인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

이 절차의 전반적인 목표는 키메라 항원 수용체로 변형된 인간화 마우스를 만드는 것입니다. 이 방법은 HIV 감염 및 기타 만성 감염 및 악성 종양에 대한 줄기세포 기반 공학 면역의 효능 테스트와 관련하여 HIV 및 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 면역 부전의 메커니즘, 면역 체계를 강화하고 더 나은 항바이러스 또는 항 종양 면역을 생성하는 치료법을 개발하는 방법과 같은.

이 기술의 가장 큰 장점은 많은 양의 실험적 조작이 가능하다는 것입니다. 인간화 BLT 마우스 모델은 인간의 면역을 모방하며, 이 경우 HIV 감염에 대한 세포 기반 유전자 요법에 대한 전임상 테스트를 가능하게 합니다. 시연을 맡은 사람은 발레리 레젝(Valerie Rezek)과 브리아나 램(Brianna Lam)으로, 제 연구실의 기술자들입니다.

먼저 메스를 사용하여 흉선을 RPMI 배지가 보충된 접시에 약 1mm 큐브로 자릅니다. 그런 다음 구부러진 뭉툭한 집게를 사용하여 각 단일 흉선 조각을 96웰 플레이트의 단일 웰에 배치했습니다. 조직이 건조되지 않도록 모든 웰에 100-200마이크로리터의 매체를 추가합니다.

현미경으로 조직을 시각화하여 흉선이 아니거나 결합 조직이 부착된 조직을 제거합니다. 다음으로, 확인된 흉선 조각을 제거하고 T25 세포 배양 플라스크에 결합합니다. 항생제가 첨가된 RPMI 배지 7ml를 플라스크에 넣고 부드럽게 흔들어 섞습니다.

그런 다음 플라스크를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 이 단계는 조직의 박테리아 오염을 방지합니다. 두 개의 메스를 사용하여 간을 IMDM이 들어 있는 접시에 깍둑썰기한 약 3mm의 작은 조각으로 잘라 태아 간에서 CD34 양성 HSC를 분리하기 시작합니다.

흰색 결합 조직을 제거하고 버리십시오. 그런 다음 16게이지 뭉툭한 바늘이 장착된 10ml 주사기를 사용하여 간 조각과 매체를 꺼내 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 조직을 완전히 균질화하기 위해 5-7회 더 부드럽게 흡수하고 배출합니다.

10ml의 IMDM 배지를 준비한 후 콜라겐 분해 효소, 히알루로니다아제, 항생제, DNA 및 항진균제를 보충합니다. 0.22미크론 필터를 통해 미디어를 통과시킵니다. 그런 다음 여과된 배지를 간 현탁액에 추가합니다.

간 현탁액이 들어 있는 50ml 원추형 튜브를 캡핑한 후 파라필름과 같은 자체 밀봉 필름으로 단단히 밀봉하여 누출을 방지합니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 튜브 로테이터를 90분 동안 회전시킵니다. 배양 후 100미크론 세포 여과기를 통해 분해된 세포 현탁액을 새 50ml 튜브로 여과합니다.

현탁액에 PBS를 추가하면 총 부피를 최대 50ml까지 높일 수 있습니다. 이것을 각각 25ml의 세포 현탁액을 포함하는 두 개의 50ml 튜브로 나눕니다. 각 튜브의 세포를 Ficoll과 같은 10ml의 밀도 원심분리 매체로 천천히 그리고 부드럽게 밑에 놓습니다.

쉬지 않고 1200 회 g으로 20 회 돌립니다. 원심분리 후 각 튜브에서 계면을 조심스럽게 제거하고 두 개의 별도 50ml 튜브로 옮깁니다. PBS를 사용하여 인터페이스의 각 튜브의 부피를 최대 50ml까지 가져옵니다.

그런 다음 300배 g에서 7-10분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 2% FBS가 함유된 PBS 50밀리리터와 3회 결합하고 세척하되 매번 7-10분 동안 300회 g으로 회전합니다. 최종 회전 후 펠릿을 50ml의 RPMI 매체와 10% FBS에 다시 현탁시킵니다.

혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 다음으로, 제조업체의 프로토콜에 따라 CD34 분류 키트를 사용하여 CD34 양성 세포를 즉시 분류하고 CD34 양성 및 CD34 음성 분획을 모두 저장합니다. 플라스크의 흉선 조각과 배지를 60mm 접시에 붓습니다.

일부 용적식 피펫 팁을 얼음 위의 열린 1.5ml 멸균 스크류 캡 튜브에 넣어 냉각시킵니다. 또한 세포 펠릿과 마트리겔(matrigel)과 같은 젤라틴 단백질 혼합물을 얼음 위에 놓습니다. 승인된 동물 프로토콜에 따라 주사 가능한 마취제로 수용 마우스를 마취합니다.

발을 쥐어 마우스의 마취 수준을 확인하십시오. 핀치에 대한 반응이 없다는 것은 수술 면의 마취를 나타냅니다. 각 마우스의 왼쪽을 엉덩이에서 어깨까지 등 중앙과 배 사이를 면도합니다.

희석된 카프로펜(Carprofen) 1kg당 6mg을 동물의 어깨 또는 서혜부 삼각형에 피하주사합니다. 60mm 접시에 PBS로 투관침의 캐뉼라를 세척하십시오. 한 쌍의 뭉툭한 곡선 집게를 사용하여 60mm 접시의 흉선 조각을 캐뉼라 입구 바로 안쪽에 놓은 다음 투관침을 뒤로 당겨 조직을 캐뉼라로 흡인합니다.

다음으로, 간접 치환 피펫과 냉각된 팁을 사용하여 5마이크로리터의 차가운 젤라틴 단백질 혼합물을 세포 펠릿이 있는 튜브에 추가합니다. 그리고 세포 현탁액을 생성하기 위해 부드럽게 저어줍니다. 세포 현탁액을 캐뉼라 개구부에 피펫팅하고 투관침을 천천히 뒤로 당겨 바늘을 로드합니다.

마우스의 면도한 부위에 포비돈 요오드로 면봉을 채취한 다음 이소프로페닐을 세 번 면봉으로 닦습니다. 비장의 위치를 나타내는 피부 아래의 가장 어두운 부분을 확인합니다. 신장은 비장에서 등쪽 길이가 약 5mm

발 꼬집음의 반응이 없어 적절한 수준의 마취를 확인한 후 구부러진 집게를 사용하여 피부를 들어 올리고 수술 용 가위를 사용하여 비장과 평행하게 피부를 15mm 절개합니다. 그런 다음 아래의 복막층을 비슷하게 자릅니다. 수컷의 경우 신장이 쉽게 보이기 때문에 복부를 누르기만 하면 돌출됩니다.

지혈제 또는 구부러진 뭉툭한 집게로 신장을 지지하십시오. 여성의 경우 난소가 신장을 쉽게 추출하지 못하도록 막는 경향이 있습니다. 지혈제를 사용하여 난소를 집어 올리고 조심스럽게 신장을 노출시킵니다.

바늘 끝이 있는 집게를 사용하여 신장 캡슐의 뒤쪽 끝에 있는 작은 구멍을 뽑습니다. 캐뉼라의 입구가 신장 캡슐로 완전히 덮일 때까지 투관침을 이 구멍과 신장을 따라 밀어 넣습니다. 신장 캡슐 아래의 조직을 부드럽게 밀어내고 투관침을 다시 당겨 빼냅니다.

구부러진 집게를 사용하여 흉선 조각이 바늘과 함께 다시 나오지 않도록 합니다. 그런 다음 겸자로 복막을 들어 올리고 지혈을 부드럽게 사용하여 신장을 제자리로 밀어 넣습니다. 복막에 외과용 봉합사가 있는 이중 매듭 스티치 하나를 묶습니다.

또한 두 개의 Autoclips Wound 클립을 배치하여 피부를 닫습니다. 이제 형질도입된 CD34 양성 세포를 혼합하고 100마이크로리터 부피의 6개 세포에 0.5배10을 흡인하여 인슐린 주사기에 넣습니다. 후방(retro) 안와정맥 주입을 통해 이 세포를 마우스에 주입합니다.

주사 후 각 눈에 작은 눈 윤활제 한 방울을 면봉으로 바르고 마우스를 케이지에 옆으로 눕힙니다. 모든 쥐를 이식한 후 동물이 성실성을 되찾고 보행 중인지 확인한 후 수용실로 돌려보냅니다. 수술 후 10주 후에 생쥐를 제물로 바치고 혈액, 비장, 흉선 및 골수를 적출했습니다.

생성된 세포를 항인간 CD45 및 항인간 CD4 항체로 염색하고 유세포 분석으로 분석했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, CD4 키메라 항원 수용체 변형 세포는 유세포 분석을 통해 여러 림프 조직에서 검출할 수 있습니다. CD4 키메라 항원 수용체 변형 세포는 여러 계통으로 분화할 수 있습니다.

여기서, CD4 키메라 항원 수용체 변형 마우스의 비장세포를 수확하고 T 및 B 세포의 마커를 위해 염색했습니다. T 세포 및 B 세포 마커에 대해 음성인 세포는 단핵구와 대식세포의 마커 및 자연 살해 세포에 대해 양성이었습니다. HIV에 감염된 CD4 키메라 항원 수용체 마우스의 비장세포를 HIV 감염 또는 감염되지 않은 T one 세포로 자극하고 이들의 세포 내 사이토카인 생산을 보여주었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 키메라 항원 수용체로 변형된 인간화 BLT 마우스를 구성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 48시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 꾸준한 속도로 작업하고 작동 중인 마우스의 상태에 세심한 주의를 기울이는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

초보자는 더 귀중한 조직이나 줄기 세포를 다루기 전에 수술이나 안구 주사 연습을 하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 HIV 및 기타 전염병 분야의 연구자들이 인간화 마우스 모델에서 질병 발병 기전 및 면역 기반 요법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.