 압력을 평방인치당 1,200파운드로 설정합니다.

압력과 온도가 안정되면 블리드 버튼을 눌러 압력이 천천히 감소하도록 합니다. 챔버 압력이 평방 인치당 150파운드에 도달하면 환기 버튼을 누르고 압력이 평방 인치당 0파운드로 감소할 때까지 기다립니다. 임계점 건조기를 끄고 커버슬립을 제거합니다.

다음으로, 탄소 접착제 탭을 사용하여 주사 전자 현미경을 위해 알루미늄 시편 마운트에 커버슬립을 장착합니다. 그런 다음 스퍼터 코터에서 금 또는 팔라듐을 사용하여 스퍼터 코팅을 진행합니다.

스퍼터 코터의 전원 버튼을 켭니다. 진공이 30밀리토르에 도달하면 가스 스위치를 끄고 미세 가스 밸브를 시계 반대 방향으로 돌려 챔버를 세척하여 습기와 공기를 제거합니다. 진공이 200밀리토르로 증가하면 가스 스위치를 끄고 진공이 30밀리토르에 도달할 때까지 기다린 다음 시연된 대로 챔버를 다시 세척하여 습기와 공기를 제거합니다. 챔버를 세 번 세척한 후 타이머 버튼을 누르고 볼륨을 조정합니다.tage 게이지가 10밀리암페어가 나타날 때까지 손잡이. 그런 다음 챔버에서 코팅된 커버슬립을 제거합니다.

멤브레인 주름 장식을 시각화하고 정량화하려면 샘플 커버슬립을 주사 전자 현미경의 챔버에 삽입합니다. 문을 닫고 Evac 버튼을 누릅니다. 현미경 작동 소프트웨어를 열고 가속 전압을 15킬로볼트, 작동 거리를 10밀리미터로 설정합니다. 좌표 버튼을 누르고 셀이 관측 화면 중앙에 나타날 때까지 컨트롤러 주위를 이동합니다. 배율을 3500x로 설정하고 사진 버튼을 클릭하여 샘플을 이미지