Name: Immunodeficient 마우스의 생체 공학 인간 Microvascular 네트워크 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 배우세요 면역결핍 마우스에서 콜라겐/피브로넥틴 겔에 포함된 ECFC와 MSC를 주입하여 생체 내 인간 혈관 네트워크를 생성하는 방법을. 이 기술은 혈관 재생 의학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 부분적으로 JM - M에 NIH 부여 K99EB009096 - 01A1에 의해 지원되었다.

1. 준비 <ol><li> EGM - 2 미디어 (500 ML)를 확인 <ul><li> 내피 기초 매체의 395 ML (EBM - 2) 태아 소 혈청 100 ML (FBS)을 추가합니다. </li><li> 100x 글루타민 - 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션 (GPS)의 5 ML을 추가합니다. </li><li> 하이드로코티손 (즉, VEGF, hFGF - B, R - IGF - 1, hEGF, 헤파린, 아스코르비 산, 그리고 GA - 1000)를 제외한 모든 EGM - 2 SingleQuots 보조를 추가합니다. </li><li> 0.2 - μm의 기공 크기 진공 필터 살균 필터. </li></ul></li><li> MSCGM 매체 (500 ML)를 확인 <ul><li> Mesenchymal 줄기 세포 기저 매체 (MSCBM)의 440 ML에 100x GPS의 5 ML을 추가합니다. </li><li> MSCGM SingleQuots 키트의 모든 내용을 추가합니다. </li><li> EGM - 2 SingleQuots 보조에서 hFGF - B의 나누어지는를 추가합니다. </li><li> 0.2 - μm의 기공 크기 진공 필터 살균 필터. </li></ul></li><li> DMEM 매체 (500 ML)를 확인 <ul><li> 1X 높은 포도당 Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM)의 440 ML에 태아 소 혈청 50 ML (FBS)을 추가합니다. </li><li> 100x의 GPS의 5 ML을 추가합니다. </li><li> 불필요한 아미노산 솔루션의 5 ML을 추가합니다. </li><li> 0.2 - μm의 기공 크기 진공 필터 살균 필터. </li></ul></li><li> 콜라겐 / fibronectin 솔루션 (; 사출로 만든 당일 3.6 ML)를 확인 <ul><li> 소주 H 2 O. 150 μL에 10X DMEM의 0.4 ML 추가 </li><li> 1M HEPES 100 μL (최종 25 MM)를 추가합니다. </li><li> 신중하게, 보빈 콜라겐의 2.4 ML (5 MG / ML 주식, 3 MG / ML 최종)을 추가하고 얼음에 부드럽게 섞는다. </li><li> (약 30 μL) 1N NaOH 용액을 추가하여 중립으로 산도를 조정합니다. </li><li> 중성 산도를 평가하기 위해 페놀 빨간색 표시등을 사용하여, 대안, 산도을 모니터 산도 테스트 용지를 사용합니다. </li><li> (; 30 μg / ML 최종 1 MG / ML 주식) 인간 fibronectin 120 μL 추가 </li><li> FBS의 0.4 ML (10 % 최종)를 추가 </li><li> 사용 전까지 얼음 솔루션을 유지. </li></ul></li><li> 피브리노겐 용액 (; 사출로 만든 당일 1 ML)을 확인 <ul><li> 0.9N NaCl 1 ML (산도 7.4) 솔루션 (30 MG / ML 최종)에 분말 섬유소의 30 밀리그램을 추가합니다. </li><li> 전에 사용, 37에서 피브리노겐 솔루션을 품어 ° C를 30 분. </li><li> 이전 콜라겐 / fibronectin 겔하기 위해뿐만 아니라, vortexing없이 부드럽게 섞는다. </li></ul></li><li> 트롬빈 용액 (200 ML)를 확인 <ul><li> 0.9 % NaCl 정상적인 생리 (50 U / ML) 200 ML에 가루 트롬빈의 1 구를 추가합니다. </li><li> 사용하기 전까지 -20 ° C에서 0.2 - μm의 기공 크기 주사기 필터 및 매장과 소독 필터. </li><li> 이전 10 U / ML의 최종 농도 0.9 % NaCl 정상 식염수에 희석 사용합니다. </li></ul></li><li> 1퍼센트 젤라틴 용액 (500 ML)를 확인 <ul><li> Dulbecco의 인산염 500 ML에 가루 젤라틴 5g을 추가 호수 (PBS)를 버퍼. </li><li> 121 ° C에서 30 분 Autoclaved. </li><li> 0.2 - μm의 기공 크기 진공 필터 살균 필터. </li></ul></li><li> 1퍼센트 젤라틴 코팅 솔루션 코트 100 mm 조직 문화 플레이트 <ul><li> 각 100 mm 조직 문화 판에 1% 젤라틴 용액 10 ML을 추가합니다. </li><li> 37 접시를 품어 ° C를 60 분. </li><li> 사용하기 전에, 젤라틴 용액을 제거하고 PBS로 한 접시를 씻으십시오. </li></ul></li></ol> 2. 휴먼 코드의 문화 내피 콜로니 - 성형 전지 (ECFCs)를 피를 유래 이 프로토콜은 ECFC의 냉동 유리병이 실험 전에 실험실에서 사용할 수 있습니다 가정합니다. ECFC는 탯줄 혈액이나 이전에 7 설명된대로 성인 말초 혈액 중의 mononuclear 세포 분획으로부터 격리 수 있습니다. <ol><li> ECFCs의 해동 한 유리병 (일반적으로 동결 미디어 1 ML 0.5 - 1x10 6 전지)는 액체 질소 저장 탱크에서 가져온 즉시 DMEM 매체 10 ML을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브의 내용을 희석. 5 분 1,200 rpm으로 회전. 뜨는 제거하고 따뜻한 EGM - 2 중간 10 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 젤라틴 - 코팅 100 - mm 조직 배양 플레이트 하나 1퍼센트에 ECFC 정지 10 ML을 추가합니다. 37 ° C와 5% CO 2에서 humidified 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 다음날, 부드럽게 언바운드 세포와 매체를 대기음, 신선한 EGM - 2 중간 10 ML로 묶인 세포를 공급. </li><li> EGM - 2 미디어와 모든 2~3일 접시를 공급. 세포 접시가 합류 세포 monolayer로 덮여있다 이러한 확장하도록 허용합니다. 코플루엔스에서 다음과 같이 전지를 subculture : </li><li> 문화 매체를 기음과 PBS의 10 ML로 세포를 씻어. </li><li> PBS를 제거하고 각 100 mm 판에 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 2 ML를 추가합니다. 부드럽게 골고루 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 배포하는 번호판을 바위. 37 품어 ° C와 5% 3~5분에 대한 CO 2. 부드럽게 거꾸로 현미경으로 정지에서 분리 세포를 볼 수있는 접시를 누릅니다. </li><li> 세포가 완전히 분리하면, EGM - 2 배지 8 ML을 추가하고 셀 solu를 수집15 ML 원뿔 관에 기. 혈구계에 세포를 세고 수확한 세포의 총 수를 해결 10 μL를 가져가라. </li><li> 플레이트 EGM - 2 배지를 사용하여 5,000 세포 / cm의 시딩 밀도에 1퍼센트 젤라틴 코팅 조직 문화 접시에있는 세포 2. 인큐베이터에있는 접시를 놓고 EGM - 2 미디어와 모든 2-3일 그들을 먹여 살리지. </li></ol> 이후 구절에 대해이 절차를 반복합니다. 세포 인구가 확장으로 통과 번호를 추적할. ECFCs는 구절 4-8 사이에 사용됩니다. 3. 인간 뼈의 문화 골수 - 유래 Mesenchymal 줄기 세포 (MSCS) 이 프로토콜은 인간 MSC의 냉동 유리병이 실험 전에 실험실에서 사용할 수 있습니다 가정합니다. 골수가로 이전 11 설명한 aspirates에서 MSC는 격리 될 수 있습니다. <ol><li> MSCS의 해동 한 유리병 (일반적으로 1 ML 냉동 미디어에 0.50 - 1x10 6 전지)는 액체 질소 저장 탱크에서 가져온 즉시 DMEM 매체 10 ML을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브의 내용을 희석. 5 분 1,200 rpm으로 회전. 뜨는 제거하고 따뜻한 MSCGM 매체 10 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 한 uncoated 100 mm 조직 배양 플레이트에 MSC 서스펜션의 10 ML을 추가합니다. 37 ° C와 5% CO 2에서 humidified 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 다음날, 부드럽게 언바운드 세포와 매체를 대기음, 신선한 MSCGM 매체의 10 ML로 묶인 세포를 공급. </li><li> MSCGM 매체와 모든 2~3일 접시를 공급. 세포 접시 합류 세포 monolayer의 80 %에 도달 이러한 확장하도록 허용합니다. 80 % 코플루엔스에서 다음과 같이 전지를 subculture : </li><li> 문화 매체를 기음과 PBS의 10 ML로 세포를 씻어. </li><li> PBS를 제거하고 각 100 mm 판에 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 2 ML를 추가합니다. 부드럽게 골고루 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 배포하는 번호판을 바위. 37 품어 ° C와 5% 3~5분을위한 CO2. 부드럽게 거꾸로 현미경으로 정지에서 분리 세포를 볼 수있는 접시를 누릅니다. </li><li> 세포가 완전히 분리하면, MSCGM 매체 8 ML을 추가하고 15 ML 원뿔 튜브에 세포 솔루션을 수집합니다. 혈구계에 세포를 세고 수확한 세포의 총 수를 해결 10 μL를 가져가라. </li><li> 플레이트 10,000 세포 / cm 2 MSCGM 매체를 사용 시딩 밀도에 uncoated 조직 문화 접시에있는 세포. 인큐베이터에있는 접시를 놓고 MSCGM 매체와 모든 2-3일 그들을 먹여 살리지. </li></ol> 이후 구절에 대해이 절차를 반복합니다. 세포 인구가 확장으로 통과 번호를 추적할. MSCS는 구절 4-8 사이에 사용됩니다. 4. 콜라겐 / Fibronectin / 피브리노겐 용액에 셀의 Resuspension (주 0) 0.8x10 6 ECFCs 및 1.2x10 6 MSCS 각 이식 및 마우스 필요합니다, 전에 실험, 문화에 충분한 ECFCs 및 MSCS가 있는지 확인하십시오. <ol><li> 각각의 문화 판의 매체를 기음과 PBS의 10 ML으로 세포를 씻으십시오. PBS를 제거하고 각 100 mm 판에 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 2 ML를 추가합니다. 부드럽게 골고루 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 배포하는 번호판을 바위. 3~5분을위한 부화. 부드럽게 거꾸로 현미경으로 정지에서 분리 세포를 볼 수있는 접시를 누릅니다. </li><li> 세포가 완전히 분리하면, DMEM 매체 8 ML을 추가하고 15 ML 원뿔 튜브에 세포 솔루션을 수집합니다. 혈구계에서 세포를 계산하고 ECFCs 및 MSCS 수확한의 총 수를 해결 10 μL를 가져가라. </li><li> 전송 4x10 6 ECFCs (5 배 0.8x10 6 셀)과 하나의 50 ML 원뿔 관에 함께 6x10 6 MPCs (5 배 1.2x10 6 셀). 이 다섯 개인 이식과 생쥐에 필요한 세포의 총 금액입니다. 1,200 rpm으로 원심 분리기 및 뜨는을 제거하십시오. </li><li> 부드럽게, 콜라겐 / fibronectin 솔루션 (3 MG / ML 최종 피브리노겐 농도)의 0.9 ML로 피브리노겐 용액 100 UL을 추가, 얼음의 혼합물을 유지. </li><li> 얼음 차가운 콜라겐 / fibronectin / 피브리노겐 용액 1 ML에있는 세포 펠렛을 Resuspend, 거품을 피하기 위해 매우 부드럽게 세포를 섞는다. 1 - ML 멸균 주사기에 혼합로드하고, 주사기의 끝에 그 모자와 26 게이지 바늘을 놓으십시오. 사출까지 얼음에 로드된 주사기 보관하십시오. </li></ol> 5. Immunodeficient 누드 마우스에 주입 (주 0) 모든 동물 실험은 6 주 오래된 athymic 누드 (뉴 / 뉴) 생쥐와 함께 진행됩니다. <ol><li> 전에 주사로, isoflurane 제공 가스실에 그들을 배치하여 immunodeficient 생쥐를 마취. 그들은 (검사하여 심장 박동을 모니터) anesthetized과 발가락 핀치에 응답하기 전까지는 생쥐가 약 2 분 동안 isoflurane을 흡입하도록 허용합니다. </li><li> 각 마우스, subcutaneously 26 게이지 바늘을 사용하여 상부 등의 영역으로 트롬빈 용액 50 μL (10 U / ML)를 주입. </li><li c><li> 주사 후, 편안함과 따뜻함에 대한 거즈의 레이어에 마우스를 배치하고 그들이 외래 될 때까지 그들을 관찰합니다. 그런 후, 첫 번째 사흘 동안 매일 생쥐를 관찰합니다. </li></ol> 6. 수확 (주 7) <ol><li> 한 주 주사 후, 압축 CO 2 가스를 제공 가스실에 그들을 배치하여 쥐를 안락사. </li><li> 일단 euthanized, 사출 영역 근처에 피부를 열고 잘라 수술 겔 플러그를 제거합니다. 규모로 검색 겔 플러그의 디지털 사진을하시기 바랍니다. </li><li> histological 카세트에 수확 겔 플러그를 삽입하고 깊이 10%로가 중립은 실온에서 하룻밤 포르말린을 버퍼. </li><li> 고정 후, 중립은 소주 H 2 O와 함께 거리에 포르말린 버퍼 10 % 씻고 4 histological 카세트를 삽입 ° PBS에서 C까지 histological 평가합니다. </li></ol> 7. 평가 : 조직학 (H &amp; E)와 Immunohistochemistry (hCD31) <ol><li> histological 평가를위한, 임플란트는 파라핀 및 표준 histological 절차를 사용하여 (7 μm의 두께 부분) sectioned에 포함됩니다. </li><li> 임플란트의 중간 부분에서 가져온 Hematoxilin과 Eosin (H &amp; E) 스테인드 섹션의 평가에 의해 microvessel 밀도를 계량. H &amp; E의 얼룩 표준 프로토콜이 다른 곳으로 찾을 수 있습니다. Microvessels은 적혈구를 포함 lumenal 구조로 확인할 수 있습니다. 적혈구의 평균 수를 셀 가득한 선박 / mm 2로 분석 및 표현 분야에서 microvessels로 microvessels 밀도보고합니다. </li><li> microvascular 선박, 검색된 보형물의 섹션의 인간의 본성을 설명하는 immunohistochemically 인간 특정 CD31 (hCD31) 표준 얼룩 프로토콜을 사용하여 항체 물들일해야합니다. 1:100 희석에, 우리는 DakoCytomation (CAT # M0823. 클론 JC70A)에서 단클론 마우스 안티 - 인간 CD31 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 이 항체의 인간의 특이성은 병렬 7,11의 스테인드되었습니다 마우스 조직 섹션의 다양성과 함께 얻은 부정적인 반응에 의해 확인되었습니다. 지폐, 마우스 혈관이 자주 (특히 국경 주변) 임플란트 안에 볼 수 있지만, 마우스 선박이 항체와 긍정적인 얼룩이되지 않습니다. 또한, 인간 MSC의 존재는 CD90 또는 α - 평활근의 굴지 (α - SMA)에 대한 인간의 특정 항체와 immunohistochemical 얼룩에 의해 감지하실 수 있습니다. 인간 MSC는 새로 형성된 혈관의 혈관 주위의 지역에서 interstitially 보형물 11 전역에 모두 볼 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. ECFC 및 MSC 문화의 전형적인 모습. 위상 콘트라스트 micrographs는 ECFCs과 문화에 MSCS의 전형적인 모양을 표시. 내피 세포의 특성 코블 - 스톤 형태를 표시하는 코드 혈액 파생 ECFCs의 (A) 콘플루앙 monolayer. (B) 인간 뼈 MSCS는 스핀들 모양의 형태를 표시하는 골수 - 유래. 스케일러 바 200 음. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 일 7 explanted 플러그의 모양. 인간의 코드 혈액 골수 파생된 파생 MSCS ECFCs과 뼈가 콜라겐 / fibronectin / 섬유소 겔에 포함된하고 텍스트에서 설명한대로 누드 생쥐에 subcutaneously 이식되었다. (A) 7 일 후에 마우스가 euthanized되면​​ 사출 영역 근처에 피부를 열고 잘라 피부를 틀지하여 셀 / 젤 플러그를 노출. (B) 플러그의 모양은 수술 마우스와 포르말린 고정하기 전에에서 삭제되었습니다. 보형물의 붉은 색은 vascularization의 표시입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. explanted 플러그의 혈관 네트워크의 Histological 식별. Hematoxilin과 Eosin (H &amp; E) 스테인드 섹션 explanted 플러그의 중간 부분에서 가져온. (A) 주변 호스트 조직의 컨텍스트 (즉, 지방 조직과 골격근)의 이식 (노란 점선으로 표시) 표시 낮은 배율 (10X) 현미경. (B) 높은 배율 (40x) 플러그인 내부 현미경 표시 여러 microvessels (노란색 애로 그들 중 일부를 겨누고); microvessels은 적혈구를 포함 lumenal 구조로 확인할 수 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 인간 Immunohistochemical 식별루멘. Immunohistochemically 스테인드 섹션 explanted 플러그의 중간 부분에서 가져온. 1:100 희석에, 얼룩이 DakoCytomation (CAT # M0823. 클론 JC70A)에서 단클론 마우스 안티 - 인간 CD31 (hCD31) 항체를 사용하여 실시되었다 세포 핵은 hematoxilin와 counterstained되었습니다. (A) 호스트 조직을 둘러싼 상황에서 이식 (검은 점선으로 delineated) 표시 낮은 배율 (10X) 현미경. 인간의 특정, CD31 양성 microvessels은 갈색 (퍼옥시데이즈의 얼룩)에 물들어 있습니다. (B) 높은 배율 (40x) 현미경은 플러그 내부에 여러 인간 microvessels (블랙 애로 일부 hCD31 - 긍정적인 루멘 겨누고)를 표시.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이것은 생체 공학 인간의 혈관 네트워크의 실험 모델입니다. 이 모델의 주요 특징은 다음과 같습니다 1) microvessels는 이후 나탈 조직 (즉, 혈액 및 골수)에서 분리된 인간의 세포에서 형성되며 2) microvessels가 성인 동물로 형성하며, 3) microvessels 사전에서 발생하지 - 기존의 적당한 젤에 정지 단일 세포에서 드 노보 (호스트) 혈관 대신 그들은 형성,. murine vasculature에 연결 적혈구 세포 가득한 선박이 분석에서 읽을 아웃 기능 중 하나를 달성하는 데 필요한 때문에 Angiogenesis이 분석에서 중요한 역할을합니다. 또한, 호스트 골수양 세포는 초기 게시물 이식에서 이식을 모집하고, 그들은 새로운 혈관 침대 12의 형성에 필요한 있습니다. 이 실험 모델은 생체내 인간의 혈관 네트워크의 사후 나탈 형성을 연구하는 다용도, 같지는하고, 비교적 간단한 모델 시스템을 제공합니다. 또한이 분석은 수행하는 간단하고 그것은 절개하거나 수술을 필요로하지 않습니다. 모델은 인간의 내피와 혈관 주위 세포의 서로 다른 소스의 vasculogenic 가능성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 모델은 방지 및 / 또는 프로 vasculogenic 화합물에 대한 화면으로 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 모델은 인간의 내피로 구성된 혈관 네트워크의 형성과 기능에서 특정 유전자의 역할 (들)을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 내피 기초 중간, EBM - 2 </td><td> Lonza </td><td> CC - 3156 </td><td></td></tr><tr><td> EGM - 2 SingleQuot 보조 </td><td> Lonza </td><td> CC - 3162 </td><td></td></tr><tr><td> 글루타민 - 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션, 100x GPS </td><td> Mediatech, 주식 회사 </td><td> 30-009 - CI </td><td></td></tr><tr><td> Mesenchymal 줄기 세포 성장 매체 BulletKit, MSCBM / MSCGM </td><td> Lonza </td><td> PT - 3001 </td><td></td></tr><tr><td> 높은 포도당 Dulbecco의 수정된 이글 매체, 1X DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> 멤 비 필수 아미노산 솔루션 100x NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 높은 포도당 Dulbecco의 수정된 이글, 가루 DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 버퍼 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex 보빈의 콜라겐 I 솔루션 </td><td> Trevigen </td><td> 3442-050-01 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex 인간 Fibronectin </td><td> Trevigen </td><td> 3420-001-01 </td><td></td></tr><tr><td> 보빈 플라즈마에서 피브리노겐 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> F8630 - 1G </td><td></td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 어부 </td><td> DF0143 - 17-9 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 인산염은 호수, PBS를 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션, 1X </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> 흡입에 대한 Isoflurane, 액체 </td><td> Buxter 헬스케어 주식 회사 </td><td> NDC 10019-360-40 </td><td></td></tr><tr><td> 보빈 플라즈마에서 트롬빈 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T4648 - 1KU </td><td></td></tr><tr><td> 포르말린 솔루션, 중립은 버퍼 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> 단클론 마우스 안티 - 인간 CD31 항체 </td><td> DakoCytomation </td><td> M0823 </td><td> 클론 JC70A </td></tr></tbody></table>

immunodeficient 마우스의 생체 공학 인간 microvascular 네트워크

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

조직 공학 및 조직 재생을위한 세포 기반 치료법​​의 미래는 가능성이 생체내 혈관의 기능적 네트워크를 생성하는 능력에 의존합니다. 이 점에서, 생체내의 혈관 네트워크를 구축하기 위해 실험 모델에 대한 검색 가장 중요 하나입니다. 생체내에서 생체 공학의 microvascular 네트워크의 가능성은 최초의 인간 조직 파생 성숙 내피 세포 (내장 컴퓨터 시스템) 2-4 사용하여 표시되었다; 광범위한 임상 사용을위한 그러나, autologous 내피 세포는 현재의 문제가, 그들은 충분한 수량의 취득 및 요구하기가 어렵습니다 때문에 기존 vasculature에서 수확. 이러한 제한은 내장 컴퓨터 시스템의 다른 자원에 대한 검색 왔습니다 있습니다. 혈액의 내피 식민지 - 형성 세포 (ECFCs)의 신분이 아닌 invasively 얻을 수있는 기회를 제공하는 것은 5-7 항법. 우리와 다른 저자는 성인과 코드 혈액 파생 ECFCs은 생체내 7-11의 기능 혈관 네트워크를 형성하는 능력을 가지고 것으로 나타났습니다. 중요한 것은 이러한 연구는 또한 안정적이고 내구성이 혈관 네트워크를 얻는 것으로 나타났습니다, ECFCs는 혈관 주위 세포와 공동 주입을 필요로합니다. 우리가 여기서 설명하는 분석이 개념을 보여줍니다 : 우리는 기능적인 인간을 형성하는 콜라겐 / fibronectin / 피브리노겐 젤의 단일 세포 현탁액으로 골수 파생 mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)와 함께 할 수있는 방법을 인간이 코드 혈액 파생 ECFCs보기 immunodeficient 마우스에 주입 후 7 일 이내에 혈관 네트워크. 호스트 적혈구를 포함하는 인간 ECFC 늘어선 루멘의 존재는뿐만 아니라 혈관 네트워크의 형성 (드 노보)뿐만 아니라 호스트 순환 시스템 기능 anastomoses의 발전을 나타내는 이식을 통해 볼 수 있습니다. 새로 개발 했나 인간의 혈관 네트워크의 murine 모델은 이상적으로 인간의 혈관 네트워크 형성 세포와 분자 메커니즘에 대한 연구 및 엔지니어링 조직을 vascularize 전략의 개발에 적합합니다.

여기서 우리는 인간의 코드 혈액 유래 내피 식민지 - 형성 세포 (ECFCs) 및 골수 - 유래 subcutaneously immunodeficient 마우스로 콜라겐 / fibronectin 겔에 포함된 mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)를,.을 제공하는 방법을 설명 이 셀 / 젤 조합은 마우스 vasculature와 연결하는 인간의 혈관 네트워크를 생성합니다.

Immunodeficient 마우스의 생체 공학 인간 Microvascular 네트워크

조직 재생을 위한 조직 공학 및 세포 기반 치료의 미래는 기능적인 혈관 네트워크를 생성하는 능력에 달려 있을 가능성이 높습니다...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 체내(in vivo) 인간 혈관 네트워크를 생성하는 것입니다. 이를 위해 먼저 인간 혈액 유래 혈관 내피 전구세포(endothelial colony forming cells)와 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)를 배양합니다. 그 후 두 세포 유형을 콜라겐 기반 젤에 혼합하여 면역 결핍 마우스의 피하에 주입합니다.7일 후, 임플란트를 회수하여 인간 혈관 네트워크의 형성 여부를 평가합니다. 최종적으로, 임플란트 내부의 인간 특이적 미세혈관의 존재는 조직학 및 면역조직화학 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 구성물을 외과적으로 이식하는 것과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 간단하고 수행하기 쉬우며, 수술이 필요하지 않다는 점입니다.E CFCs 바이알 하나를 해동한 후, 즉시 10 mL의 DMEM이 들어 있는 15 mL 원뿔형 튜브에 세포를 희석합니다. 세포 현탁액을 1200 RPM에서 5분 동안 원심 분리하고, 세포 펠릿을 10 mL의 가온된 EGM two 배지에 다시 현탁합니다. 그다음, 1% 젤라틴이 코팅된 100 mm 조직 배양 플레이트에 세포를 옮기고 가습 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 아침, 배지와 결합되지 않은 세포를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 결합된 세포에 10 milliliters의 신선한 E GM two 배지를 공급합니다. 세포가 합류 단층(confluent monolayer)을 형성할 때까지 향후 며칠 동안 이 과정을 반복합니다.그다음 10 mL의 PBS로 세포를 세척합니다. PBS를 2 mL의 tripsin EDTA로 교체하고 플레이트를 인큐베이터에 넣어 5분 동안 둡니다. 5분 후 현미경으로 관찰하면서 플레이트를 가볍게 두드려 세포가 떨어졌는지 확인합니다.그렇지 않은 경우, 부드럽게 흔들어주며 짧은 배양 과정을 반복합니다. 세포가 완전히 떨어져 나오면, 세포에 EGM two 배지 8 mL를 추가하고 15 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포 수를 측정하고 1200 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.이제 1% gelatin이 코팅된 조직 배양 플레이트에 cm²당 5,000 cells의 밀도로 세포를 분주합니다. EGM two medium에서 세포를 배양하며, 2~3일마다 EGM two medium으로 배지를 교체해 줍니다. 4대에서 8대 사이의 후속 계대 배양에서도 이 절차를 반복합니다.E CFCs를 사용할 준비가 완료됩니다. 이 프로토콜은 MSC를 배양하는 데에도 사용할 수 있습니다. E GM two 배지를 M-S-C-G-M 배지로 교체하기만 하면 됩니다.코팅되지 않은 배양 플레이트를 사용하십시오. 세포 밀도가 80%에 도달했을 때 계대 배양을 시작하며, cm²당 10,000 cells의 파종 밀도로 계대 배양하십시오. 본 실험에는 임플란트당 800,000 E CFCs와 1,200,000 MSCs가 필요합니다.일반적으로 5개의 임플란트를 동시에 준비합니다. 먼저 배양 플레이트에서 세포 배지를 흡입하여 제거하고, 각 세포 플레이트를 10 milliliters의 PBS로 세척합니다. PBS를 2 milliliters의 trypsin EDTA로 교체하고 플레이트를 부드럽게 흔들어주며 배양합니다.모든 세포가 떨어져 나갈 때까지 2~5분마다 현미경으로 세포를 확인하십시오. 그런 다음 DMEM 8 mL를 첨가하고 세포 용액을 수집하십시오. 15 mL 원추형 튜브에서 세포 수를 측정하고, 임플란트 5개 분량에 해당하는 세포를 별도의 15 mL 원추형 튜브로 옮기십시오.그런 다음 세포를 1200 RPM에서 5분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 피브리노겐과 콜라겐 피브로넥틴 혼합물을 얼음 위에서 조심스럽게 준비합니다. 그다음 얼음처럼 차가운 혼합물에 세포 펠릿을 매우 부드럽게 재현탁합니다.기포가 생기지 않도록 주의하며 세포 현탁액을 1 mL 주사기에 충전하고 캡이 씌워진 26 gauge 바늘을 장착합니다. 세포 혼합물을 주입할 때까지 충전된 주사기를 얼음 위에 보관합니다. ISO 불소 챔버를 사용하여 6주령의 무흉선 누드 면역결핍 마우스 4마리를 마취시켰습니다.마우스가 마취되어 발가락 집기 자극에 반응이 없으면, 각 마우스에 대해 주입을 진행합니다. 30G 바늘을 사용하여 트롬빈 용액 50 µL를 상단 배부 영역에 피하 주사합니다. 동일한 위치에 세포 혼합물 200 µL를 주입합니다.26 gauge 바늘을 사용하여 거대분자를 주입하면 젤화되어 피부 아래에 작지만 뚜렷한 혹이 형성됩니다. 주입 후에는 쥐가 편안함과 온기를 느낄 수 있도록 거즈 층 위에 놓아주십시오. 쥐가 다시 움직일 수 있을 때까지 관찰하십시오.향후 3일 동안 동물의 전반적인 건강 상태를 매일 관찰하십시오. 주입 1주일 후, 이산화탄소로 마우스를 안락사시키고 수술적으로 젤 플러그를 제거합니다. 회수한 젤 플러그를 자와 함께 촬영한 다음, 각 젤 플러그를 조직학적 카세트에 넣고 10% neutral buffered formalin에 담가 실온에서 하룻밤 동안 보관하십시오.다음 날, 10% 중성 완충 포르말린을 증류수로 세척하여 제거합니다. 조직학적 평가 전까지 카세트를 4°C의 PBS에 보관하십시오. 파라핀에 매립된 임플란트를 7 µm 두께로 절편합니다.그런 다음 이식물의 중앙 부위에서 미세혈관의 밀도를 정량화합니다. H&amp;E 염색을 통해 제곱밀리미터당 혈관 수를 측정하여 미세혈관의 인간 유래 특성을 입증합니다. 절편을 시판되는 anti-human CD 31 항체를 1:100로 희석하여 염색합니다.이 위상차 현미경 이미지는 제대혈 유래 eCFC의 전형적인 합류 단층(confluent monolayer)에서 나타나는 내피세포 특유의 자갈 모양(cobblestone) 형태를 보여줍니다. 이 이미지는 인간 골수 유래 MSC의 전형적인 방추형 형태를 보여줍니다. 마우스 숙주 내에서 일주일 동안 배양한 후, 노란색 점선으로 표시된 이식편은 고배율에서 숙주의 조직과 매우 다른 모습이었습니다.적혈구를 포함하는 내강 구조가 확인된 여러 개의 미세혈관들이 노란색 화살표로 표시되어 있습니다. 플러그를 면역조직화학적으로 검사했을 때, 미세혈관의 내강은 인간 CD 31에 대한 단클론 항체에 반응하였습니다. 세포핵은 헤마틴으로 대조 염색되었습니다.숙달되면, 적절하게 수행했을 때 이 기술을 1온스 이내로 완료할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 호중구 반응이 억제된 면역 결핍 마우스에 인간 피부를 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 인간의 분할 두께 피부를 마우스의 이식 침대에 적용하고 밀봉한 다음 복구를 위해 덮는 것입니다. 결국 인간의 피부가 쥐의 피부에 달라붙어 혈관 형성과 순환을 확립하여 성공적인 피부 이종 이식을 가능하게 합니다.

마우스 모델에서 인간 피부 이식을 위한 기술

우리는 우리의 마우스 이식 arteriosclerois (GA) 같은 근친 교배 균주의받는 사람에 마우스 선박 세그먼트의 개재를 포함 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다. 용기 기증자에 추가 유전자 변화를 교잡에 의해, 모델은 GA에 특정 유전자의 효과를 평가할 수 있습니다.

이식 동맥 경화에 대한 마우스 모델

나이 세리아 수막염은 혈관을 감염시키는 인간의 특정 병원체이다. 이 프로토콜에서 인간의 미세 혈관은 면역 억제 쥐에 인간의 피부를 이식하여 마우스에 도입된다. 박테리아는 일반적으로 인간의 경우에 관찰 부르르 발진, 혈관 손상과 발전에 선도적 인, 인간의 혈관에 광범위하게 준수합니다.

인간 답게 된 마우스 모델은 미세 혈관을 대상으로 세균 감염을 연구하는

혈관은 성공적인 조직 공학의 접근 방법의 핵심입니다. 따라서, 신뢰성있는 기술은 조직 구조에서의 혈관 망의 발달을 평가하기 위해 필요하다. 여기서 우리는 시각화 및 생체 내에서 혈관 생성을 정량화하기 위해 간단하고 비용 효율적인 방법을 제시한다.

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기<em&gt; 생체</em

이 프로토콜은 HIV 감염에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 된 골수/간/흉선 마우스 모델을 구성하는 방법을 설명합니다.

인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

우리는 유망한 혈관 단위를 대표하는 지방 조직 유래 미세 혈관 조각을 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이들은 신속 분리 될 수 있으며, 따라서, 조직 공학 분야의 다른 한 단계 prevascularization 위해 사용될 수 있고, 체외 처리에 필요로하지 않는다.

조직 공학 혈관 신생 단위로 쥐 지방 조직 유래 미세 혈관 조각의 분리

생쥐에서 다른 인간화 된 골수 틈새를 만들고 살아있는 방법이 제시됩니다. human mesenchymal cells에 의해 만들어지는지지 적 틈새를 기반으로, 인간 내피 세포의 첨가는 인간 혈관의 형성을 유도하는 반면, rhBMP-2의 첨가는 인간 - 마우스 키메라 성숙한 뼈 조직의 형성을 유도한다.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

여기에 기술된 것은 인간화된 마우스에 있는 HIV 감염의 역학을 공부하기 위한 3개의 실험적인 접근입니다. 첫 번째는 만성 감염 사건의 연구를 허용하는 반면, 두 후자는 1 차감염 또는 바이러스 재활성화 후 급성 사건의 연구를 허용합니다.

인간화 면역 결핍 마우스 모델에서 만성, 급성 및 재활성화 HIV 감염

대퇴골 내 주사는 세포를 골수강에 직접 배치하여 소수의 조혈모세포 및 전구세포(HSPC)를 생착할 수 있습니다. 여기에서는 면역 결핍 마우스에 인간 HSPC를 대퇴골 내 주사하는 실험 프로토콜에 대해 설명합니다.

면역저하 마우스에 인간 조혈모세포와 전구세포의 대퇴골내 주입 

우리는 이종 소성 후다리에서 목으로의 혈관 형성 종합 동체이식 마우스 모델을 제시합니다. 이 초미세수술 프로토콜은 0.3-0.5mm 혈관 문합을 포함하며, 나일론 필라멘트 유도와 정맥 커핑을 통합합니다. 이 연구는 관성 합성 동체 이식에서 내성, 허혈-재관류 손상, 면역학적 기전에 관한 번역 연구를 위한 신뢰할 수 있는 기반을 제공합니다.

쥐에서의 이소성 하지에서 목으로의 이식: 혈관 복합 동체이식의 초미세수술 모델

배우세요 면역결핍 마우스에서 콜라겐/피브로넥틴 겔에 포함된 ECFC와 MSC를 주입하여 생체 내 인간 혈관 네트워크를 생성하는 방법을. 이 기술은 혈관 재생 의학 연구에 활용됩니다.

Immunodeficient 마우스의 생체 공학 인간 Microvascular 네트워크

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