인간의 정밀 절단 폐 절편에서 화학적으로 유도된 세포 독성을 측정하기 위한 분석

천연 폐 미세 구조를 유지하는 인간의 정밀 절단 폐 슬라이스가 포함된 멀티웰 플레이트를 가져 가십시오.

미디어를 제거합니다. 증가하는 시험제 농도를 웰에 추가하고 배양합니다.

세포독성 가능성에 따라 시험제는 세포막을 파괴하여 세포 사멸을 유도하고 슬라이스 내의 생존 세포를 감소시킵니다.

배양 후 배지를 제거합니다. 수용성 테트라졸륨염(WST-1)과 전자 결합 시약이 포함된 배지에 슬라이스를 담그십시오.

인큐베이트. 대사 활성 세포에서 원형질막 전자 전달 시스템은 세포내 NADH에서 세포외 전자 결합 시약으로 전자를 전달하여 세포 불투과성 염료 WST-1을 안정적인 짙은 노란색의 수용성 포르마잔으로 환원시킵니다.

배양 후 플레이트를 흔들어 포르마잔을 고르게 분포시키고 멀티웰 플레이트로 옮깁니다.

마이크로플레이트 리더를 사용하여 조직 생존력을 나타내는 포르마잔의 흡광도를 측정합니다.

시험제 농도에 따라 포르마잔 흡광도의 감소는 폐 절편 생존율 감소를 나타내며 시험제의 세포독성을 확인합니다.

작업 용액의 마스터 믹스를 준비하려면 각 웰에 대해 WST-1 시약 25마이크로리터와 배지 225마이크로리터를 희석합니다. 다음으로, 각 웰에 대해 WST-1의 마스터 믹스 작업 용액 250마이크로리터를 피펫팅하고 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 PCLS가 WST-1 시약에 의해 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.

그런 다음 플레이트를 200rpm의 궤도 셰이커에 놓고 WST-1 시약이 완전히 혼합되도록 30초 동안 조심스럽게 흔듭니다. 그런 다음 24웰 플레이트의 각 웰에서 100마이크로리터의 상층액을 새로운 평평한 바닥 96웰 플레이트에 이중으로 피펫팅합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450나노미터에서 각 웰의 흡수를 측정하고 450나노미터에서 630나노미터 기준의 흡수를 뺍니다.