Immunodeficient 마우스의 생체 공학 인간 Microvascular 네트워크

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내 인간 혈관 네트워크를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 인간 혈액 유래 내피 콜로니 형성 세포와 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 배양함으로써 달성됩니다. 그런 다음 두 세포 유형을 콜라겐 기반 젤에 혼합하여 면역 결핍 마우스에 피하 주입합니다.

7일 후, 임플란트를 채취하여 인간 혈관 네트워크 형성을 평가합니다. 궁극적으로, 임플란트 내부에 인간 특이적 미세혈관이 존재하는지는 그의 조직학과 면역조직화학을 통해 확인할 수 있습니다. 구조물의 외과적 이식과 같은 산성 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 LED이고 간단하고 수행하기 쉬우며 수술이 필요하지 않다는 것입니다.

먼저 E CFC 바이알 하나를 해동하고 10ml의 DMEM이 포함된 15ml 원뿔형 혼합물로 세포를 즉시 희석합니다. 1200RPM에서 5분 동안 셀 현탁액을 회전시키고 Resus는 10ml의 따뜻한 EGM 2배지에 셀 펠릿을 현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 1% 젤라틴으로 코팅된 100mm 조직 배양 플레이트로 옮기고 가습된 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.

다음 날 아침, 배지와 결합되지 않은 세포를 부드럽게 흡인합니다. 그런 다음 결합된 세포에 10ml의 신선한 E GM 2 배지를 공급합니다. 합류 단층이 형성될 때까지 다음 며칠 동안 이 과정을 계속합니다.

그런 다음 10ml의 PBS로 세포를 씻으십시오. PBS를 2ml의 트립신 EDTA로 교체하고 플레이트를 5분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 현미경으로 5분 후 플레이트를 부드럽게 두드리고 세포가 분리되었는지 확인합니다.

그렇지 않은 경우 부드러운 흔들림으로 짧은 부화를 반복하십시오. 세포가 완전히 분리되면 8ml의 EGM 2 배지를 세포에 추가하고 세포를 15ml 원뿔형으로 옮깁니다. 셀을 세고 1200RPM에서 5분 동안 스핀다운합니다.

지금 5의 착석 조밀도에 1%gelatin로 입힌 조직 배양 판, 평방 센티미터 당 000의 세포에 세포를 도금하십시오. EGM 2 배지에서 세포를 배양하고 EGM 2 배지를 2-3일마다 공급합니다. 4번과 8번 구간 사이의 후속 구간에 대해 이 절차를 반복합니다.

E CFC를 사용할 준비가 됩니다. 이 프로토콜은 MSC를 성장시키는 데에도 사용할 수 있습니다. E GM 2 매체를 M-S-C-G-M 매체로 교체하기만 하면 됩니다.

코팅되지 않은 배양 플레이트를 사용하십시오. 80%confluence와 10의 씨를 뿌리는 조밀도에 subculture, 평방 센티미터 당 000의 세포를 subculture를 시작하십시오. 이 실험에는 임플란트당 800, 000 E CFC와 1, 200, 000 MSC가 필요합니다.

일반적으로 5개의 임플란트가 동시에 준비됩니다. 먼저 배양 플레이트에서 세포 배지를 흡인하고 각 세포 플레이트를 10ml의 PBS로 세척합니다. PBS를 2ml의 트립신 EDTA로 교체하고 부드러운 흔들림으로 플레이트를 배양합니다.

세포가 모두 분리될 때까지 2-5분마다 현미경으로 세포를 확인합니다. 그런 다음 8ml의 DMEM을 추가하고 세포 용액을 수집합니다. 15ml 원뿔형에서 세포를 세고 5개의 임플란트에 충분한 세포를 하나의 15ml 원뿔형으로 이동합니다.

그런 다음 1200RPM에서 5분 동안 셀을 스핀다운하고 스내트를 제거합니다. 얼음 위에 피브리노겐과 콜라겐 피브로넥틴의 혼합물을 조심스럽게 준비합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 혼합물에 세포 펠릿을 매우 부드럽게 재현탁시킵니다.

기포가 형성되지 않도록 셀 현탁액을 1ml 주사기에 넣고 뚜껑이 있는 26 게이지 바늘을 부착합니다. 세포 혼합물이 주입될 때까지 장전된 주사기를 얼음 위에 두십시오. ISO 불소 챔버를 사용하여 6주 된 4마리의 흉선 누드 면역 결핍 마우스를 마취했습니다.

마우스가 마취되고 발가락 꼬집음에 반응하지 않으면 각 마우스에 대해 주사를 진행합니다. 30 게이지 바늘을 사용하여 50마이크로리터의 트롬빈 용액을 상부 등쪽 부위에 피하 주사합니다. 같은 위치에서 200마이크로리터의 세포 혼합물을 주입합니다.

26게이지 바늘을 사용하여 주입된 거대분자는 겔화되어 피부 아래에 작지만 눈에 띄는 돌기를 형성합니다. 주사 후 편안함과 따뜻함을 위해 거즈 층 위에 마우스를 놓습니다. 보행 할 수있을 때까지 관찰하십시오.

앞으로 3일 동안 동물의 전반적인 건강 상태를 매일 관찰하십시오. 주사 일주일 후, 생쥐를 이산화탄소로 안락사시키고 수술로 젤 플러그를 제거합니다. 일단 회수되면 눈금자 옆의 젤 플러그를 촬영한 다음 각 젤 플러그를 조직학 카세트에 넣고 실온에서 밤새 10% 중성 완충 포르민에 담급니다.

다음날, 10% 중성 완충 포르민을 증류수로 씻어냅니다. 조직학적 평가를 위해 평가될 때까지 섭씨 4도의 PBS에 카세트를 보관하십시오. 파라핀에 삽입된 임플란트의 7미크론 부분을 만듭니다.

그런 다음 임플란트의 중간 부분에 있는 미세 혈관의 밀도를 정량화합니다. H 및 e 염색의 도움으로 평방 밀리미터당 혈관 수를 점수화하여 미세 혈관의 인간 특성을 입증합니다. 시판되는 anti-human CD 31 항체로 절편을 1 대 100 희석으로 염색합니다.

이 위상차 이미지는 제대혈 유래 e CFC의 전형적인 합류 단층에서 내피 세포의 특징적인 조약돌 형태를 보여줍니다. 이 이미지는 인간 골수 유래 MSC의 일반적인 방추체 형태를 보여줍니다. 생쥐 숙주에서 일주일 동안 배양한 후, 노란색 점선으로 표시된 임플란트는 더 높은 배율에서 숙주의 조직과 매우 다르게 보였습니다.

여러 개의 미세혈관이 드러났으며, 적혈구를 포함하는 내강 구조가 발견되었으며 노란색 화살촉으로 강조 표시되어 있습니다. 플러그를 면역조직화학적으로 검사했을 때, 미세혈관의 내강은 인간 CD 31에 대한 단클론 항체에 반응했습니다. 세포핵은 헤마틴으로 대조염색하였다.

일단 마스터되면 이 기술은 제대로 수행되면 1온스 이내에 수행할 수 있습니다.