돌출 힘 현미경 검사 법: 셀 돌출에 의해 개발 된 세력을 계량 하는 방법

이 절차의 전반적인 목표는 원자력 현미경을 사용하여 돌출력을 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 포뮬러 코팅 그리드를 준비하고 이 필름의 두께를 측정하여 수행됩니다. 이 프로세스의 세 번째 단계는 그리드에 셀을 장착하고 부착하도록 두는 것으로 구성됩니다.

절차의 마지막 단계는 원자력 현미경을 사용하여 세포 아래의 포르마 필름을 이미지화하는 것입니다. 기질에 부착할 때 마이크로세포는 포도솜(podosome)이라고 하는 서브마이크로메트릭 접착 구조를 형성합니다. 궁극적으로, 포도솜에 의해 사용되는 필름의 변형은 수제 기계 모델을 사용하여 정량화되고 힘으로 변환될 것입니다.

깔때기 필름 주조 장치에 에탄올 깨끗한 유리 조명을 놓고 깔때기 상단을 덮습니다. 레벨이 슬라이드의 2/3에 도달할 때까지 fomvar 용액을 깔때기로 이동합니다. 1분 동안 그대로 둔 다음 formvar 용액을 꾸준한 흐름으로 배출하십시오.

필름의 두께는 유속과 formvar 용액의 농도에 따라 달라집니다. 이 조명을 두드려 어둡게 말리고 날카로운 면도날로 직사각형을 잘라냅니다. 폼바르 필름이 물 표면에 뜨도록 증류수가 채워진 비커에 슬라이드를 담그십시오.

아세톤 클린 그리드를 필름에 조심스럽게 놓고 그 중 일부는 12mm 직경의 커버 슬립으로 반짝이는 앞면이 위로 향하게 합니다. 두께 평가 실험에 사용됩니다. 결국 스티커로 덮인 슬라이드를 담그면 전체 필름과 그리드를 복구할 수 있습니다.

유리로 덮인 슬립의 윤곽을 핀셋으로 윤곽을 그려 폼바를 자르고 슬라이드에서 분리합니다. 덮인 슬립 아래에 그리드의 위치를 장착한 다음 핀셋으로 그리드의 윤곽을 그려 분리합니다. 이렇게 생성된 폼바르 필름의 구멍은 두께를 측정하기 위해 이미지화됩니다.

질산규소를 AFM 유리 블록에 장착하여 황금색 줄무늬가 스프링 끝 아래에 있지 않은지 확인합니다. 유리 블록을 AFM 모듈에 장착한 다음 후자를 현미경 스테이지에 놓습니다. 폼바르 코팅된 커버 슬립을 PBS가 위에 오도록 하여 관찰실에 놓습니다.

접촉 모드에서 0.5 나노 뉴턴 포인트로 fomvar와 glass 사이의 경계를 스캔합니다. 데이터 처리 소프트웨어에서 유리 표면을 높이 참조로 사용하고 단면의 fomvar 두께를 측정합니다. 멸균 후드 아래에서 12mm 커버 슬립을 선택하고 구멍 면 테이프 스트립을 붙입니다.

핀셋으로 fomavr 코팅 그리드의 윤곽을 그리고 광택이 나는 앞면이 위로 향하게 하여 측면만 접착제에 부착되도록 합니다. 이는 테이프에서 그리드를 제거할 때 폼바르가 찢어지는 것을 방지하기 위한 것입니다. 커버 스트립을 멸균 6웰 플레이트에 넣고 10mm 물방울의 무혈청 배양 배지에 파이프를 넣습니다.

약 10,000개의 세포를 포함해야 하며, 이 경우 이들은 인간 단핵구와 구별된 마이크로세포입니다. fomvar 코팅이 손상되지 않도록 이 과정에서 파이퍼 팁으로 그리드를 만지지 마십시오. 세포가 부착되도록 30분 동안 배양한 다음 혈청이 보충된 배지로 웰을 채우고 AFM 관찰 전에 2시간 동안 다시 배양합니다.

유리 바닥 페트리 접시에 양면 테이프의 두 개의 평행한 스트립을 놓고 격자 직경에 비해 그 사이의 너비가 약간 작은지 확인합니다. 그런 다음 이전에 세포가 시드된 그리드를 분리하고 세포가 아래를 향하도록 하여 두 개의 테이프 스트립 위에 놓습니다. 투과성 스트립 위에 두 개의 다른 스트립을 배치하여 그리드를 고정합니다.

헤페가 첨가된 예열된 배양 배지로 접시를 채웁니다. 접시를 이전에 섭씨 37도로 설정한 식기 히터에 놓습니다. AFM 스테이지에 세트를 설치합니다.

시스템 온도가 섭씨 37도에서 안정되면 0.95 나노 뉴턴 설정점을 사용하여 접촉 모드에서 수행해야 하는 fomvar 표면의 스캔을 진행하고 편향 데이터 보기 창에서 원생동물 관련 변형을 시각화합니다. 다음은 AFM을 사용하여 그래픽 측정에 대한 대형을 산출하기 위한 대표적인 결과 및 처리 단계입니다. 이 이미지에서 볼 수 있듯이 fomvar 표면의 돌출부가 감지됩니다.

이 사진 정보를 힘 값으로 변환하려면 먼저 국부적으로 높은 차이에 액세스할 수 있어야 합니다. 이렇게 하려면 3차 다항식 피팅을 스캔 라인에서 독립적으로 빼야 합니다. 그런 다음 수제 전용 이미지 알고리즘을 사용하여 AFM 높이 맵에서 원생 동물 매개 돌출의 기계적 모델에서 돌출력 값을 평가할 수 있습니다.

이 절차 덕분에 우리는 원생동물에서 돌출력 생성과 관련된 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 시청해주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 행운을 빕니다.