Name: 돌출 힘 현미경 검사 법: 셀 돌출에 의해 개발 된 세력을 계량 하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 배우세요 대식세포의 포도소좀 돌출 힘을 원자력 현미경으로 정량화하는 방법을. 필름 변형 측정과 역학 모델을 통해 세포 부착 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 그들의 초기 기여가이 작품에 Matthieu 산체스와 프랑수 아즈 Viala에 대 한 그들의 비디오 촬영 및 편집에 대 한 애 나 Labernadie, 기욤 Charrière와 패트릭 Delobelle에 감사. 이 작품은 않았나 국립 드 라 Recherche (ANR14-CE11-0020-02), 부 어 라 라 Fondation 검색 Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM 계획 암, Fondation 툴루즈 암, 인간 프론티어 과학 프로그램 (RGP0035/2016)에 의해 지원 되었습니다.

1입니다. 격자 Formvar 코팅의 준비
<ol><li>순수한 아세톤과 전자 현미경 격자를 청소 하 고 필터 종이에 그들을 건조. 다음 깨끗 한 순수 에탄올, 현미경 슬라이드 렌즈 종이로 닦 고는 송풍기와 먼지를 제거.</li>
	<li>하단 부분에 Formvar의 솔루션을 포함 하는 영화 캐스팅 장치의 퍼 널에 에탄올 청소 유리 슬라이드를 수직으로 놓습니다. 깔때기의 정상을 커버.</li>
	<li>수준 슬라이드의 2/3에 도달할 때까지 분무기 전구와 Formvar 솔루션 (에틸렌 dichloride에 0.5%)의 100 mL를 펌프.</li>
	<li>1 분 동안 솔루션에 슬라이드를 유지.</li>
	<li>꾸준한에 Formvar 솔루션 드레인 장치 밸브를 엽니다. 15 mL/s 10의 유량 30-80 nm의 Formvar 영화를 얻을 것입니다. 영화의 두께 Formvar 용액의 농도 배수 장치 비율에 의해 결정 됩니다. 참고: 배수 속도는 압력 을 통해 공기를 밖으로 밸브 밸브를 천천히 열어 배기에 의해 제어할 수 있습니다. 빨리 배수, 두꺼운 영화. 실제로, Formvar 유량에서 필름 두께 예측 하기 어렵기 때문에 우리 Formvar 영화의 여러 배치를 준비 하 고 AFM에 의해 그들의 두께 제어 (단계 2 참조).</li>
	<li>상공에서 슬라이드를 제거 하 고 섬세 하 게 어떤 액체 Formvar 제거 하려면 필터 종이에 그것을 건조.</li>
	<li>면도날으로 Formvar 영화에서 20 m m x 50 m m 사각형으로 잘라.</li>
	<li>깨끗 한 증류수로 비 커를 천천히 빠지게 슬라이드 수직으로 영화에서 부동 물: 영화 물 표면에 플 로트 해야 합니다.</li>
	<li>영화, 빛나는 장소 건조 아세톤 청소 격자 얼굴.</li>
	<li>라운드 유리 coverslip (Ø 12 mm) 격자의 몇 가지에 배치 합니다. 이 coverslip 필름 두께 측정 될 것입니다 (2 단계 참조).</li>
	<li>그것에 맞게 크기 조정 흰색 스티커와 현미경 슬라이드를 커버. 전체 영화 슬라이드에 준수 될 때까지 부동 Formvar 영화의 테두리에서 수직으로 슬라이드를 찍어. 필터 종이 슬라이드에서 과잉의 물을 제거 하 고 실 온에서 하룻밤 말리.</li>
</ol>2입니다. 두께의 측정
<ol><li>주위는 coverslip Formvar 슬라이드에서 그것을 분리 하는 핀셋으로 잘라.</li>
	<li>펜으로는 coverslip 아래의 표에서의 위치를 표시 합니다.</li>
	<li>coverslip에서 그것을 분리 하는 표시 된 그리드 주위 Formvar 잘라. 있을 것입니다 따라서 구멍 나머지 Formvar 시트, 필름 두께 측정할 수 있게 됩니다. PBS 가진 coverslip 커버 하 고 현미경, 유리 슬라이드에 배치.</li>
	<li>AFM 유리 블록, 골든 스트라이프 봄의 끝에 의해 포함 되지 않는 다는 것을 확인에 실리콘 나이트 라 이드 캔틸레버를 탑재 합니다. 참고: 감도 캔틸레버의 스프링 상수 한다은 이전 조정 되었습니다 PBS에.</li>
	<li>AFM 모듈에 유리 블록을 탑재 하 고 모듈 현미경에 놓습니다.</li>
	<li>관측 실에 Formvar 코팅 coverslip 놓고 PBS의 500 µ L로 그것을 커버 합니다.</li>
	<li>접촉 모드와 0.5 nN 힘 세트 포인트에서 AFM을 사용 하 여 Formvar 시트에 구멍의 테두리를 검색 합니다.</li>
	<li>높이 측정, 유리 coverslip 표면 참조로 사용 하 고 횡단면의 높이 Formvar 두께 평가 (Formvar 배치 당 적어도 10 측정을 수행).</li>
</ol>3. 시드 셀 격자에
<ol><li>살 균 후드는 coverslip에 양면 접착 테이프의 스트립 (12 m m x 3 m m)을 넣어.</li>
	<li>핀셋으로 Formvar 코팅 그리드 밖으로 잘라내어 (격자의 가장자리에만 테이프에 붙어 있이 필요가) 접착 스트립에 거꾸로 넣어. Formvar 영화는 coverslip 얼굴을 해야 합니다.</li>
	<li>문화에이 장치를 잘 넣어.</li>
	<li>장소 104 대 식 세포를 포함 하는 FCS 없이 RPMI의 10 µ L 드롭릿 인간 monocytes16에서 분화 했다. 참고: 확인을 Formvar 코팅의 손상을 방지 하기 위해 피 펫 팁 그리드를 건드리지 않도록 주의.</li>
	<li>30 분 (37 ° C, 5% CO2) 셀 준수를 품 어.</li>
	<li>10 %FCS 포함 된 RPMI의 2 mL와 잘 작성.</li>
	<li>AFM 관찰 하기 전에 준수 세포를 37 ° C, 5% CO2 에서 2 h에 대 한 장치를 품 어.</li>
</ol>4. 지형 변형 Podosome 유도의 측정
<ol><li>유리 바닥 페 트리 접시에 두 배로 양면 접착 테이프의 두 스트립을 스틱. 주: 2 개의 지구 사이 거리 격자 직경 보다 작은 이어야 한다.</li>
	<li>신중 하 게 접착 테이프에서 대 식 세포와 도금 그리드를 분리 합니다.</li>
	<li>뒤집어 그리드 셀 유리를 직면 하 고 있기 위하여 그리고 두 접착제 스트립 사이의 눈금 막대기.</li>
	<li>수정 2 그리드 새로운 두 배로 양면 접착제의 제거: 그리드 AFM 팁에 액세스할 수는 격자의 중앙 영역을 떠나 두 접착제 스트립 사이 끼여 될 이렇게 것 이다. 참고: 격자 잘 고정 하지 트위스트; 있는지 확인 그렇지 않으면 AFM 캔틸레버 Formvar 표면 접근 수 되지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>10 mM HEPES (pH 7.4)와 보충 사전 온수 37 ° C 배양 (RPMI fcs가 10%)의 2 개 mL를 페 트리 접시를 채우십시오.</li>
	<li>37 ° C 접시 히터에 문화 접시를 놓습니다.</li>
	<li>AFM 무대에 접시 히터를 설치 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 안정화 시스템</li>
	<li>0.5 nN 힘으로 접촉 모드에서 podosomes를 찾을 첫 번째 글로벌 이미지를 만들고 약 20 nm 큰 픽셀 3 Hz에서 Formvar 지형 스캔. 참고: 격자의 가장자리 주변을 스캔 하지 마십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Gilbert, P. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Adaptation+to+Biomechanical+Stress+across+Length+Scales+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+Direct+Stem+Cell+Behaviour+in+Development+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Forces+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Forces in Cell Biology.</a> Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).</li>
<li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protrusion+Force+Microscopy+Reveals+Oscillatory+Force+Generation+and+Mechanosensing+Activity+of+Human+Macrophage+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343(2014).</li>
<li>Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+Together%3A+Spatial+Synchrony+in+the+Force+and+Actin+Dynamics+of+Podosome+First+Neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors.</a> ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).</li>
<li>Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Force+and+Spatial+Dynamics+of+Macrophage+Podosomes+by+Multi-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking.</a> Methods. 94, 75-84 (2016).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Migration+of+Macrophages+Requires+Hck+for+Podosome+Organization+and+Extracellular+Matrix+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis.</a> Blood. 115, 1444-1452 (2010).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Leukocytes+and+Macrophages+of+Various+Phenotypes+Have+Distinct+Abilities+to+Form+Podosomes+and+to+Migrate+in+3d+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments.</a> European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).</li>
<li>Guiet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Mesenchymal+Migration+Requires+Podosome+Stabilization+by+Filamin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).</li>
<li>Maridonneau-Parini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Macrophage+3d+Migration%3A+A+Therapeutic+Challenge+to+Limit+Tissue+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Review%22%5BJournal%5D)">Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration.</a> Immunology Review. 262, 216-231 (2014).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+Phosphorylation+of+Wiskott-Aldrich+Syndrome+Protein+%28Wasp%29+by+Hck+Regulates+Macrophage+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).</li>
<li>Van Goethem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Podosomes+Go+3d%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Podosomes Go 3d.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).</li>
<li>Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Architecture+Dictates+Three-Dimensional+Migration+Modes+of+Human+Macrophages%3A+Differential+Involvement+of+Proteases+and+Podosome-Like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures.</a> Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).</li>
<li>Verollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiv-1+Reprograms+the+Migration+of+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages.</a> Blood. 125, 1611-1622 (2015).</li>
<li>Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podosome+Force+Generation+Machinery%3A+A+Local+Balance+between+Protrusion+at+the+Core+and+Traction+at+the+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring.</a> ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).</li>
<li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory%2FEffector+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li>
<li>Sens, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Invasive+Podosome-Like+Structure+Promotes+Fusion+Pore+Formation+During+Myoblast+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).</li>
<li>Takito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transient+Appearance+of+Zipper-Like+Actin+Superstructures+During+the+Fusion+of+Osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).</li>
<li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언.

물질의 성질
우리의 경우 Formvar, 변형 막에 대 한 재료의 선택은 몇 가지 요구 사항을 충족 해야 합니다. 자료는 가시 광선에 투명 하 고 밝은 분야 및 형광 현미경 관측을 허용 하도록 제한 된 자동 형광을 전시 해야 합니다. 박막의 거칠기 있어야 잘 10 nm 세포 접착에 있는 지형 효과 방지 하 고 AFM 화상 진 찰에 의해 세포 유도 돌출의 명확한 관측을 허용. 마지막으로, 영의 계수 및 재료의 두께에 따라, 막의 강성 해야 podosome 사이트에서 생성 하는 일반적인 스트레스에 대 한 몇 가지 관찰 deformability를 유지 하면서 podosomes의 형성을 유도 하기 위해 충분히 높은 주위는 10-100 kPa. Formvar 소재, 30-80 nm의 박막에 이러한 모든 제약 사이 좋은 타협 이다. 그것은 그 Formvar 막의 두께 조정 하 여 그 강성 조정 될 수 있다 podosomes7</...

동물 세포 매트릭스와 그들의 환경1을 구성 하는 다른 세포와 물리적으로 상호 작용. 이것이, 시체를 내 면화, 외부 정보를 마이그레이션하거나 차별화 그들을 위해 필요 합니다. 그런 과정에서 셀 기계적인 힘을 생성 해야 합니다 및 힘을 생성 하 고 환경 조사에 셀의 능력 영향 확산 예를 들어 감독의 생물 학적 행동으로 수많은 연구 최근 몇 년 동안, 또는 차별화2,3. 차례로, 세포의 힘의 측정 힘 세대의 규정을 연구 하 고 셀 행동과 조직의 운명4,5에 그것의 연루를 이해 주요 원조 이다.
최근 몇 년 동안 셀의 환경6에 행사할 수 있는 힘을 측정 하기 위해 수많은 기술의 개발을 목격 했다. 이들의 대부분 공개 견인 힘 세포 그들은 모바일 프로브 또는 변형 기판에 끌어 발휘 하는 수단이 되었습니다. 그러나, 기계적인 힘 extracellular 환경으로 돌출에 관련 된 측정 기술의 부족에서 고통 되며 날짜 잘 특징.
이 제한을 극복 하기 위해 우리는 기가 기판에가 해지는 힘을 측정 하는 방법을 제시. 그것은 도금을 측정 하는 세포에 의해 기판 변형 고 참여 세력을 추론할 수 직교 방향으로 변형 수 얇은 탄성 시트에 살아있는 세포로 구성 되어있습니다. 기판 지형 나노 분해능 원자 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 측정 되 고 밀어내 세포 구조7,8, 의 기하학의 지식에 의존 하는 변형에서 세력의 평가 9.
여기, 우리는 설치 및 podosomes, 밀어내 접착 구조 3 차원 환경10,11, 그들의 엽 마이그레이션에 대 한 대 식 세포에 의해 형성 된에 의해 생성 된 힘을 측정 하는 응용 프로그램 설명 12,13,14,15,,1617. 우리는이 기술은 힘 생성 및 돌출을 포함 하는 많은 세포질 과정에 그것의 규칙의 이해를 미리 것입니다 믿습니다.

<table><tbody><tr><td>200 메쉬 니켈 그리드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>흰색 스티커 26 x 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>배출구에 밸브가 있는 필름 주조 장치</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Razorblades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 0.5% 용액 in ethylene</td><td>dichloride Electron Microscopy Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>12 mm coverslips</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>원자력 현미경</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>온도 제어 샘플 홀더&nbsp;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 질화물 캔틸레버, 공칭 스프링 상수가 0.01 N/m인</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>양면 접착 테이프</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>헤페스&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 페트리 접시</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

돌출 힘 현미경 검사 법: 셀 돌출에 의해 개발 된 세력을 계량 하는 방법

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

수많은 생물학 문맥에서 동물 세포를 기계적인 힘을 개발 하 여 그들의 환경과 물리적으로 상호 작용 해야 합니다. 이러한 가운데, 견인 힘 잘 성격을 나타낸, 하지만 그들의 기판에 기가 세포에 의해 발휘 된 돌출 힘의 측정을 허용 하는 기술의 부족. 우리는 그들의 기질에 부착 세포에 의해 발휘 된 돌출 힘을 측정 하는 실험 설치 설계. 셀 규격 Formvar 시트에 도금이 기판 변형 하 고 결과 지형 나노미터 스케일에 원자 힘 현미경 (AFM)으로 매핑됩니다. 강제 값 다음 밀어내 세포 구조의 형상에 따라 변형 프로 파일의 분석에서 추출 됩니다. 따라서, 살아있는 세포의 개별 튀어나온 단위에 의해 발휘 된 힘은 시간이 지남에 따라 측정할 수 있습니다. 이 기술은 힘 생성 및 돌출을 포함 하는 많은 세포질 과정에 그것의 규칙의 연구를 수 있게 된다. 여기, 우리 인간의 세포에 의해 형성 하는 podosomes에 의해 생성 된 밀어내 힘을 측정 하는 응용 프로그램을 설명 합니다.

위의 프로토콜 돌출 세력 대 식 세포 podosomes Formvar 기판에 의해 적용 척도를 실험 설치 하는 방법을 설명 합니다. 이 AFM을 사용 하 여 이루어집니다 하 고 그림 1에 나와 있다.
JPK 데이터 처리 소프트웨어를 사용 하 여 podosomes 아래 부푼 것의 지형 이미지를 분석할 때 3도 다항식 적합 해야 공제 하지 각 스캔 라인에서 독립적으로. Podosome 유도 범프의 최대 높이 이미지 측면 z 색 눈금을 추가 하 여 평가 될 수 있다. TIFF 형식으로 수출 되 고, 후 지형 이미지 전용된 집 만든 ImageJ 매크로 사용할 수 온라인8를 사용 하 여 추가 분석 이다. 이 매크로 부푼 것에서 수정된 높이 이미지 및 힘 지도 (<strong c...

여기, 우리 podosomes 지형 이미지의 자동 분석 영화의 준비에서 규격 필름에 적용 되는 돌출 세력을 평가 하는 데 사용 하는 실험 기법을 상세하게.

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

이 절차의 전반적인 목표는 원자력 현미경을 사용하여 돌출력을 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 포뮬러 코팅 그리드를 준비하고 이 필름의 두께를 측정하여 수행됩니다. 이 프로세스의 세 번째 단계는 그리드에 셀을 장착하고 부착하도록 두는 것으로 구성됩니다.절차의 마지막 단계는 원자력 현미경을 사용하여 세포 아래의 포르마 필름을 이미지화하는 것입니다. 기질에 부착할 때 마이크로세포는 포도솜(podosome)이라고 하는 서브마이크로메트릭 접착 구조를 형성합니다. 궁극적으로, 포도솜에 의해 사용되는 필름의 변형은 수제 기계 모델을 사용하여 정량화되고 힘으로 변환될 것입니다.깔때기 필름 주조 장치에 에탄올 깨끗한 유리 조명을 놓고 깔때기 상단을 덮습니다. 레벨이 슬라이드의 2/3에 도달할 때까지 fomvar 용액을 깔때기로 이동합니다. 1분 동안 그대로 둔 다음 formvar 용액을 꾸준한 흐름으로 배출하십시오.필름의 두께는 유속과 formvar 용액의 농도에 따라 달라집니다. 이 조명을 두드려 어둡게 말리고 날카로운 면도날로 직사각형을 잘라냅니다. 폼바르 필름이 물 표면에 뜨도록 증류수가 채워진 비커에 슬라이드를 담그십시오.아세톤 클린 그리드를 필름에 조심스럽게 놓고 그 중 일부는 12mm 직경의 커버 슬립으로 반짝이는 앞면이 위로 향하게 합니다. 두께 평가 실험에 사용됩니다. 결국 스티커로 덮인 슬라이드를 담그면 전체 필름과 그리드를 복구할 수 있습니다.유리로 덮인 슬립의 윤곽을 핀셋으로 윤곽을 그려 폼바를 자르고 슬라이드에서 분리합니다. 덮인 슬립 아래에 그리드의 위치를 장착한 다음 핀셋으로 그리드의 윤곽을 그려 분리합니다. 이렇게 생성된 폼바르 필름의 구멍은 두께를 측정하기 위해 이미지화됩니다.질산규소를 AFM 유리 블록에 장착하여 황금색 줄무늬가 스프링 끝 아래에 있지 않은지 확인합니다. 유리 블록을 AFM 모듈에 장착한 다음 후자를 현미경 스테이지에 놓습니다. 폼바르 코팅된 커버 슬립을 PBS가 위에 오도록 하여 관찰실에 놓습니다.접촉 모드에서 0.5 나노 뉴턴 포인트로 fomvar와 glass 사이의 경계를 스캔합니다. 데이터 처리 소프트웨어에서 유리 표면을 높이 참조로 사용하고 단면의 fomvar 두께를 측정합니다. 멸균 후드 아래에서 12mm 커버 슬립을 선택하고 구멍 면 테이프 스트립을 붙입니다.핀셋으로 fomavr 코팅 그리드의 윤곽을 그리고 광택이 나는 앞면이 위로 향하게 하여 측면만 접착제에 부착되도록 합니다. 이는 테이프에서 그리드를 제거할 때 폼바르가 찢어지는 것을 방지하기 위한 것입니다. 커버 스트립을 멸균 6웰 플레이트에 넣고 10mm 물방울의 무혈청 배양 배지에 파이프를 넣습니다.약 10,000개의 세포를 포함해야 하며, 이 경우 이들은 인간 단핵구와 구별된 마이크로세포입니다. fomvar 코팅이 손상되지 않도록 이 과정에서 파이퍼 팁으로 그리드를 만지지 마십시오. 세포가 부착되도록 30분 동안 배양한 다음 혈청이 보충된 배지로 웰을 채우고 AFM 관찰 전에 2시간 동안 다시 배양합니다.유리 바닥 페트리 접시에 양면 테이프의 두 개의 평행한 스트립을 놓고 격자 직경에 비해 그 사이의 너비가 약간 작은지 확인합니다. 그런 다음 이전에 세포가 시드된 그리드를 분리하고 세포가 아래를 향하도록 하여 두 개의 테이프 스트립 위에 놓습니다. 투과성 스트립 위에 두 개의 다른 스트립을 배치하여 그리드를 고정합니다.헤페가 첨가된 예열된 배양 배지로 접시를 채웁니다. 접시를 이전에 섭씨 37도로 설정한 식기 히터에 놓습니다. AFM 스테이지에 세트를 설치합니다.시스템 온도가 섭씨 37도에서 안정되면 0.95 나노 뉴턴 설정점을 사용하여 접촉 모드에서 수행해야 하는 fomvar 표면의 스캔을 진행하고 편향 데이터 보기 창에서 원생동물 관련 변형을 시각화합니다. 다음은 AFM을 사용하여 그래픽 측정에 대한 대형을 산출하기 위한 대표적인 결과 및 처리 단계입니다. 이 이미지에서 볼 수 있듯이 fomvar 표면의 돌출부가 감지됩니다.이 사진 정보를 힘 값으로 변환하려면 먼저 국부적으로 높은 차이에 액세스할 수 있어야 합니다. 이렇게 하려면 3차 다항식 피팅을 스캔 라인에서 독립적으로 빼야 합니다. 그런 다음 수제 전용 이미지 알고리즘을 사용하여 AFM 높이 맵에서 원생 동물 매개 돌출의 기계적 모델에서 돌출력 값을 평가할 수 있습니다.이 절차 덕분에 우리는 원생동물에서 돌출력 생성과 관련된 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 시청해주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 행운을 빕니다.

protrusion-force-microscopy-method-to-quantify-forces-developed-cell

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포의 미세 영상은 cytoskeletal 구조에서 동적 변화 특성화 수 있습니다. 고정 표본을 사용하는 기술과는 달리,이 방법은 전에 동일한 세포에있는 굴지의 cytoskeleton의 시간적 변화에 대한 자세한 평가, 동안 다양한 물리적, 약리, 또는 염증성 자극 후를 제공합니다.

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포 굴지의 Cytoskeleton 연구

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.

핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

여기에서, 우리는 간격 접합 connexin 43를 중단하고 견인및 세포간 응력의 관측을 통해 내피 생체 역학에 있는 후속 충격을 측정하기 위하여 역학 기지를 둔 프로토콜을 제시합니다.

코넥신 43 구조적 파괴를 통한 내피 생체역학 의 교란

이 프로토콜은 참조가 없는 견인력 현미경으로 사용하기 위해 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 하이드로겔에 내장된 형광 선한 마커의 3차원 배열을 제작하기 위해 다광자 리소그래피를 구현하기 위한 지침을 제공합니다. 플랫폼. 이 지침을 사용하여 3D 재료 변형률 측정 및 셀룰러 견인 계산이 단순화되어 고처리량 견인력 측정을 촉진합니다.

레퍼런스 프리 견인력 현미경 플랫폼 제작 및 구현

여기서 우리는 B 세포에 견인력 현미경 실험을 수행하는 데 사용되는 프로토콜을 제시한다. 우리는 연약한 폴리 아크릴아미드 젤의 준비와 그 기능성, 현미경에서의 데이터 수집 및 데이터 분석의 요약을 설명합니다.

B 림프구 활성화를 연구하는 견인력 현미경 검사법

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

iTACS(셀룰러 신호)를 분석하는 통합 툴킷은 부착 셀에서 다양한 화학 및 기계적 신호를 동시에 측정하는 과정을 자동화합니다. iTACS는 지역 사회 기반의 개발을 용이하게하고 연구원이 교육 배경에 관계없이 모든 플랫폼 기능을 사용할 수 있도록 설계되었습니다.

세포 신호를 분석하는 통합 툴킷: 힘, 동작, 형태학 및 형광

이 프로토콜은 확산 세포의 가장자리에서 돌출부의 동적 매개 변수 (돌출부, 수축, 주름)를 측정하는 것을 목표로합니다.

라이브 셀 현미경을 사용하여 확산 중 셀 에지 돌출 역학 측정

진급하려면 성장 콘이 외부 환경에 대한 견인력을 발휘해야 합니다. 견인력의 생성은 액틴 역학 및 클러치 커플링에 의존합니다. 본 연구는 성장 콘 발전을 위한 액틴 역학, 클러치 커플링 및 견인력을 분석하는 방법을 설명합니다.

액틴 다이내믹스, 클러치 커플링, 성장 콘 발전을 위한 견인력 분석

우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

배우세요 대식세포의 포도소좀 돌출 힘을 원자력 현미경으로 정량화하는 방법을. 필름 변형 측정과 역학 모델을 통해 세포 부착 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

돌출 힘 현미경 검사 법: 셀 돌출에 의해 개발 된 세력을 계량 하는 방법

더 많은 동영상 탐색