마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

이 방법의 전반적인 목표는 마우스에 인간 세포 운반체 스캐폴드를 이식하여 인간화된 골수 니치(niche)를 생성하고, 이식물 내 인간 세포의 거동을 실시간 영상화하는 것입니다. 이 방법은 골수의 다양한 구성 요소를 재현하고 단일 세포 해상도로 실시간 영상화할 수 있게 하므로, 인간 조혈 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 이 시스템의 주요 장점 중 하나는 범용성으로, 다양한 니치 구성 요소를 개별적으로 또는 조합하여 이식할 수 있다는 점입니다.

본 방법론은 종양 전이 또는 약물 스크리닝 연구와 같은 다른 연구 분야에도 잠재적으로 적용될 수 있습니다. 적절한 멸균 기술을 사용하여, 먼저 멸균된 젤라틴 스펀지를 비슷한 크기의 24개 조각으로 자릅니다. 에탄올에 담근 후 PBS에 담가 젤라틴 스캐폴드를 재구성하십시오.

그런 다음 각 스캐폴드를 멸균 티슈로 가볍게 두드려 과잉 액체를 제거하고, 스캐폴드를 초저부착 24-웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 인슐린 주사기를 사용하여 50 µL의 배양액에 현탁된 1×10⁵ ~ 1×10⁶개의 기질 세포를 각 스캐폴드에 조심스럽게 주입한 후, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 세포를 스캐폴드에 주입할 때, 스캐폴드 밖으로 액체가 새어 나오지 않도록 주의하십시오.

1시간 후, 각 웰에 3 mL의 신선한 세포 배양 배지를 채우고 스캐폴드를 인큐베이터로 옮깁니다. 24시간 후, 1 x 10⁵개의 조혈 세포를 스캐폴드에 주입하고, 이어서 배양 및 추가 배지 첨가 후 앞서 설명한 것과 같이 24시간 동안 배양합니다. 재조합 인간 뼈 형성 단백질 2(rhBMP-2) 담체 스캐폴드를 제작하려면, 재구성된 스캐폴드를 U-bottom 96-웰 플레이트의 개별 웰에 넣고 각 스캐폴드에 5 µL의 재조합 인간 뼈 형성 단백질 2를 첨가합니다.

그 다음 스캐폴드를 20 µL의 thrombin과 20 µL의 fibrinogen으로 덮습니다. 바이오 공학적으로 제작된 스캐폴드를 외과적으로 이식하기 위해, 먼저 실험용 마우스의 등 부위 수술 영역의 털을 깎고, 희석된 chlorhexidine에 적신 면봉을 사용하여 노출된 피부 표면을 각 방향으로 세 번씩 닦아냅니다. 다음으로, 멸균 핀셋과 메스를 사용하여 피부에 0.5~0.7 cm 길이로 전후방 절개를 가하고, 피하 조직 아래로 핀셋을 삽입하여 포켓을 만듭니다.

스캐폴드를 포켓 깊숙이 삽입하고, 절개 부위를 외과용 접착제로 닫습니다. 적출 전까지 이식된 스캐폴드가 8~24주 동안 성장하도록 합니다. 형광 물질을 정맥 투여하고 동물을 안락사시킨 후, 앞서 시연한 것과 같이 피부를 소독하고 원래의 이식 부위 근처인 동물의 등 쪽에 세로로 피부 절개를 실시합니다.

스캐폴드가 이식된 피하 포켓에서 피부를 조심스럽게 분리한 후, 핀셋을 사용하여 스캐폴드를 부드럽게 잡고 스캐폴드 주변의 잔여 막과 조직을 조심스럽게 절개하여 구조물을 회수합니다. 속건성 접착제를 사용하여 스캐폴드를 35 by 10 milliliter 페트리 접시에 고정합니다. 골형성단백질 2(bone morphogenetic protein two) 스캐폴드의 경우, 플레이트에 PBS를 채우기 전, 미세수술 현미경 하에서 수술용 마이크로 드릴을 사용하여 뼈 표면을 얇게 깎아내어 형광 물질을 시각화하고 고해상도 이미지를 캡처할 수 있도록 합니다.

스캐폴드마다 뼈의 두께가 일반적으로 다르므로 표면이 파손되지 않도록 드릴링 과정에서 각별히 주의하십시오. 디쉬를 상온의 PBS로 채웁니다. 생체 공학적 스캐폴드의 2-광자 현미경 이미징을 위해, 스캐폴드를 공초점 현미경 스테이지 위에 놓고 20배 1.0 NA 수침 렌즈를 선택하십시오.

그런 다음, 이미징 소프트웨어의 획득 모드(acquisition mode)에서 '수동 도구 표시(show manual tools)' 확인란을 선택합니다. 레이저 메뉴에서 2-광자 레이저를 켜고, 레이저가 예열되어 안정화될 때까지 기다립니다. 레이저가 준비되면 이미징 설정 메뉴에서 채널 모드를 활성화하고 '매 프레임마다 트랙 전환(switch track every frame)'을 선택합니다.

광로 메뉴에서 non descanned와 메인 빔 스플리터 MBS 760 plus를 선택하십시오. 4개의 non descanned 검출기를 활성화하고 도식에 표시된 대로 구성을 설정하십시오. 채널 메뉴에서 레이저 파장을 890 nanometers로, 출력은 50%로 설정하십시오. 각 채널의 gain master는 500에서 600으로, digital offset은 0으로, digital gain은 15로 설정하십시오.

획득 모드에서, 조직을 손상시키거나 형광 색소를 표백하지 않으면서 고해상도 이미지를 얻기 위해 적절한 파라미터를 설정하십시오. 그런 다음 이미지의 초기 스캔을 위해 줌을 1로 설정하십시오. 모든 파라미터 설정이 완료되면, 렌즈가 식염수에 닿을 때까지 내리고 램프를 광원으로 사용하여 렌즈 초점을 수동으로 설정하십시오.

이제 Z-stack 메뉴를 활성화하고, 첫 번째 last 기능을 선택하십시오. 두 연속 슬라이스 사이의 필요한 간격을 설정하고, live를 선택하여 샘플의 라이브 스캔 이미지를 획득하며, 최적의 노출을 위해 필요에 따라 디지털 게인(digital gain)과 디지털 오프셋(digital offset)을 조정하십시오. 여러 채널을 동시에 시각화하려면 split 기능을 선택하십시오.

라이브 모드에서 스테이지 메뉴를 통해 이미지를 스캔하고 골강의 위치와 같은 관심 영역을 표시합니다. 샘플 스캔이 완료되면 첫 번째 관심 영역으로 이동하여, 라이브 모드의 'set first' 및 'set last' 기능을 사용하여 관심 영역 주변의 3D Z-스택 상단과 하단을 설정합니다. 그런 다음 중심 C를 설정하고, 'start experiment' 버튼을 클릭하여 해당 관심 영역의 Z-스택 이미지 획득을 시작합니다.

영상 획득이 완료되면 이미지를 지정된 폴더에 저장하고, 다음 관심 영역을 스캔합니다. 이 대표 이미지들에서, 이식 8주 후 면역결핍 NSG 마우스에서 회수한 서로 다른 스캐폴드의 육안적 형태를 관찰할 수 있습니다. 인간 혈관 내피 세포를 함께 파종하면 스캐폴드의 혈관 형성이 증가하며, 재조합 인간 골형성 단백질 2를 추가하면 골 형성이 유도됩니다.

실시간 2-광자 현미경으로 촬영한 이 지지체들은 지지체 내 혈관의 존재와 지지체 실질 내 인간 조혈 세포의 장기 생착을 보여줍니다. 인간 혈관 내피 세포와 중간엽 기질 세포를 파종한 지지체는 지지체 내 혈관 형성에 인간 혈관 내피 세포가 참여함을 보여주며, 그 결과 생쥐-인간 키메라 혈관 구조가 형성됩니다. 골 조직의 형성은 2-광자 현미경으로 시각화할 수 있으며, 골내막 조직 내 인간화된 혈관의 공동 형성 또한 확인할 수 있는데, 이는 골수 골내막 조직과 매우 유사합니다.

또한, 재조합 인간 골형성단백질 2(bone morphogenetic protein two) 운반체 스캐폴드 내 조직의 형태는 지방 조직을 포함한 성숙한 골수로 나타나며, 이는 인간 중간엽 기질 세포가 지방 조직 형성에도 기여함을 시사합니다. 이 영상을 시청한 후에는 모든 바이오엔지니어링 및 주요 마우스 스캐폴드에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 항상 무균 환경을 유지하고, 스캐폴드를 다룰 때 각별히 주의하시기 바랍니다.

조직의 인간-마우스 키메라와 같이 이 방법과 관련된 제한 사항을 유념하십시오. 이미징 후에는 스캐폴드를 분해할 수 있으므로, 거기서 살아있는 세포를 회수하여 추가 연구에 샘플을 사용할 수 있다는 점을 기억하십시오.