곤충 번데기의 염증 세포 역학을 탐구하기 위한 광변환 기술

녹색 형광을

나타내는 세포 표면 단백질과 함께 표지된 상처 상피를 운반하는 형질전환 초파리 번데기가 포함된 유리 바닥 접시로 시작합니다.

번데기의 면역 세포 또는 혈구는 세포질에서 광전환 가능한 녹색 형광단을 발현하고 핵에서 적색 형광 단백질을 발현하여 세포 추적을 용이하게 합니다.

상처 입은 세포는 화학유인제 또는 염증 분자를 방출하여 혈구를 상처 부위로 끌어당깁니다.

공초점 현미경 검사는 녹색 상피 세포로 둘러싸인 상처 부위를 드러냅니다.

치유되는 동안 상처 근처에 붉은 핵이 있는 녹색 혈구는 막 돌출부인 사상체족부와 라멜리족부를 확장하여 상처 부위를 향해 이동합니다.

시간이 지남에 따라 화학유인제가 확산됨에 따라 멀리 있는 혈구가 상처 쪽으로 이동하여 면역 세포 파동을 생성합니다.

405나노미터 파장으로 이동성 혈구의 하위 집단을 조명합니다. 이것은 혈구의 광전환 형광단을 녹색에서 빨간색으로 돌이킬 수 없게 전환합니다.

이러한 광전환된 혈구는 상처를 입은 상피를 복구하고 상처 부위에서 멀어지면서 광전환된 혈구와 비광전환된 혈구를 구별하고 염증 세포 역학을 밝

힙니다.

동공 날개 가장자리에 상처를 입힌 후 유리 바닥 접시를 적절한 현미경으로 빠르게 옮겨 타임랩스 이미징을 수행합니다. 그런 다음 적절한 이미지 캡처 소프트웨어를 엽니다.

소프트웨어에서 적절한 레이저를 켜고 출력과 이득 오프셋을 조정하여 픽셀 포화 없이 충분한 형광 신호를 얻습니다. 일반적으로 5%에서 20% 범위의 가능한 가장 낮은 레이저 출력이 광표백을 최소화하는 데 가장 적합합니다.

저배율에서 동공 날개 전체에 초점을 맞추거나 고배율에서 상처에 초점을 맞춰 상처 복구를 조사합니다. 복구 상피와 염증 세포 동원을 모두 캡처하려면 먼저 제어판의 미세 초점 조정을 사용하여 z-스택을 기록하도록 현미경을 설정합니다. 손상된 상피에서 이동하는 혈구를 포함하는 아래의 세포외 공간까지 스캔합니다.

다음으로, 동공 날개를 통해 3미크론마다 또는 더 좁은 간격으로 z-슬라이스를 기록하도록 소프트웨어를 설정합니다. 타임랩스 이미징의 경우 최소 1시간 동안 최소 30초마다 z-스택을 기록합니다.

이미징 중에 광변환 프로브를 사용하여 세포의 하위 집합을 선택적으로 광변환하고 라벨링하는 경우 이미징 소프트웨어 내에서 적절한 모듈을 열어 광변환을 수행하고 405나노미터 레이저를 활성화합니다. 그런 다음 선택 도구를 사용하여 FRAP 소프트웨어 내에서 사진 변환할 셀을